非寄主植物萃取物對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)的影響

趙娜娜 王盼盼 馮佳楠

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

列當(dāng)(Orobanche和Phelipanche)是列當(dāng)科列當(dāng)屬的一類全寄生植物，常寄生于植物的根部，形成吸器侵入寄主根內(nèi)，吸取寄主植物體內(nèi)養(yǎng)分和水分，阻礙植物的生長(zhǎng)，使寄主植物的產(chǎn)量下降，尤其是對(duì)葫蘆科、茄科、菊科、傘形科和十字花科植物的生長(zhǎng)影響最大[1]。列當(dāng)種子細(xì)而小，結(jié)實(shí)量驚人，在土壤中最長(zhǎng)可存活10 年。廣泛分布于亞洲西部、地中海地區(qū)以及非洲東部等地區(qū)[2]。在我國(guó)列當(dāng)屬植物大約有23種，主要分布在東北、西北和華北地區(qū)[3]。危害農(nóng)作物的列當(dāng)主要有向日葵列當(dāng)(O.cumana)、小列當(dāng)(O.minor)、瓜列當(dāng)(P.aegyptiaca)和彎管列當(dāng)(O.cernua)等。在新疆維吾爾自治區(qū)，分布最廣泛、危害最為嚴(yán)重的是瓜列當(dāng)(P.aegyptiaca)和向日葵列當(dāng)(O.cumana)[4]。瓜列當(dāng)主要寄生在瓜類和番茄上，尤其以新疆維吾爾自治區(qū)的南疆和東疆地區(qū)發(fā)生最為普遍，寄生率一般在30%～40%，最高可達(dá)100%，嚴(yán)重影響寄主植物的正常生長(zhǎng)，例如，會(huì)導(dǎo)致甜瓜植株萎蔫，降低甜瓜的產(chǎn)量、品質(zhì)和含糖量[5]。1994年，因瓜列當(dāng)寄生，新疆維吾爾自治區(qū)的甜瓜和西瓜產(chǎn)量損失達(dá)20%～70%[6]。

列當(dāng)種子需要在刺激物質(zhì)的作用下才能萌發(fā)，最早被報(bào)道的刺激物質(zhì)獨(dú)腳金醇來(lái)自于雜草獨(dú)腳金的非寄主植物棉花[7]。目前為止，研究發(fā)現(xiàn)共有3類植物次生代謝產(chǎn)物能夠刺激列當(dāng)種子萌發(fā)，包括脫水高粱內(nèi)酯、倍半萜內(nèi)酯和獨(dú)腳金內(nèi)酯[8-10]。列當(dāng)寄主植物可以分泌誘導(dǎo)列當(dāng)種子萌發(fā)的刺激物質(zhì)，部分非寄生植物也能分泌類似的刺激物質(zhì)誘導(dǎo)種子萌發(fā)，但列當(dāng)不能成功寄生，最終導(dǎo)致種子死亡，這類非寄主植物被稱為“誘捕作物”。寄主植物分泌的次生代謝物質(zhì)在土壤中不穩(wěn)定，有必要在非寄主植物中找到類似的可誘導(dǎo)列當(dāng)種子萌發(fā)的刺激物質(zhì)，但由于不是所有植物都能刺激寄生雜草種子萌發(fā), 所以找到合適的植物材料有非常重要的意義[11]。Fernnde-Apariciol等[12]研究了41種經(jīng)濟(jì)作物的根系分泌物對(duì)9種列當(dāng)屬種子萌發(fā)的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)非寄主植物也具有誘導(dǎo)列當(dāng)種子“自殺式發(fā)芽”的能力。馬永清等[11]研究發(fā)現(xiàn)在300多種中草藥中僅有一小部分浸提液能夠刺激瓜列當(dāng)和向日葵列當(dāng)種子發(fā)芽；金付平等[13]研究發(fā)現(xiàn)在240種中草藥中，有40多種中草藥的甲醇浸提液能夠刺激小列當(dāng)種子的萌發(fā)。

采用“誘捕作物”誘導(dǎo)列當(dāng)種子“自殺式發(fā)芽”是一種常用于防除雜草列當(dāng)?shù)姆椒?。新疆維吾爾自治區(qū)特色植物對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以新疆維吾爾自治區(qū)5種特色非寄生植物為研究對(duì)象，測(cè)定這些植物的正己烷萃取物、氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)的刺激作用，旨在探明這些植物萃取物對(duì)瓜列當(dāng)種子發(fā)芽的影響，以期為列當(dāng)?shù)纳鷳B(tài)綠色防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

椒蒿、竊衣、一枝蒿、香青蘭和驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊的采集信息，見(jiàn)表1。2019年8月瓜列當(dāng)種子采集于新疆維吾爾自治區(qū)哈密市伊吾縣淖毛湖鎮(zhèn)。

表1 供試植物采集信息Table 1 Directory of tested plants

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1植物萃取物的提取

分別將椒蒿、竊衣、一枝蒿、香青蘭和驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊植株曬干剪碎后，依次用95%乙醇、75%乙醇和50%乙醇浸泡，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮后得到乙醇浸提液，乙醇浸提液再經(jīng)有機(jī)溶劑正己烷、氯仿、乙酸乙酯依次萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮得到相應(yīng)的正己烷萃取物、氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物，分別收集放入棕色瓶中密封保存，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2列當(dāng)種子的表面消毒及預(yù)培養(yǎng)

選取適量的列當(dāng)種子裝入5 mL的離心管中，用移液槍向離心管中加入適量的1% NaClO溶液，振動(dòng)搖勻4 min，靜置1 min至沉淀；吸出混合液，在離心管中繼續(xù)加入蒸餾水沖洗3次；再加入75%的乙醇，振動(dòng)搖勻4 min，靜置1 min至沉淀；吸去上層液體，剩余列當(dāng)種子繼續(xù)用蒸餾水沖洗3次后，倒在吸水紙上，晾干備用。在一次性培養(yǎng)皿(直徑90 mm，高20 mm)內(nèi)鋪上雙層直徑為90 mm的定性濾紙，加入適量的蒸餾水浸濕，在濾紙上放入多片適當(dāng)大小的玻璃纖維濾紙，將消毒過(guò)的列當(dāng)種子均勻地撒在玻璃纖維濾紙(Whatman GF/A)片上，蓋上培養(yǎng)皿，封口膜密封培養(yǎng)皿，置于25 ℃，暗培養(yǎng)4 d。

1.2.3列當(dāng)種子發(fā)芽試驗(yàn)

用電子天平分別稱取不同植物的萃取物 100 mg 于2.0 mL離心管中，加入1.4 mL甲醇稀釋14倍，此時(shí)濃度為7.14×104μg/mL，用甲醇依次將萃取物稀釋成 3.57×103、1.79×102、8.93、4.50×10-1和2.20×10-2μg/mL。用打孔器將玻璃纖維濾紙打成直徑為8 mm的濾紙片，移液槍吸取6個(gè)濃度的溶液各40 μL將濾紙片浸濕，放置干燥，每個(gè)濃度10次重復(fù)。最后在90 mm的培養(yǎng)皿中鋪上雙層定性濾紙，加入蒸餾水浸濕至不滴漏以保持培養(yǎng)皿內(nèi)濕潤(rùn)。將干燥后的玻璃纖維濾紙片放在定性濾紙上，在顯微鏡下挑選飽滿、大小一致的列當(dāng)種子，每個(gè)玻璃纖維濾紙片上放25～30粒種子，蓋上培養(yǎng)皿，用Parafilm封口膜密封，置于25 ℃，黑暗培養(yǎng)。8 d后，在顯微鏡下觀察列當(dāng)種子的發(fā)芽情況，種子萌發(fā)以發(fā)芽管突破種皮為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算種子發(fā)芽率。甲醇作為空白對(duì)照，適當(dāng)濃度的獨(dú)角金內(nèi)酯(GR24)處理為參比對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.00對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，計(jì)算列當(dāng)種子發(fā)芽率，運(yùn)用Duncan’s新復(fù)極差法分析0.05水平上的差異顯著性。

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 正己烷萃取物誘導(dǎo)瓜列當(dāng)種子的發(fā)芽率

由表2可知，在設(shè)置的濃度范圍2.20×10-2～7.14×104μg/mL內(nèi)，正己烷萃取物對(duì)瓜列當(dāng)種子發(fā)芽率的影響表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制。在濃度為7.14×104μg/mL時(shí)，5種植物的正己烷萃取物均不能刺激瓜列當(dāng)種子發(fā)芽。不同植物的正己烷萃取物對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)的影響不同，驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊和香青蘭的正己烷萃取物在濃度為3.57×103μg/mL時(shí)，瓜列當(dāng)種子發(fā)芽率最高，分別為36.55%和28.68%；竊衣的正己烷萃取物在濃度為1.79×102μg/mL時(shí)，瓜列當(dāng)種子發(fā)芽率最高，為23.45%；椒蒿的正己烷萃取物在濃度為8.93 μg/mL時(shí)，瓜列當(dāng)種子發(fā)芽率最高，為14.10%；一枝蒿的正己烷萃取物活性最弱，在濃度為8.93 μg/mL時(shí)，發(fā)芽率最高僅為3.93%。

表2 5種植物的正己烷萃取物誘導(dǎo)瓜列當(dāng)種子的萌發(fā)率Table 2 Induction of seed germination of P. aegyptiaca by five n-hexane extracts %

2.2 氯仿萃取物誘導(dǎo)瓜列當(dāng)種子的發(fā)芽率

由表3可知，在濃度為7.14×104μg/mL時(shí)，5種供試植物的氯仿萃取物均不能刺激瓜列當(dāng)種子發(fā)芽。在濃度為3.57×103μg/mL時(shí)，竊衣的氯仿萃取物能夠刺激瓜列當(dāng)種子發(fā)芽，但活性較弱，種子發(fā)芽率僅為8.71%。在低濃度范圍內(nèi)，5種植物的氯仿萃取物對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)有誘導(dǎo)作用，誘導(dǎo)活性由高到低為：椒蒿>竊衣>香青蘭>驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊>一枝蒿。椒蒿的氯仿萃取物在濃度為2.20×10-2μg/mL時(shí)，瓜列當(dāng)種子發(fā)芽率最高，可達(dá)99.20%；竊衣的氯仿萃取物在濃度為8.93 μg/mL時(shí)，瓜列當(dāng)種子發(fā)芽率最高，為74.61%；香青蘭和驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊的氯仿萃取物在濃度為1.79×102μg/mL時(shí)，瓜列當(dāng)種子發(fā)芽率最高，分別為30.22%和24.72%；一枝蒿的氯仿萃取物在濃度為2.20×10-2μg/mL時(shí)，種子發(fā)芽率最高，為23.08%。

表3 5種植物的氯仿萃取物誘導(dǎo)瓜列當(dāng)種子的發(fā)芽率Table 3 Induction of seed germination of P. aegyptiaca by five chloroform extracts %

2.3 乙酸乙酯萃取物誘導(dǎo)瓜列當(dāng)種子的發(fā)芽率

由表4可知，相比于同一種植物的正己烷部分和氯仿部分的種子萌發(fā)率可知，乙酸乙酯萃取物的生物活性較低，瓜列當(dāng)種子的發(fā)芽率<15.00%。

3 討論與結(jié)論

在我國(guó)的中草藥中僅有一小部分中草藥的浸提液能夠刺激列當(dāng)種子發(fā)芽，說(shuō)明除寄主植物外，能夠刺激列當(dāng)種子萌發(fā)的非寄主植物比較少[14]。本實(shí)驗(yàn)室在前期測(cè)定了多種非寄主植物的生物活性，僅篩選出5種具有刺激列當(dāng)種子萌發(fā)物質(zhì)的植物(誘導(dǎo)瓜列當(dāng)發(fā)芽率≥20%)：椒蒿、香青蘭、一枝蒿、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊和竊衣。對(duì)于同一種植物而言，氯仿萃取物刺激瓜列當(dāng)種子萌發(fā)的活性最高，次之為正己烷萃取物，活性最弱的是乙酸乙酯萃取物，說(shuō)明能夠刺激列當(dāng)種子發(fā)芽的物質(zhì)可能不止一種，且活性不一致。植物體內(nèi)的成分復(fù)雜多樣，刺激列當(dāng)種子萌發(fā)的化感物質(zhì)究竟是單一的化學(xué)成分，還是多種化學(xué)成分同時(shí)在起作用，這有待于進(jìn)一步研究。

馬永清等[11]研究了606種傳統(tǒng)中草藥浸提液對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)率的影響，結(jié)果顯示只有21種中草藥的甲醇浸提液能夠刺激瓜列當(dāng)種子萌發(fā)，其中，胖大海(SterculiascaphigeraWall.)的甲醇浸提液原液刺激瓜列當(dāng)種子的發(fā)芽率最高，為69.60%；金線草(Antenoronfiliforme)的甲醇浸提液稀釋100倍后處理瓜列當(dāng)種子的發(fā)芽率為66.40%,而其他中草藥都低于60%。本試驗(yàn)中椒蒿氯仿萃取物在濃度為2.20×10-2時(shí)對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，瓜列當(dāng)種子萌發(fā)率高達(dá)99.20%，顯著優(yōu)于胖大海和金線草。因此，椒蒿是一種具有潛力的誘捕作物。

誘捕作物的應(yīng)用可分為2個(gè)方面，一是采用輪作或間作的模式將誘捕作物種植于列當(dāng)侵染嚴(yán)重的作物田中，通過(guò)誘捕作物分泌的可誘導(dǎo)列當(dāng)種子萌發(fā)的刺激物誘導(dǎo)土壤中列當(dāng)種子的“自殺式發(fā)芽”；二是以活性追蹤為指導(dǎo)分離純化并鑒定種子萌發(fā)刺激物質(zhì)，如從黃飛蓬(Dittrichiaviscosa)植物中提取出的菊苣素D和E對(duì)向日葵列當(dāng)種子萌發(fā)具有較好的誘導(dǎo)活性[15]；或以活性化感物質(zhì)為模板，合成生物除草劑，如以赤霉素和貝殼烯酸為支架，附加在寄生雜草種子萌發(fā)過(guò)程中起重要作用的D環(huán)，合成獨(dú)角金內(nèi)酯模擬物，其中一些模擬物的活性與GR24相當(dāng)[16]。

本研究結(jié)果表明，椒蒿氯仿提取物具有能夠誘導(dǎo)列當(dāng)種子“自殺式發(fā)芽”的物質(zhì)，對(duì)于消減土壤中的列當(dāng)種子庫(kù)，減少列當(dāng)侵染具有重要的意義。但椒蒿在田間的誘捕效果以及誘導(dǎo)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)的關(guān)鍵活性物質(zhì)暫不明確，值得進(jìn)一步研究。