斑馬魚notch1a對pka報告基因轉錄調控作用

張穎 季策 任建峰 李偉眀 張慶華*

1.上海海洋大學水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306 2.上海海洋大學國家水生動物病原庫，上海 201306 3.密歇根州立大學漁業(yè)與野生生物系，東蘭辛，48824

骨質疏松癥(osteoporosis, OP)是一種因骨量低下、骨微結構破壞，導致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病(世界衛(wèi)生組織，WHO)[1]。Notch信號通路在包括哺乳動物在內的多個物種中表達，對器官、組織的發(fā)育過程起調控作用，可調控細胞的發(fā)育、增殖、分化及凋亡等過程[2]。Notch信號通過受體和相鄰細胞的特異性配體結合，經2次酶解后釋放胞內段(Notch intracellular domain，NICD)激活Notch信號通路相關轉錄因子的表達[3]。國內、外研究證實Notch信號通路將直接作用于成骨細胞及破骨細胞的增殖和分化，在骨質疏松的發(fā)生和進展中發(fā)揮了重要的調控功能[4]。

Notch信號通路和蛋白激酶A(protein kinase A，pka)參與的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路相輔相成，在生物進化的過程中發(fā)揮著重要的作用。Notch信號通路在髓核內的表達和活化依賴于其與MAPK和核轉錄因子kappa B信號通路的交互作用，進而調控著髓核細胞增殖、分化[5]。有研究[6]表明，MAPK信號通路和Notch信號通路相互聯(lián)系，共同調控骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSCs)成骨分化過程。

pka在誘導間充質干細胞(mesenchymal stem cell, MSCs)成骨分化方面有著很強的能力。pka活性的增強能夠促進成骨分化的基因，抑制破骨基因的表達，從而降低骨質疏松癥的發(fā)生[7]。一些研究發(fā)現(xiàn)間充質干細胞和成骨細胞中環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)/PKA途徑的激活導致NF-κB配體(kappa nuclear factor receptor)與骨保護素(osteoprotegerin)的比例降低，抑制破骨細胞生成[8]。PKA可以被甲狀腺激素(parathyroid hormone, PTH)誘導激活，進而導致cAMP應答元件結合蛋白(cAMP response element-binding protein, CREB)磷酸化并激活，從而導致NF-κB配體(kappa nuclear factor receptor，RANKL)的生成[9]?？v觀Notch分子通路影響多個基因調控骨骼的形成和發(fā)展機制為我們認識有關骨骼疾病的分子機制奠定了很好的基礎，但目前關于Notch信號是否通過調控pka來影響骨骼的形成并不清楚，因此我們推測Notch信號通路可能通過調控pka進而影響骨細胞的成熟與分化。

在骨骼研究領域人們已經成功建立了許多動物骨骼模型，而新型模式生物斑馬魚則越來越受到人們的關注[10]。成年斑馬魚骨屬性與人類相似，目前已復制出數(shù)個成年魚骨病(如骨質疏松)模型，用于分析病理生理機制和設計新的治療方案。在細胞水平上，斑馬魚的成骨細胞和破骨細胞與哺乳動物高度相似。因此，胚胎斑馬魚已被廣泛應用于骨組織的發(fā)育研究[11]。成年斑馬魚骨質疏松模型具有易飼養(yǎng)、成本低；給藥方法簡便，給藥濃度可控；大幅度縮短造模及給藥干預時間，提高研究效率；分子機制也與人類高度相似的特點。此外，斑馬魚的notch1a基因與哺乳動物的notch1高度相似。本研究以斑馬魚為模型，利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)探究notch1a的胞內段(N1aICD)與pka基因的調控關系，將有助于闡明骨質疏松的分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗用魚：實驗AB品系斑馬魚購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所斑馬魚平臺。

1.1.2實驗細胞：實驗所用HEK293T細胞(人胚腎細胞)由中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學曹雪濤教授惠贈。

1.1.3主要試劑：熒光素酶報告基因載體pGL3-Enhancer由中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學曹雪濤教授惠贈，DMEM培養(yǎng)基(HyClone，AD24464275)，Opti-MEM(gibco，1894141)，轉染試劑FuGENE HD Transfection Reagent(Promega，0000352595)，Dual Luciferase Reporter(REASEN，D4901060)，哺乳動物表達載體p3XFLAG-CMV-7(SIGMA)，同源重組試劑2×ClonExpress Mix(諾唯贊，C115-02-AA)，小鼠抗FLAG-tag單克隆抗體(YSASEN，30503ES60)，Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP(Invitrogen，31430)，β-actin, Rabbit pAb(YSASEN，30102ES40)，Peroxidase- Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)(YSASEN，33101ES60)。

1.2 實驗方法

1.2.1斑馬魚pka啟動子序列的獲得以及轉錄因子結合位點的分析：運用在線工具UCSC Genome Browse(http://www. genome.ucsc.edu)預測pka啟動子序列。通過AliBaba(http://gene-regulation.com/pub /programs/alibaba2/index.html)分析轉錄因子的結合位點，通過Methprimer-Design(http://www. urogene.org /cgi-bin/ methprimer/methprimer.cgi)和EMBOSS Cpgplot(https://www.ebi.ac.uk /Tools/ seqstats /emboss cpgplot/)預測啟動子的CpG島。

1.2.2斑馬魚pka熒光素酶報告基因載體構建：根據(jù)啟動子的序列設計的引物，F(xiàn)orward：GTCGCCGTCCTCGTTCTAT，Reverse：AACCAG CCAACCAGCCTAG。以基因組DNA為模板，利用高保真酶進行PCR擴增，使用限制性內切酶NheI和XhoI對質粒載體pGL3-Enhancer和PCR純化產物進行雙酶切，將其與PCR產物進行純化。之后將二者用T4連接酶連接，并轉化至DH5α中，測序并對其進行鑒定。

1.2.3斑馬魚notch1a胞內段(N1aICD)真核表達載體的構建：根據(jù)NCBI網站上登錄的斑馬魚notch1a基因(NM_131441.1)設計引物，F(xiàn)orward：GACAAGCTTGCATGCCTGCAGAACGAACCCAAAA AGAAGAGGA，Reverse：CAGGGATGCCACCCGGG ATCCCTACTTGAAGGCTTCTGGAATATGG。以斑馬魚cDNA為模板進行PCR擴增。使用限制性內切酶PstⅠ和BamHⅠ對載體p3xFLAG-CMV-7進行雙酶切并純化。純化之后用同源重組連接酶2×ClonExpress Mix將其與p3xFLAG-CMV-7相連接，產物轉化至DH5α中，測序并進行鑒定。

1.2.4斑馬魚N1aICD的蛋白表達分析：將構建好的pCMV-N1aICD重組質粒轉染至HEK293T細胞并提取蛋白。用BCA 法進行蛋白定量，-20 ℃凍存。取25 μg進行SDS-PAGE聚丙烯胺凝膠電泳，并將蛋白質轉至NC膜上，過夜封閉，PBST漂洗濾膜3次，每次5 min，以鼠源FLAG-tag抗體為一抗(1∶2 000倍稀釋)孵育3 h，之后PBST漂洗濾膜3次，每次5 min，以山羊抗鼠為二抗(1∶2 000倍稀釋)孵育3 h，再用PBST漂洗濾膜3次，每次5 min，ECL顯色，發(fā)光，檢測分析Western blot結果。

1.2.5pka報告基因的活性檢測：HEK293T細胞培養(yǎng)于10 % FBS-DMEM培養(yǎng)液中。當細胞匯合度達到70 %～80 %時即可轉染。參照轉染試劑FuGENE HD Transfection Reagent的說明書進行轉染，之后按不同分組將轉染復合物加入到HEK293T細胞中(表1)，24 h后檢測報告基因活性。

表1 pka報告基因表達活性檢測實驗分組情況Table 1 Detection of pka promoter expression activity

1.2.6N1aICD對pka啟動子轉錄活性的影響：參照轉染試劑FuGENE HD Transfection Reagent的說明書進行轉染，之后按不同分組將轉染復合物加入到HEK293T細胞中(表2)，24 h后檢測熒光素酶活性。

表2 雙熒光素酶報告基因實驗分組情況

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)利用GraghPad Prism 6.01軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，每組各設三個生物學重復和技術重復，兩組之間采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 pka轉錄因子結合位點的分析

AliBaba軟件分析啟動子上存在Oct-1、Oct-1 A、AP-1、HNF-1、E1、myogenin、MyoD、NF-kappaB、IK-1、IK-2等重要的轉錄因子結合位點(圖1 A)。通過EMBOSS Cpgplot 和 Methprimer-Design軟件分析，沒有發(fā)現(xiàn)與轉錄起始有關的CpG島(圖1B；1C)。

注：A AliBaba軟件預測的pka的5’調控序列的潛在轉錄因子結合位點；B EMBOSS Cpgplot軟件預測pka啟動子的CpG島；C：Methprimer-Design軟件預測pka啟動子的CpG島。圖1 斑馬魚pka啟動子轉錄因子結合位點和CPG島的預測Fig.1 Prediction of pka promoter transcription factor binding site and CpG island in zebrafish

2.2 pka報告基因載體的構建

以斑馬魚的基因組為模板，克隆pka啟動子片段。電泳結果顯示，在約3 000 bp處出現(xiàn)單一條帶(圖2)。測序結果與預測信息比對一致后將PCR純化產物雙酶切，然后與雙酶切載體pGL3-Enhancer連接并測序檢驗克隆成功。

圖2 pka啟動子的擴增Fig.2 The promoter fragment of pka

2.3 N1aICD真核表達載體的構建

以斑馬魚的cDNA為模板，克隆notch1a基因的胞內段，電泳結果顯示，在約2 000 bp處出現(xiàn)單一條帶(圖3 A)。將純化后的PCR產物與雙酶切載體p3xFLAG-CMV用同源重組的方式連接，并經測序驗證其與預測信息一致。

注：A notch1a基因的胞內段擴增；B Western blot通過Flag標簽顯示了N1aICD蛋白的表達水平。圖3 notch1a基因的胞內段擴增與Western blot分析N1aICD蛋白的表達Fig.3 Intracellular amplification of notch1a and western blot analysis the expression of N1aICD

2.4 Western blot分析N1aICD蛋白的表達情況

為了驗證實驗組質粒轉染HEK293T細胞后成功表達N1aICD蛋白，我們進行了Western blot分析。轉染pCMV-N1aICD質粒的實驗組使用Flag抗體出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，而轉染p3×FLAG-CMV空載質粒的對照組中卻未見相關條帶，表明實驗組有N1aICD蛋白的表達(圖3B)。

2.5 pka報告基因的活性檢測

將pGL3-pka重組質粒和pGL3-Enhancer空載質粒分別轉染HEK293T細胞，24 h后檢測啟動子活性。檢測結果顯示，在HEK293T細胞中，實驗組活性為對照組的3.25倍，兩組差異有顯著性意義(P=0.0009)(圖4)，說明構建的報告基因在HEK293T細胞中具有一定活性。

圖4 重組質粒pGL3-pka轉染HEK293T細胞后熒光素酶相對表達量Fig.4 Luciferase relative expression of recombinant plasmid pGL3-pka after transfecting HEK293T

2.6 N1aICD對pka啟動子轉錄活性的影響

pGL3-pka及pRL-CMV內參質粒和pCMV-N1aICD共轉染至HEK293T細胞中，對照組則轉染p3×FLAG-CMV空載。熒光素酶報告基因活性檢測顯示，實驗組的熒光素酶活性是對照組的0.31倍，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0020)(圖5)，說明notch1a胞內段對pka啟動子具有明顯的抑制作用。

圖5 在HEK293T細胞中驗證N1aICD對pka啟動子轉錄活性的影響Fig.5 Verify the effect of N1aICD on the transcriptional activity of pka promoter in HEK293T cells

3 討論

骨骼生長和修復是通過骨重塑實現(xiàn)的，正常的骨重塑使骨量保持平衡，這基于骨形成和骨吸收過程之間的動態(tài)平衡[12]。斑馬魚骨質疏松模型相比于其他模式生物具有特殊的優(yōu)點，已被廣泛用于骨骼發(fā)育及相關疾病機制的研究與治療[13]。然而因缺乏抗體和細胞系，在研究具體的分子機制方面仍存在瓶頸，因此以斑馬魚為研究模型找到一種簡單而又可行的方法，深入研究基因的功能就顯得格外重要。雙熒光素酶報告基因實驗已成為研究轉錄因子參與基因調控的有效手段，可以在最大程度上減小細胞活性和轉染效率等外在因素對實驗的影響，使得數(shù)據(jù)結果更為可信。因此正確構建報告基因系統(tǒng)可對目的基因所具備的功能及其所參與的信號通路提供有力的研究工具。

本研究利用AliBaba在線分析發(fā)現(xiàn)pka啟動子上存在Oct-1、Oct-1 A、AP-1、HNF-1、E1、myogenin、MyoD、NF-κB、IK-1、IK-2等重要的轉錄因子結合位點。有研究證實AP-1在廢用性骨質疏松破骨細胞分化方面有著重要影響[14]。

Notch信號通路和pka基因在骨細胞的分化和成熟中有著重要的作用。在成骨細胞分化方面，為了探究Notch信號通路對pka基因的調控作用，本文構建了斑馬魚notch1a基因胞內段的真核表達載體和pka啟動子的報告基因載體，為今后探究pka基因的表達調控提供了基礎，同時實驗也通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)證明了斑馬魚N1aICD對pka基因的轉錄抑制效率達到69.44 %，初步揭示了Notch信號通路和pka之間的調控作用，并可能為探明不同信號途徑在骨吸收和骨形成中的相互作用提出新證據(jù)。

在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)Notch1通過直接作用于破骨細胞前體并間接作用于成骨細胞而抑制破骨細胞分化，破骨細胞前體中Notch1的基因缺失增強了破骨細胞生成。N1ICD在成骨細胞中的過度表達會導致骨質疏松癥的表型[15]。研究表明，pka信號通路的激活可以提高runt相關轉錄因子2(Runx2)的穩(wěn)定性和活性，促進成骨細胞分化[16]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)通過依賴PKA機制來抑制鹽誘導激酶1(salt-inducible kinase 1，SIK1)的表達和SIK1活性，從而刺激成骨作用[17]。但是對斑馬魚骨骼形成的研究中主要集中在單通路的調控機制方面，其兩個甚至多個通路之間的調控作用的研究卻處于初級階段。所以本研究克隆了斑馬魚N1aICD胞內段和pka啟動子，通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)更直觀地證明了N1aICD胞內段對pka基因的轉錄抑制效率達到69.44 %。

我們的研究結果表明斑馬魚notch1a分子過表達負向調控pka的表達。而pka參與的MAPK信號通路與Notch通路相互作用，共同調控斑馬魚成骨細胞及破骨細胞的分化，為魚類骨骼發(fā)育機制的研究提供嶄新的認識，對人類骨骼疾病的分子機制提供一定的借鑒意義，但詳細機制有待今后深入研究。