氧化應激反應在二乙基亞硝胺誘導大鼠肝癌形成過程中的動態(tài)變化及意義

鐘長軍，王 秀，羅佳佳

(1. 安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校，安徽 蕪湖 241003；2. 皖南醫(yī)學院中西醫(yī)結合研究中心,安徽 蕪湖 241002)

肝癌是最常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有高度惡性、發(fā)病隱匿、進展快、治愈率低、病死率高的特點，是我國第4位常見惡性腫瘤及第3位腫瘤致死病因[1-2]。肝癌的發(fā)生原因目前尚未完全明確，但是與病毒性肝炎、飲食習慣等因素密切相關，近年來食物中的亞硝酸鹽類物質越來越受到關注[3-5]。亞硝酸鹽在體內(nèi)特殊環(huán)境下能代謝成亞硝胺，是動物和人類的潛在致癌物,目前亞硝胺誘發(fā)的肝癌已經(jīng)成為重大的公共衛(wèi)生問題。亞硝胺的致癌性與活性氧自由基存在著密切關系[6]。因此本研究擬以二乙基亞硝胺誘導大鼠肝癌模型，觀察在誘癌過程中肝臟氧化應激狀態(tài)的動態(tài)變化，為臨床肝癌的預防與治療提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1動物 雄性SPF級SD大鼠36只，體重(165±15)g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，動物合格證號：SCXK(蘇)2017-0001。

1.2主要設備及試劑 HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)，DG5033A酶標儀，Cryotome E冰凍切片機(Thermo)，Nikon Eclipse C1正置熒光顯微鏡(日本尼康)。二乙基亞硝胺(上海一基實業(yè)有限公司)，大鼠谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、γ谷氨酰轉肽酶(γ-GT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、微量還原性谷胱甘肽(GSH-Px)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；HE染色試劑盒、大鼠8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)；ROS染液、DAPI、抗熒光淬滅封片劑(Servicebio公司)。

1.3模型制備 所有大鼠在同樣的環(huán)境進行飼養(yǎng)、造模，恒溫(21～25 ℃)、恒濕(45%～65%)，自由飲食，維持12 h明暗交替。依照隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為正常組12只和模型組24只。參照文獻[7]方法，模型組大鼠予以50 mg/kg 二乙基亞硝胺腹腔注射，前4周每周2次，以后每周1次，持續(xù)注射16周；正常組大鼠予以生理鹽水腹腔注射，方法同模型組。

1.4樣品采集與處理 2組分別于實驗第4，8，12，16周末依照隨機數(shù)字表法隨機取正常組大鼠3只、模型組大鼠6只，稱重并記錄，按照體重的標準注射10%水合氯醛(3 mL/kg注射)麻醉，大鼠采取仰臥位的姿勢，心臟采血，打開腹腔，摘取肝組織，稱重并記錄，然后切取1.0 cm×1.0 cm大小組織2塊，-80 ℃保存?zhèn)溆?。所采集血? ℃靜置3 h后，3 000 r/min離心15 min，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5觀察指標與方法 ①記錄大鼠體重、肝臟重量，并計算肝臟系數(shù)。②將肝臟組織在4%甲醛溶液浸泡過夜進行固定，而后將其包埋在石蠟中，切成5 μm厚的切片，根據(jù)HE染色步驟進行染色，顯微鏡觀察拍照。③采用冰凍切片，免疫熒光檢測肝臟組織ROS表達情況。嚴格按照試劑盒說明操作，切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，陽性為產(chǎn)生綠色熒光。④采用可見分光光度法檢測2組大鼠血清中ALT、AST、γ-GT、MDA水平，采用ELISA法檢測血清8-OHdG水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2 結 果

2.12組大鼠體重及肝臟系數(shù)比較 實驗第4，8，12，16周末，模型組大鼠體重均顯著低于同期正常組(P均<0.05)，肝臟系數(shù)均顯著高于同期正常組(P均<0.05)；隨著時間的延長，模型組大鼠體重變化不明顯(P>0.05)，肝臟系數(shù)顯著增高(P<0.05)。見表1。

表1 2組大鼠體重及肝臟系數(shù)比較

2.22組大鼠肝臟病理學比較 正常組大鼠肝組織整體結構正常，肝細胞結構飽滿，中央靜脈輪廓清晰，肝索沿著中央靜脈呈放射狀排列，見圖1。實驗第4周末，模型組大鼠肝組織整體結構基本正常，肝細胞結構疏松，部分肝細胞可見明顯水腫，組織可見少量炎癥細胞浸潤，見圖2。實驗第8周末，模型組大鼠肝細胞可見廣泛水腫，部分肝細胞可見氣球樣變，組織可見大量炎癥細胞浸潤，見圖3。實驗第12周末，模型組大鼠肝組織整體結構異常，組織可見纖維結締組織明顯增生，明顯纖維化，組織可見大量炎癥細胞浸潤，見圖4。實驗第16周末，模型組大鼠部分肝細胞可見明顯壞死，組織可見較多腫瘤細胞浸潤，組織可見明顯炎癥細胞浸潤，見圖5。

圖1 正常組大鼠肝組織病理學HE染色表現(xiàn)(×200)

圖2 造模第4周末模型組大鼠肝組織病理學HE染色表現(xiàn)(×200)

圖3 造模第8周末模型組大鼠肝組織病理學HE染色表現(xiàn)(×200)

圖4 造模第12周末模型組大鼠肝組織病理學HE染色表現(xiàn)(×200)

圖5 造模第16周末模型組大鼠肝組織病理學HE染色表現(xiàn)(×200)

2.32組大鼠肝臟ROS表達情況比較 實驗第4，8，12，16周末，模型組大鼠肝臟ROS表達水平均顯著高于同期正常組(P均<0.05)，且隨著時間的延長顯著增高(P<0.05)。見表2及圖6。

圖6 2組大鼠肝組織ROS熒光染色情況(×200)

表2 2組大鼠肝組織中ROS表達熒光強度比較

2.42組大鼠血清ALT、AST和γ-GT水平比較 實驗第4，8，12，16周末，模型組大鼠血清ALT、AST、γ-GT水平均顯著高于同期正常組(P均<0.05)，且隨著時間的延長均顯著增高(P均<0.05)。見表3。

表3 2組大鼠血清ALT、AST、γ-GT水平比較

2.52組大鼠血清氧化應激指標水平比較 實驗第4，8，12，16周末，模型組大鼠血清GSH-Px、SOD水平均顯著低于同期正常組(P均<0.05)，血清MDA、8-OHdG水平均顯著高于同期正常組(P均<0.05)；隨著時間的延長，模型組大鼠血清GSH-Px、SOD變化不明顯(P均>0.05)，血清MDA、8-OHdG水平均顯著增高(P均<0.05)。見表4。

表4 2組大鼠血清GSH-Px、SOD、MDA、8-OHdG水平比較

時間MDA/(nmol/mL)正常組(3只)模型組(6只)tP8-OHdG/(ng/mL)正常組(3只)模型組(6只)tP第4周末6.72±0.7911.45±2.254.033<0.053.32±0.214.15±0.572.801<0.05第8周末6.47±1.7017.79±1.338.186<0.053.25±0.484.33±0.233.993<0.05第12周末7.29±0.5518.05±3.437.893<0.053.43±0.266.23±0.835.036<0.05第16周末8.61±0.8424.81±4.898.399<0.054.76±0.196.74±0.786.960<0.05F1.23816.2652.36725.364P>0.05<0.05>0.05<0.05

3 討 論

亞硝胺是四大食品污染物之一，大量流行病學資料顯示人類的食管癌、肝癌和胃癌等與之有關[8]。二乙基亞硝胺是一種具有肝毒性、細胞毒性及免疫毒性的化學物質，對肝臟具有較明顯的親和性，常被作為動物肝癌模型的誘導劑。本實驗結果表明，給予大鼠50 mg/kg二乙基亞硝胺腹腔注射，連續(xù)16周，從第4周起，ALT、AST開始升高，表明肝功能出現(xiàn)異常，肝臟出現(xiàn)明顯的損傷變化；第12周，γ-GT顯著升高，表明肝臟出現(xiàn)癌變。同時肝臟病理上亦隨著時間推移，與之相應，呈現(xiàn)炎癥→肝纖維化→肝硬化→癌變的變化過程。

氧化應激可能是形成肝癌的發(fā)病機制之一，ROS與細胞損傷、DNA突變、炎性反應之間有著密切的關系。在正常大鼠體內(nèi)，氧化/抗氧化系統(tǒng)維持著動態(tài)平衡，從而保護體內(nèi)細胞免于氧化損傷；而當ROS增長過多，或機體抗氧化酶活性下降，則導致氧化/抗氧化失衡，不能及時清除ROS，導致大量ROS蓄積；過多的ROS可攻擊肝細胞膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質過氧化作用，形成脂質過氧化產(chǎn)物MDA，過量的MDA具有潛在的細胞毒性，又加劇了肝細胞膜的損傷[9-10]。同時ROS還能夠攻擊細胞內(nèi)的DNA堿基，其攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子而產(chǎn)生的氧化性加合物8-OHdG為DNA氧化損傷的生物標志物，8-OHdG的表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移、預后密切相關[11-12]。在DNA復制過程中, DNA鏈上8-OHdG與C以外的其他堿基配對，形成點突變, 8-OHdG的水平增高，提示DNA損傷增加和/或修復減少，是氧化應激致癌的主要機制之一[13]。通過多因素分析表明，8-OHdG代表的DNA氧化損傷是肝細胞癌發(fā)生的獨立危險因素,并且8-OHdG表達水平與肝細胞癌的發(fā)生概率呈正相關[14]。

目前已知，二乙基亞硝胺經(jīng)肝細胞代謝后，會產(chǎn)生大量的ROS，ROS會損傷細胞，同時氧化應激還可激活癌癥發(fā)生的相關傳導通路，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15]。本實驗在動態(tài)觀察大鼠肝組織“肝損傷-肝纖維化-肝癌前病變-肝癌”的過程中，發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移，模型組大鼠ROS表達水平呈漸進性增高；實驗第12周末，血清8-OHdG水平顯著升高，與此相應，肝臟出現(xiàn)肝硬化與癌前病變；在第16周肝臟癌變發(fā)生時，血清MDA水平較前顯著升高，8-OHdG保持在高水平狀態(tài)。提示ROS、MDA、8-OHdG可作為反映二乙基亞硝胺誘導肝癌發(fā)生發(fā)展過程肝細胞氧化應激損傷程度的標志物。而與之相反的是，大鼠體內(nèi)的抗氧化物質SOD和GSH-Px水平在初始時出現(xiàn)下降，而后相對穩(wěn)定，沒有繼續(xù)降低，提示在二乙基亞硝胺誘導肝癌的過程中，主要矛盾是ROS產(chǎn)生過多過快，不能被及時清除，而不是本身的抗氧化物質減少，但破壞了氧化/抗氧化平衡，產(chǎn)生氧化應激反應，繼而誘發(fā)了肝癌的發(fā)生。

綜上所述，在二乙基亞硝胺誘導大鼠肝癌的過程中存在嚴重的氧化應激，這種持續(xù)的氧化應激狀態(tài)可能是導致肝癌發(fā)生、發(fā)展的重要原因。提示在日常生活中可食用具有抗氧化作用的食品，增強體內(nèi)的抗氧化物質，及時清除ROS，從而起到保護肝臟，預防肝癌發(fā)生的作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。