劉晶,游龍?zhí)虊羧?,張志勤,白杰,姚宇,吳慧敏,倪健(北京中醫(yī)藥大學,北京 100029)
小兒黃龍顆粒是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準上市的一款治療注意缺陷與多動障礙(attention deficit and hyperactivity disorder,ADHD)的中藥復(fù)方顆粒。它由熟地黃、白芍、麥冬、知母、五味子、煅龍骨、煅牡蠣、黨參、石菖蒲、遠志及桔梗11 味中藥組成。而目前關(guān)于小兒黃龍顆粒的研究僅限于臨床試驗和藥理實驗[1-10],其質(zhì)量標準和藥物作用機制領(lǐng)域還有待開發(fā)?,F(xiàn)已有研究將五味子中的木脂素類成分用于ADHD 的治療[11],同時這類成分被證明對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用,并能改善患者認知能力和記憶能力[12],所以具有較高的單獨研究價值。而小兒黃龍顆粒作為上市藥品已在臨床試驗中證明其對于ADHD 的療效,故本試驗選取這5 個含量相對較高、且有研究證明其神經(jīng)保護性的木脂素類成分建立含量測定方法。并選擇容易獲取,價格相對低廉的五味子醇甲作為內(nèi)參物,建立同時測定五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸酰基戈米辛H、五味子酯乙5 種成分的一測多評法(QAMS),實現(xiàn)該藥物質(zhì)量評價的進一步延展。
島津LC-20AT 高效液相色譜儀(日本島津);KQ5200DA 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司);Sartorius BT 125D 電子天平(德國賽多利斯集團);G20 型高速醫(yī)用離心機(北京白洋醫(yī)療器械有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA(上海振捷實驗有限公司)。乙腈、甲醇(色譜級,F(xiàn)isher Scientific);娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司);正己烷、甲醇(分析純,天津市大茂化工廠);磷酸(分析純,北京化工廠);小兒黃龍顆粒(重慶希爾安藥業(yè)有限公司,批號:190701);對照品五味子醇甲(批號:Y13D8H5095)、戈米辛D(批號:M05J9S65019)、五味子醇乙(批號:P4N10F103016)、當歸?;昝仔罤(批號:P17J9F65870)、五味子酯乙(批號:P07M6S1)(上海源葉生物科技有限公司,HPLC ≥98%)。
Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相:甲醇-乙腈(2∶1)(A)-0.2%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0 ~30 min,50%→65%A;30 ~58 min,65%~70%A)流速0.8 mL·min-1,柱溫40℃,波長254 nm,進樣量10 μL。色譜圖見圖1。
取一定量的五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?;昝仔罤、五味子酯乙對照品,制成質(zhì)量濃度為137.68、19.20、43.20、29.72、8.64 μg·mL-1的混合對照品溶液。
取小兒黃龍顆粒1 g,用5 mL 純凈水振搖溶解,再加入50 mL 正己烷,充分攪拌后超聲提取60 min(超聲功率200 W,40 Hz),用正己烷補足失重,6000 r·min-1,離心10 min,取上層澄清溶液放入雞心瓶內(nèi),40 ℃減壓濃縮至干,用甲醇復(fù)溶定容至10 mL 量瓶中。溶液過0.22 μm 微孔濾膜,取續(xù)濾液進樣。
圖1 小兒黃龍顆粒樣品的HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of Xiaoer Huanglong granule
2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液,逐級稀釋,進樣測定,以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標X(μg·mL-1),峰面積為縱坐標Y,求得線性回歸方程,結(jié)果見表1。
表1 5 種木脂素成分的線性關(guān)系考察Tab 1 Linear relation of 5 lignans
2.4.2 精密度試驗 取“2.2”項下混合對照品溶液,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次,五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?;昝仔罤、五味子酯乙峰面積RSD值分別為0.070%、0.30%、0.060%、0.43%、0.20%,出峰時間的RSD值分別為0.32%、0.24%、0.19%、0.12%、0.070%。
2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份樣品溶液(批號:190701),按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、16、18、24 h進樣。五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸酰基戈米辛H、五味子酯乙峰面積RSD值分別為2.7%、2.4%、2.0%、3.5%、1.5%,出峰時間的RSD值分別為0.35%、0.32%、0.30%、0.21%、0.23%。
2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一批(批號:190701)小兒黃龍顆粒,按“2.3”項下方法制備6 份樣品,分別精密吸取10 μL 進樣。測得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸酰基戈米辛H、五味子酯乙平均含量的RSD值分別為2.3%、1.9%、2.2%、2.6%、0.82%。
2.4.5 加樣回收試驗 取同一批(批號:190701)小兒黃龍顆粒(五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?;昝仔罤、五味子酯乙含量分別為0.215、0.028、0.056、0.038、0.021 mg),再加入含量相近的5 種對照品(五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?;昝仔罤、五味子酯乙含量為0.219、0.029、0.057、0.038、0.021 mg),按“2.3”項下方法制備6 份樣品,分別精密吸取10 μL 進樣。測得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?;昝仔罤、五味子酯乙平均回收率為96.7%、102.2%、95.9%、100.5%、102.9%,其RSD值分別為3.6%、2.8%、2.9%、1.7%、3.7%。
根據(jù)相對校正因子計算公式:fi/s=fi/fs=(Ci/Ai)/(Cs/As)=(Ci×As)/(Cs×Ai),以多點校正法進行計算。選定五味子醇甲為內(nèi)參物,則fi、Ci、Ai分別為五味子醇甲的相對校正因子、濃度及峰面積,而fs、Cs及As則為待測成分的校正因子、濃度及峰面積,同時選取“2.4.1”項下線性系列濃度與峰面積進行計算。可得戈米辛D、五味子醇乙、當歸?;昝仔罤、五味子酯乙的校正因子為1.414、1.094、0.926、1.031,RSD值分別為1.4%、0.69%、2.9%、2.5%。
2.6.1 波長對相對校正因子的影響 分別考察檢測波長252、254、256 nm 對相對校正因子的影響,結(jié)果戈米辛D、五味子醇乙、當歸酰基戈米辛H、五味子酯乙的相對校正因子平均值分別為1.398、1.088、0.939、1.030,RSD值分別為1.9%、0.98%、3.0%,1.9%。表明波長對戈米辛D、五味子醇乙、五味子酯乙的相對校正因子無影響,相較之下對當歸?;昝仔罤 會產(chǎn)生一定影響。
2.6.2 柱溫對相對校正因子的影響 分別考察柱溫30、35、40℃對相對校正因子的影響,結(jié)果戈米辛D、五味子醇乙、當歸?;昝仔罤、五味子酯乙的相對校正因子平均值分別為1.405、1.093、0.940、1.042,RSD值分別為0.68%、0.080%、1.5%、0.91%,表明溫度對相對校正因子無影響。
2.6.3 流速對相對校正因子的影響 分別考察0.7、0.8、0.9 mL·min-1流速對相對校正因子的影響,結(jié)果戈米辛D、五味子醇乙、當歸?;昝仔罤、五味子酯乙的相對校正因子平均值分別為1.413、1.095、0.939、1.042,RSD值分別為0.21%、0.11%、1.2%、0.86%,表明流速對相對校正因子無影響。
2.6.4 色譜柱對校正因子的影響 分別考察Waters XTERRA RP18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Phenomenex luna C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent Eclipse Plus-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)4 種型號色譜柱對戈米辛D、五味子醇乙、當歸?;昝仔罤、五味子酯乙的相對校正因子的影響。測得其平均值分別為1.414、1.096、0.945、1.045,RSD值分別為0.54%、0.19%、1.4%、0.88%,表明色譜柱的型號對相對校正因子無影響。
采用比較相對保留時間(以五味子醇甲為內(nèi)參物)的方法對5 種木脂素成分進行定位,分別考 察Waters XTERRA RP18(4.6 mm×250 mm,5 μm),Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),Phenomenex luna C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),Agilent Eclipse Plus-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)4 種型號色譜柱對相對保留時間的影響,測得戈米辛D、五味子醇乙、當歸?;昝仔罤、五味子酯乙的相對保留時間的平均值分別為1.154、1.277、1.456、1.911,RSD值則分別為4.2%、4.0%、2.3%、4.4%。
外標法測得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?;昝仔罤、五味子酯乙平均含量為0.325、0.042、0.085、0.057、0.031 mg·g-1,QAMS 測得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?;昝仔罤、五味子酯乙平均含量分別為0.325、0.042、0.084、0.057、0.031 mg·g-1,對兩組數(shù)據(jù)進行t檢驗,P=0.156,結(jié)果無顯著性差異,顯示QAMS 準確可行。具體結(jié)果見表2。
表2 一測多評與外標法測定結(jié)果比較Tab 2 QAMS method compared with the external standard method
在條件摸索時發(fā)現(xiàn)常規(guī)的有機相甲醇或乙腈溶液在本試驗中分別會導(dǎo)致色譜峰分離度差和拖尾嚴重,故采取抽濾超聲混合后甲醇、乙腈比例為 2∶1 的溶液作為有機相。酸度較低的水相則存在色譜峰分離度較差的問題,對比了0.3%、0.5%、1%甲酸水溶液,0.1%醋酸水溶液和0.1%、0.2%磷酸水溶液的譜圖,最終選取了0.2%磷酸水溶液作為水相。提取溶劑對比了70%、80%乙醇,甲醇和正己烷的效果,發(fā)現(xiàn)除了正己烷,采用其他溶劑提取后都會在5 min 之前出現(xiàn)大的雜峰,故選取了正己烷作為提取溶劑??疾煊袡C相的初始濃度為40%、45%、50%、55%、60%時發(fā)現(xiàn)50%的初始濃度可以讓成分分離達到最佳效果。在前處理條件上比較了超聲時間為30、45、60、120 min 的提取效果,其中60 min 為最優(yōu)提取時間;考察了210、220、230、244、250、254、260、270、280、290、334 nm 波長下的譜圖,綜合考慮分離度和峰面積選取了254 nm 為波長條件;考察了25、50、100 倍提取溶劑的提取效果,確定50 倍即可提取完全;柱溫的高低對分離度有所影響,在考察了30、35、40 ℃后,選取了40℃作為最終柱溫條件;而高速離心和過濾都能達到除去雜質(zhì)的效果,但離心更簡便且在操作中過程中易于保證操作一致性,故選取高速離心進行除雜;同步考察色譜時間(50 ~100 min)和流速(0.35 ~1.0 mL·min-1)對綜合效率和分離度的影響,最終選取了58 min 和0.8 mL·min-1作為色譜時間和流速。
在考察中發(fā)現(xiàn)提取容器的大小和種類并不會對提取率產(chǎn)生影響。由于五味子醇甲以外的4 種成分含量很低,在加樣回收試驗中出現(xiàn)直接加入微量對照品誤差較大的問題,且甲醇和正己烷溶液直接混勻在攪拌和超聲的過程中易出現(xiàn)渾濁影響提取率,所以,先配制和樣品成分含量近似相等的混合對照品儲備液,旋干后在同一容器中加入樣品以制備加樣回收試驗的供試品溶液。在進行QAMS 系統(tǒng)耐用性考察時,參考文獻[13]和2020年版《中國藥典》四部[14]中分析方法驗證指導(dǎo)原則的要求,選取了較小的試驗條件變動范圍。
現(xiàn)有文獻中,通過退行性造模大鼠的行為學研究發(fā)現(xiàn)五味子醇甲可能通過抗氧化作用改善治療阿爾茨海默病的癥狀[15];采取液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和阿爾茨海默病模型大鼠的研究發(fā)現(xiàn)包含五味子醇甲、戈米辛D 及當歸酰基戈米辛H 在內(nèi)的8 種成分為生脈散中主要起神經(jīng)保護作用的質(zhì)量標志物成分[16]。另一項采取液質(zhì)聯(lián)用鑒定技術(shù)和抑郁癥模型小鼠的研究則發(fā)現(xiàn),五味子醇提物中包括五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當歸?;昝仔罤、五味子酯乙在內(nèi)的14 種木脂素類成分可以上調(diào)與神經(jīng)保護作用相關(guān)的BDNF、TrkB、CREB 信號通路[17]。所以從藥理機制上推測,本研究中涉及到的這5 個成分有可能在小兒黃龍顆粒治療ADHD 的過程中起到一定作用,因此,建立一套完整的多指標成分含量測定方法具有研究意義。在提高本方法實用性方面,考慮到當歸?;昝仔罤 和戈米辛D 對照品價格較貴,難以獲取,故采用價格低廉的常見對照品五味子醇甲作為內(nèi)參物,建立了QAMS 同時測定5 個成分的含量,填補了小兒黃龍顆粒質(zhì)量標準的空白。