基于多波長融合的菟絲子多成分定量方法研究

王亞楠，包永睿，2，3，王帥，2，3，李天嬌，2，3，孟憲生，2，3*（.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連6600；2.遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連 6600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連6600）

2020年版《中國藥典》一部收載的菟絲子為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australisR.Br.或菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子[1]。菟絲子，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并被列為調(diào)元上品，具有補肝腎、益精明目、安胎等功效，是補腎壯陽的常用中藥。臨床常用于肝腎不足、腰膝酸軟等。菟絲子主要含有黃酮類、有機酸類、植物甾醇類、生物堿類、多糖類等多種化學(xué)成分，黃酮類包括金絲桃苷、紫云英苷、山柰酚、異鼠李素、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖（2 →1）-β-D-芹糖苷等[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，菟絲子具有提高心血管系統(tǒng)功能[4-5]、降血糖[6-7]、增強機體免疫力[8]、抗癌[9]、保肝[10]、明目等多種藥理作用。菟絲子是《太平圣惠方》收載抗衰益壽方劑中出現(xiàn)概率最多的藥物之一，有研究表明，菟絲子具有抗衰老作用[11-12]。菟絲子有關(guān)黃酮類以及酚酸類成分的含量測定研究已有文獻[13-15]報道，本研究在此基礎(chǔ)上，通過色譜條件的進一步優(yōu)化，采用HPLC 法以及多波長融合技術(shù)聯(lián)合測定菟絲子中綠原酸、異綠原酸C 以及3 種有代表性的黃酮類成分（金絲桃苷、異槲皮苷及山柰酚）的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 Infinity Ⅱ型超高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司，包括二元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱和OpenLAB CDS色譜工作站），HS6150 型超聲波清洗器（天津恒奧科技發(fā)展有限公司），CP225D 型電子分析天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

金絲桃苷、異槲皮苷、異鼠李素、槲皮素、山柰酚、紫云英苷、綠原酸對照品（批號分別為19103001、18062702、20090205、19082203、20082105、19042203、18071907，成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度均≥98%），異綠原酸C（批號：wkq18050905，四川維克奇生物科技有限公司）異綠原酸C 的純度為98%。乙腈、甲酸、甲醇為色譜純，水為超純水。

菟絲子藥材購自陽光大藥房，購有內(nèi)蒙古、遼寧、河北以及安徽產(chǎn)地的菟絲子，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)張建奎教授鑒定均為旋花科植物菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent proshell 120 SB-C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm），流動相B 為乙腈，A 為0.2%甲酸水，梯度洗脫（0～5 min，7%～11%B；5～8 min，11%～15%B；8 ～12 min，15%～15%B；12 ～16 min，15% ～18%B；16 ～23 min，18% ～20%B；23 ～33 min，20% ～27%B；33 ～40 min，27%～35%B），進樣量5 μL，流速0.6 mL·min－1，柱溫30℃，檢測波長237 nm、360 nm。

2.2 供試品溶液的制備

稱取菟絲子粉末（過四號篩）1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，超聲處理40 min，放冷，濾過，揮干，用80%甲醇復(fù)溶，定容至10 mL 量瓶中，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、槲皮素、異鼠李素、綠原酸、異綠原酸C 對照品適量，置于同一10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素、綠原酸、異綠原酸C 的質(zhì)量濃度分別為75.45、25.8、46.1、26.1、13.47、18.04、40.9、11.4 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.4 全時段多波長信息融合方法

通過DAD 檢測器對菟絲子色譜圖進行紫外全波長（200 ～400 nm）掃描。根據(jù)掃描結(jié)果確定融合波長為237 nm、360 nm。分別從Agilent 1260 色譜工作站中導(dǎo)出237 nm、360 nm 的dif 格式數(shù)據(jù)文件，使用Matlab 軟件編程，將導(dǎo)出的數(shù)據(jù)進行全時段多波長信息融合后，獲得了一組圖譜文件和一張同時反映兩個波長信息的色譜圖，樣品及混合對照品色譜圖見圖1。共標(biāo)定12 個色譜峰，通過與對照品比對，識別出8 種成分。

2.5 指標(biāo)性成分確認

質(zhì)譜條件：正離子模式 Agilent Proshell SBC18色譜柱（3 mm×100 mm，2.1 μm），流動相B 為乙腈，A 為0.2%甲酸水，梯度洗脫程序同“2.1”項下洗脫條件，流速0.4 mL·min－1，柱溫30 ℃，進樣量1.5 μL。電噴霧離子源（ESI），正離子模式檢測，干燥氣流速13 L·min－1，干燥氣溫度350℃，毛細管電壓3.5 kV，霧化器壓力310.28 kPa，碎裂電壓125 V，二級質(zhì)譜碰撞電壓40 eV，采集范圍m/z100 ～1000。

將內(nèi)蒙古菟絲子藥材供試品溶液與混合對照品溶液進行UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析，得正離子模式下的總離子流圖，見圖2。根據(jù)藥材供試品溶液化學(xué)成分的保留時間（tR）和質(zhì)譜信息，結(jié)合混合對照品的二級質(zhì)譜碎片信息進行比對，鑒定出以上8 個指標(biāo)性成分，見表1。

圖1 樣品與對照品高效液相色譜圖Fig 1 HPLC of the sample and the reference

圖2 菟絲子供試品（A）及混合對照品（B）正離子模式下總離子流圖Fig 2 Total ion current Cuscutae semen sample（A）and mixed reference （B） in positive ion mode

表1 正離子模式下菟絲子指標(biāo)性成分鑒定Tab 1 Identification of index components of Cuscutae semen in positive ion mode

2.6 線性關(guān)系考察

精密量取綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、異綠原酸C、山柰酚對照品適量，加甲醇溶解制成混合對照品儲備液（每1 mL 含綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、異綠原酸C 和山奈酚分別為320.72、483.60、246.40、182.40 和215.52 μg）；精密量取上述混合對照品儲備液適量，逐級稀釋成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液（綠原酸320.72、160.36、80.18、40.09、20.05、10.02 μg·mL－1；金絲桃苷483.60、241.80、120.90、60.45、30.23、15.11 μg·mL－1；異槲皮苷246.40、123.20、61.60、30.80、15.40、7.70 μg·mL－1；異綠原酸C 182.40、91.2、45.6、22.8、11.40、5.7 μg·mL－1；山 柰 酚215.52、107.76、53.88、26.94、13.47、6.74 μg·mL－1）；分別精密吸取上述混合對照品溶液5 μL，按“2.1”項下色譜條件進行分析，測定峰面積，以質(zhì)量濃度X（μg·mL－1）對峰面積Y進行線性回歸，綠原酸、異綠原酸C、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚的回歸方程分別為Y＝12.66X＋12.07（r＝0.9994）、Y＝21.15X＋5.868（r＝0.9999）、Y＝18.64X－42.05（r＝0.9991）、Y＝19.19X－11.10（r＝0.9994）、Y＝64.66X＋4.12（r＝0.9998）。結(jié)果表明5 種成分峰面積在線性范圍內(nèi)與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液5 μL 連續(xù)進樣6次，測定綠原酸、異綠原酸C、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚峰面積，結(jié)果峰面積RSD值分別為0.45%、0.36%、0.45%、0.81%、0.64%，表明儀器的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，于室溫放 置0、2、4、6、8、12、24 h，按“2.1” 項 下色譜條件測定峰面積。結(jié)果綠原酸、異綠原酸C、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚24 h 內(nèi)峰面積的RSD分別為0.63%、0.72%、0.95%、0.41%、0.68%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗

按照“2.2”項下方法同時制備6 份供試品溶液，照“2.1”項下方法分別進樣5 μL，測得綠原酸、異綠原酸C、金絲桃苷、異槲皮苷和山柰酚的峰面積RSD分別為1.8%、0.26%、1.7%、0.43%和0.97%。表明該方法重復(fù)性好。

2.10 耐用性考察

考察不同柱溫（25、28、30 ℃）對檢測結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)柱溫為30 ℃時，色譜峰的分離度好；考察不同流速（0.6、0.8 mL·min－1）對檢測結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)流速為0.6 mL·min－1時，色譜峰均能達到良好分離；考察不同型號色譜柱（Agilent proshell 120 SB-C18色譜柱以及Agilent proshell 120 EC-C18色譜柱）對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果選擇Agilent proshell 120 SB-C18色譜柱。

2.11 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的菟絲子藥材粉末6 份，每份約0.5 g，分別加入混合對照品溶液1 mL（金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚、綠原酸、異綠原酸C 分別為1.780、0.3240、0.2810、1.1040、0.0320 μg·mL－1的混合對照品溶液），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、異綠原酸C、山柰酚的平均加樣回收率分別為99.4%、100.0%、98.9%、99.6%和129.0%，RSD分別為0.0040%、0.018%、0.017%、0.029%和0.019%。

2.12 樣品含量的測定

取不同產(chǎn)地菟絲子藥材1 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算樣品中綠原酸、異綠原酸C、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

本研究在前期試驗基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化色譜條件，標(biāo)定12 個色譜峰，通過對照品定性比對，識別出酚酸類和黃酮類共8 種化學(xué)成分，分別是綠原酸、異綠原酸C、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素。綠原酸具有抗氧化[16]、抗癌抗誘變、抑菌作用[17]，綠原酸還具有降血糖[18-19]、減輕脂肪沉積、調(diào)節(jié)免疫的作用[20]，其對認知神經(jīng)系統(tǒng)有重要影響[21]。異綠原酸除具有抗氧化、抗病毒、消炎等生物活性外，還具有抑制組胺釋放、抗纖維化、抑制平滑肌收縮等作用。黃酮類成分是菟絲子的主要有效成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[4-12]菟絲子具有保護生殖系統(tǒng)、提高心血管系統(tǒng)功能、調(diào)節(jié)血脂、降血糖、增強機體免疫功能、抗氧化、抗衰老、抗癌等多種藥理作用。黃酮和酚酸類化學(xué)成分是菟絲子中主要有效的藥理活性成分，具有改善心肌缺血、調(diào)節(jié)機體免疫及內(nèi)分泌等多種功能。且這幾種成分在藥材中含量高、易檢出，其分離度、對稱性好，臨床藥理作用廣泛，能夠代表菟絲子的整體藥效。因此選取這些指標(biāo)成分進行定量研究。

表2 不同產(chǎn)地菟絲子藥材5 種成分含量測定結(jié)果(mg·g－1)Tab 2 Determination of 5 components in Cuscutae semen from different origins (mg·g－1)

表3 不同單一波長下5 種成分的含量測定結(jié)果(mg·g－1)Tab 3 Determination of 5 components under different single wavelengths (mg·g－1)

3.2 樣品處理條件的選擇

分別考察了乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、80%甲醇、60%甲醇的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)80%甲醇提取效果最好，確定80%甲醇為提取溶媒；分別考察了10、30、50 倍量的提取溶劑，發(fā)現(xiàn)50 倍量溶劑提取充分；通過對30、40、60 min 不同超聲時間進行篩選，發(fā)現(xiàn)超聲處理40 min 時，菟絲子已提取較完全。最終確定采用50 mL 80%甲醇超聲提取40 min。

3.3 全時段多波長融合指紋圖譜融合方法的意義

以往的文獻報道多采用高效液相色譜法，選取黃酮類成分中的一種或多種化合物為測定指標(biāo)來控制菟絲子及其制劑的質(zhì)量[22-23]。潘杰等[24]通過UPLC 法建立了菟絲子飲片的指紋圖譜，標(biāo)定了10 個共有峰；但是在不同色譜條件下使用不同前處理方法對菟絲子中綠原酸、異綠原酸C、金絲桃苷、異槲皮苷和山柰酚5 種成分分別進行檢測，無法實現(xiàn)對菟絲子指紋圖譜進行全面和整體評價，因此，本研究遵循信息最大化原則建立菟絲子藥材全時段雙波長融合指紋圖譜并對其指標(biāo)成分進行含量測定。

中藥指紋圖譜是評價和控制中藥質(zhì)量與活性的有力手段之一，目前所見的中藥指紋圖譜大多是單張的色譜圖，當(dāng)中藥化學(xué)成分復(fù)雜時，單張的化學(xué)指紋圖譜難以完整展現(xiàn)藥物的化學(xué)組成特征，因此需要建立多元指紋圖譜，即將多張反映藥物中各類成分化學(xué)組成特征的指紋圖譜融合在一起，共同表征藥物完整的化學(xué)組成，形成多元指紋圖譜。本研究將237 nm、360 nm 兩個波長下的圖譜數(shù)據(jù)進行全時段融合，得到一張同時包含兩個波長信息的色譜圖，可以克服單一波長指標(biāo)檢測時信息量不足的缺點，表征不同類成分的特征吸收，實現(xiàn)對菟絲子指紋圖譜的全面、整體評價。

本試驗還運用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)，根據(jù)精確相對分子質(zhì)量、質(zhì)譜碎片結(jié)構(gòu)和保留時間等信息，結(jié)合對照品的裂解規(guī)律，對HPLC 法識別出的指標(biāo)性成分進行進一步確證。不同產(chǎn)地菟絲子的含量測定結(jié)果顯示，5 種成分含量存在差異，以綠原酸為對照，分別計算不同產(chǎn)地以上4 種成分相對于綠原酸的相對含量，對以上成分的相對含量取均值并下調(diào)60%，擬定菟絲子藥材中5 種指標(biāo)相對含量之和應(yīng)不低于1.87%。菟絲子藥材中尚存在一些響應(yīng)較好的色譜峰為未知成分，有待進一步研究。