一測多評法同時測定小兒黃龍顆粒中5種木脂素成分

劉晶，游龍?zhí)?，蔡夢如，張志勤，白杰，姚宇，吳慧敏，倪?。ū本┲嗅t(yī)藥大學，北京 100029）

小兒黃龍顆粒是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準上市的一款治療注意缺陷與多動障礙（attention deficit and hyperactivity disorder，ADHD）的中藥復方顆粒。它由熟地黃、白芍、麥冬、知母、五味子、煅龍骨、煅牡蠣、黨參、石菖蒲、遠志及桔梗11 味中藥組成。而目前關(guān)于小兒黃龍顆粒的研究僅限于臨床試驗和藥理實驗[1-10]，其質(zhì)量標準和藥物作用機制領域還有待開發(fā)?，F(xiàn)已有研究將五味子中的木脂素類成分用于ADHD 的治療[11]，同時這類成分被證明對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用，并能改善患者認知能力和記憶能力[12]，所以具有較高的單獨研究價值。而小兒黃龍顆粒作為上市藥品已在臨床試驗中證明其對于ADHD 的療效，故本試驗選取這5 個含量相對較高、且有研究證明其神經(jīng)保護性的木脂素類成分建立含量測定方法。并選擇容易獲取，價格相對低廉的五味子醇甲作為內(nèi)參物，建立同時測定五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?；昝仔罤、五味子酯乙5 種成分的一測多評法（QAMS），實現(xiàn)該藥物質(zhì)量評價的進一步延展。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津）；KQ5200DA 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；Sartorius BT 125D 電子天平（德國賽多利斯集團）；G20 型高速醫(yī)用離心機（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA（上海振捷實驗有限公司）。乙腈、甲醇（色譜級，F(xiàn)isher Scientific）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；正己烷、甲醇（分析純，天津市大茂化工廠）；磷酸（分析純，北京化工廠）；小兒黃龍顆粒（重慶希爾安藥業(yè)有限公司，批號：190701）；對照品五味子醇甲（批號：Y13D8H5095）、戈米辛D（批號：M05J9S65019）、五味子醇乙（批號：P4N10F103016）、當歸酰基戈米辛H（批號：P17J9F65870）、五味子酯乙（批號：P07M6S1）（上海源葉生物科技有限公司，HPLC ≥98%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：甲醇-乙腈（2∶1）（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～30 min，50%→65%A；30 ～58 min，65%～70%A）流速0.8 mL·min－1，柱溫40℃，波長254 nm，進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液制備

取一定量的五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?；昝仔罤、五味子酯乙對照品，制成質(zhì)量濃度為137.68、19.20、43.20、29.72、8.64 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.3 樣品溶液制備

取小兒黃龍顆粒1 g，用5 mL 純凈水振搖溶解，再加入50 mL 正己烷，充分攪拌后超聲提取60 min（超聲功率200 W，40 Hz），用正己烷補足失重，6000 r·min－1，離心10 min，取上層澄清溶液放入雞心瓶內(nèi)，40 ℃減壓濃縮至干，用甲醇復溶定容至10 mL 量瓶中。溶液過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液進樣。

圖1 小兒黃龍顆粒樣品的HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of Xiaoer Huanglong granule

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，逐級稀釋，進樣測定，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標X（μg·mL－1），峰面積為縱坐標Y，求得線性回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 5 種木脂素成分的線性關(guān)系考察Tab 1 Linear relation of 5 lignans

2.4.2 精密度試驗 取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?；昝仔罤、五味子酯乙峰面積RSD值分別為0.070%、0.30%、0.060%、0.43%、0.20%，出峰時間的RSD值分別為0.32%、0.24%、0.19%、0.12%、0.070%。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份樣品溶液（批號：190701），按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、16、18、24 h進樣。五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?；昝仔罤、五味子酯乙峰面積RSD值分別為2.7%、2.4%、2.0%、3.5%、1.5%，出峰時間的RSD值分別為0.35%、0.32%、0.30%、0.21%、0.23%。

2.4.4 重復性試驗 取同一批（批號：190701）小兒黃龍顆粒，按“2.3”項下方法制備6 份樣品，分別精密吸取10 μL 進樣。測得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸酰基戈米辛H、五味子酯乙平均含量的RSD值分別為2.3%、1.9%、2.2%、2.6%、0.82%。

2.4.5 加樣回收試驗 取同一批（批號：190701）小兒黃龍顆粒（五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸酰基戈米辛H、五味子酯乙含量分別為0.215、0.028、0.056、0.038、0.021 mg），再加入含量相近的5 種對照品（五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?；昝仔罤、五味子酯乙含量為0.219、0.029、0.057、0.038、0.021 mg），按“2.3”項下方法制備6 份樣品，分別精密吸取10 μL 進樣。測得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?；昝仔罤、五味子酯乙平均回收率為96.7%、102.2%、95.9%、100.5%、102.9%，其RSD值分別為3.6%、2.8%、2.9%、1.7%、3.7%。

2.5 相對校正因子的計算

根據(jù)相對校正因子計算公式：fi/s＝fi/fs＝（Ci/Ai）/（Cs/As）＝（Ci×As）/（Cs×Ai），以多點校正法進行計算。選定五味子醇甲為內(nèi)參物，則fi、Ci、Ai分別為五味子醇甲的相對校正因子、濃度及峰面積，而fs、Cs及As則為待測成分的校正因子、濃度及峰面積，同時選取“2.4.1”項下線性系列濃度與峰面積進行計算?？傻酶昝仔罝、五味子醇乙、當歸?；昝仔罤、五味子酯乙的校正因子為1.414、1.094、0.926、1.031，RSD值分別為1.4%、0.69%、2.9%、2.5%。

2.6 QAMS 系統(tǒng)耐用性考察

2.6.1 波長對相對校正因子的影響 分別考察檢測波長252、254、256 nm 對相對校正因子的影響，結(jié)果戈米辛D、五味子醇乙、當歸?；昝仔罤、五味子酯乙的相對校正因子平均值分別為1.398、1.088、0.939、1.030，RSD值分別為1.9%、0.98%、3.0%，1.9%。表明波長對戈米辛D、五味子醇乙、五味子酯乙的相對校正因子無影響，相較之下對當歸?；昝仔罤 會產(chǎn)生一定影響。

2.6.2 柱溫對相對校正因子的影響 分別考察柱溫30、35、40℃對相對校正因子的影響，結(jié)果戈米辛D、五味子醇乙、當歸?；昝仔罤、五味子酯乙的相對校正因子平均值分別為1.405、1.093、0.940、1.042，RSD值分別為0.68%、0.080%、1.5%、0.91%，表明溫度對相對校正因子無影響。

2.6.3 流速對相對校正因子的影響 分別考察0.7、0.8、0.9 mL·min－1流速對相對校正因子的影響，結(jié)果戈米辛D、五味子醇乙、當歸?；昝仔罤、五味子酯乙的相對校正因子平均值分別為1.413、1.095、0.939、1.042，RSD值分別為0.21%、0.11%、1.2%、0.86%，表明流速對相對校正因子無影響。

2.6.4 色譜柱對校正因子的影響 分別考察Waters XTERRA RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Phenomenex luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）4 種型號色譜柱對戈米辛D、五味子醇乙、當歸?；昝仔罤、五味子酯乙的相對校正因子的影響。測得其平均值分別為1.414、1.096、0.945、1.045，RSD值分別為0.54%、0.19%、1.4%、0.88%，表明色譜柱的型號對相對校正因子無影響。

2.7 待測組分色譜峰定位

采用比較相對保留時間（以五味子醇甲為內(nèi)參物）的方法對5 種木脂素成分進行定位，分別考 察Waters XTERRA RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Phenomenex luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）4 種型號色譜柱對相對保留時間的影響，測得戈米辛D、五味子醇乙、當歸酰基戈米辛H、五味子酯乙的相對保留時間的平均值分別為1.154、1.277、1.456、1.911，RSD值則分別為4.2%、4.0%、2.3%、4.4%。

2.8 QAMS 與外標法結(jié)果的比較

外標法測得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?；昝仔罤、五味子酯乙平均含量為0.325、0.042、0.085、0.057、0.031 mg·g－1，QAMS 測得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?；昝仔罤、五味子酯乙平均含量分別為0.325、0.042、0.084、0.057、0.031 mg·g－1，對兩組數(shù)據(jù)進行t檢驗，P＝0.156，結(jié)果無顯著性差異，顯示QAMS 準確可行。具體結(jié)果見表2。

表2 一測多評與外標法測定結(jié)果比較Tab 2 QAMS method compared with the external standard method

3 討論

在條件摸索時發(fā)現(xiàn)常規(guī)的有機相甲醇或乙腈溶液在本試驗中分別會導致色譜峰分離度差和拖尾嚴重，故采取抽濾超聲混合后甲醇、乙腈比例為 2∶1 的溶液作為有機相。酸度較低的水相則存在色譜峰分離度較差的問題，對比了0.3%、0.5%、1%甲酸水溶液，0.1%醋酸水溶液和0.1%、0.2%磷酸水溶液的譜圖，最終選取了0.2%磷酸水溶液作為水相。提取溶劑對比了70%、80%乙醇，甲醇和正己烷的效果，發(fā)現(xiàn)除了正己烷，采用其他溶劑提取后都會在5 min 之前出現(xiàn)大的雜峰，故選取了正己烷作為提取溶劑?？疾煊袡C相的初始濃度為40%、45%、50%、55%、60%時發(fā)現(xiàn)50%的初始濃度可以讓成分分離達到最佳效果。在前處理條件上比較了超聲時間為30、45、60、120 min 的提取效果，其中60 min 為最優(yōu)提取時間；考察了210、220、230、244、250、254、260、270、280、290、334 nm 波長下的譜圖，綜合考慮分離度和峰面積選取了254 nm 為波長條件；考察了25、50、100 倍提取溶劑的提取效果，確定50 倍即可提取完全；柱溫的高低對分離度有所影響，在考察了30、35、40 ℃后，選取了40℃作為最終柱溫條件；而高速離心和過濾都能達到除去雜質(zhì)的效果，但離心更簡便且在操作中過程中易于保證操作一致性，故選取高速離心進行除雜；同步考察色譜時間（50 ～100 min）和流速（0.35 ～1.0 mL·min－1）對綜合效率和分離度的影響，最終選取了58 min 和0.8 mL·min－1作為色譜時間和流速。

在考察中發(fā)現(xiàn)提取容器的大小和種類并不會對提取率產(chǎn)生影響。由于五味子醇甲以外的4 種成分含量很低，在加樣回收試驗中出現(xiàn)直接加入微量對照品誤差較大的問題，且甲醇和正己烷溶液直接混勻在攪拌和超聲的過程中易出現(xiàn)渾濁影響提取率，所以，先配制和樣品成分含量近似相等的混合對照品儲備液，旋干后在同一容器中加入樣品以制備加樣回收試驗的供試品溶液。在進行QAMS 系統(tǒng)耐用性考察時，參考文獻[13]和2020年版《中國藥典》四部[14]中分析方法驗證指導原則的要求，選取了較小的試驗條件變動范圍。

現(xiàn)有文獻中，通過退行性造模大鼠的行為學研究發(fā)現(xiàn)五味子醇甲可能通過抗氧化作用改善治療阿爾茨海默病的癥狀[15]；采取液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和阿爾茨海默病模型大鼠的研究發(fā)現(xiàn)包含五味子醇甲、戈米辛D 及當歸?；昝仔罤 在內(nèi)的8 種成分為生脈散中主要起神經(jīng)保護作用的質(zhì)量標志物成分[16]。另一項采取液質(zhì)聯(lián)用鑒定技術(shù)和抑郁癥模型小鼠的研究則發(fā)現(xiàn)，五味子醇提物中包括五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?；昝仔罤、五味子酯乙在內(nèi)的14 種木脂素類成分可以上調(diào)與神經(jīng)保護作用相關(guān)的BDNF、TrkB、CREB 信號通路[17]。所以從藥理機制上推測，本研究中涉及到的這5 個成分有可能在小兒黃龍顆粒治療ADHD 的過程中起到一定作用，因此，建立一套完整的多指標成分含量測定方法具有研究意義。在提高本方法實用性方面，考慮到當歸?；昝仔罤 和戈米辛D 對照品價格較貴，難以獲取，故采用價格低廉的常見對照品五味子醇甲作為內(nèi)參物，建立了QAMS 同時測定5 個成分的含量，填補了小兒黃龍顆粒質(zhì)量標準的空白。