基于脂肪棕色化探究大黃素對老齡小鼠脂質代謝的影響

寧一博，程龍，黃芷棋，賀潤鋮，孫建寧，董世芬（北京中醫(yī)藥大學中藥學院中藥藥理系，北京 102488）

全球老齡化已成為不可逆轉的趨勢，預計2050年我國老齡人口數(shù)將達到5.25 億，占總人口數(shù)的32%，肥胖癥、高血壓、動脈粥樣硬化、2 型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生率隨之增加，老齡化及相關疾病的研究成為熱點[1]。研究顯示，機體代謝能力隨年齡增加有降低趨勢，有害脂質易產(chǎn)生沉積[2]。

目前發(fā)現(xiàn)哺乳動物體內(nèi)存在3 種脂肪組織，分別為白色脂肪組織（WAT）、棕色脂肪組織（BAT）和米色脂肪組織。WAT 根據(jù)分布位置的不同又分為皮下WAT 和內(nèi)臟WAT 等[3]。WAT 是儲能器官，主要由白色脂肪細胞構成，可將體內(nèi)多余的能量以三酰甘油（TG）的形式儲存，而BAT 主要參與體溫調(diào)節(jié)和能量代謝，通過加快脂肪氧化來促進機體能量消耗[4]。米色脂肪組織通常存在于WAT 當中，但具有與棕色脂肪細胞類似的形態(tài)和功能[5]。脂肪組織不僅是儲能器官同時也是一種活躍的內(nèi)分泌器官，可分泌瘦素（LEP）、脂聯(lián)素（ADPN）、抵抗素等脂肪因子，并參與全身能量代謝、脂質代謝[6]。衰老過程中脂肪組織發(fā)生重塑，白色脂肪堆積，褐變能力降低，并產(chǎn)生胰島素抵抗[7]。脂肪組織特異性功能障礙可誘發(fā)老年機體能量穩(wěn)態(tài)失衡，并加劇衰老以及相關疾病如動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等的進程[8-9]。

大黃素（emodin）是一種蒽醌類衍生物，是中藥大黃等的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂和免疫抑制等作用[10]，對結腸癌[11]、子宮內(nèi)膜癌[12]、肝癌[13]等多種惡性腫瘤具有抑制作用。大黃素可降低高脂飲食小鼠體質量，降低血脂、肝臟膽固醇和三酰甘油（TG）水平[14]；體外研究顯示，大黃素可抑制3T3-L1 前脂肪細胞增殖及分化，減少脂質蓄積[15]。本研究基于脂肪棕色化探究大黃素對老齡小鼠脂質代謝的影響。

1 材料

1.1 實驗動物

40 只10月齡SPF 級C57BL/6J 小鼠，雌雄各半，體質量（30±2）g [北京華阜康生物技術有限公司，SCXK（京）2014-0004]。10 只8 周齡SPF級C57BL/6J 小鼠，雌雄各半，體質量（20±2）g[斯貝福（北京）生物技術有限公司，SCXK（京）2016-0002]。所有小鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學屏障環(huán)境動物實驗室[許可證號SYXK（京）2016-0038，且均通過北京中醫(yī)藥大學醫(yī)學與實驗動物倫理委員會審批]。

1.2 試藥

大黃素（批號：T02S8F42983）、羅格列酮（批號：Y05F9C54480）（上海源葉生物科技有限公司）；總膽固醇（TC）、TG、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；ADPN、LEP 的ELISA 試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）；游離脂肪酸（FFA）ELISA 試劑盒（江蘇科特生物技術有限公司，批號：201812）；解偶聯(lián)蛋白-1（UCP1)一 抗（英國Abcam 公司，批號：GR3188478-6）；HRP 山羊抗兔（批號：GB23303）、檸檬酸抗原修復液（批號：G1202）、蘇木素染液（批號：G1004）、DAB 顯色液（批號：G1211）、蘇木素分化液（批號：G1039）（武漢塞維爾生物科技有限公司）；蘇木素-伊紅染液（武漢谷歌生物科技，批號：G1005）。

1.3 儀器

JB-L5 冷凍臺、JB-P5 包埋機、JJ-12J 脫水機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016 病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；S/N601-0723 全波長酶標儀（江蘇萬科科教儀器有限公司）；DHG-9140A烤箱（上?；厶﹥x器制造有限公司）；NIKON ECLIPSE CI 顯微鏡（日本尼康公司）。

2 方法

2.1 實驗動物分組、造模及給藥

40 只10月齡SPF 級雌雄各半C57BL/6J 小鼠普通飼料喂養(yǎng)8 周后，將其隨機分為老齡組、大黃素40 mg·kg－1組、大黃素80 mg·kg－1組和羅格列酮10 mg·kg－1組，每組10 只。另設10 只雌雄各半8周齡SPF 級C57BL/6J 小鼠為非老齡組。老齡組和非老齡組小鼠每日給予相同溶媒（飲用水）灌胃。大黃素組小鼠分別按照40 mg·kg－1、80 mg·kg－1，羅格列酮組小鼠按照10 mg·kg－1劑量灌胃給藥，灌胃容積0.1 mL/10 g，連續(xù)灌胃給藥6 周。

2.2 取材

末次給藥后，動物禁食12 h，麻醉，摘眼球取血，3500 r·min－1離心10 min，分離血清。并分離小鼠皮下腹股溝白色脂肪組織（iWAT）以及肩胛處BAT，固定在10% 中性福爾馬林固定液中。

2.3 脂肪組織質量與體質量比值的測定

精確稱取小鼠皮下iWAT 以及肩胛處BAT 質量，計算iWAT 與體質量，肩胛處BAT 質量與體質量的比值。

2.4 血脂相關指標檢測

按照試劑盒說明書測定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、LEP、ADPN 和FFA 的含量。

2.5 HE 染色觀察脂肪細胞形態(tài)變化

將固定在10%中性福爾馬林固定液中的iWAT、BAT 取出依次進行常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

2.6 免疫組化檢測脂肪組織UCP1 表達

石蠟切片進行常規(guī)脫蠟，將iWAT、BAT 切片放在抗原修復緩沖液中進行修復，在iWAT、BAT 切片上滴加3%雙氧水溶液，避光室溫孵育25 min，0.01 mol·L－1PBS 洗3 次，在切片上滴加山羊血清封閉1 h。在切片上滴加稀釋好的一抗溶液（1∶500），將切片放入濕盒內(nèi)4 ℃過夜。滴加稀釋好的二抗，37℃孵育20 min，DAB 顯色，蘇木素復染3 min，常規(guī)脫水，中性樹膠封片。通過Image-Pro Plus 6.0 軟件，選取棕黃色處為陽性著色，對陽性表達處進行AOD 分析，計算脂肪組織UCP1 蛋白原位表達。

2.7 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學處理采用SAS8.2 軟件進行，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差（±s）表示，對于正態(tài)數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析法（ANOVA），兩組間比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大黃素對老齡小鼠體質量的影響

與非老齡組比較，老齡組小鼠體質量顯著升高（P＜0.01）；與老齡組比較，大黃素40 mg·kg－1和80 mg·kg－1組給藥后體質量無明顯變化（P＞0.05）（見圖1）。

圖1 大黃素對老齡小鼠體質量的影響（±s，n ＝10）Fig 1 Effect of emodin on body mass of aging mice（±s，n ＝10）

3.2 大黃素對老齡小鼠脂肪比重的影響

與非老齡組比較，老齡組小鼠肩胛處BAT 質量與體質量比值有降低趨勢（P＞0.05），皮下iWAT 質量與體質量比值升高（P＜0.01）；大黃素及羅格列酮干預對小鼠皮下脂肪比重未見顯著影響（P＞0.05）（見圖2）。

圖2 大黃素對老齡小鼠脂肪質量與體質量比值的影響（±s，n＝10）Fig 2 Effect of emodin on the ratio of BAT and iWAT to body weight in aging mice（±s，n ＝10）

3.3 大黃素對老齡小鼠血脂相關指標的影響

與非老齡組比較，老齡組小鼠血清中TC、TG和FFA 含量顯著升高（P＜0.01）；與老齡組小鼠比較，大黃素40 mg·kg－1和80 mg·kg－1組小鼠血清中TC、TG 含量分別降低40%、39%和41%、33%（P＜0.01）；大黃素40 mg·kg－1組血清中FFA 含量降低18%（P＜0.05）（見圖3）。

圖3 大黃素對老齡小鼠血清中血脂相關指標的影響（±s，n ＝10）Fig 3 Effect of emodin on blood lipids in aging mice（±s，n ＝10）

3.4 大黃素對老齡小鼠脂肪因子的影響

與非老齡組比較，老齡組小鼠血清中LEP 含量顯著升高（P＜0.05），大黃素對老齡動物血清LEP 水平未見顯著影響。與非老齡組比較，老齡組小鼠血清ADPN 水平顯著降低（P＜0.05），大黃素40 mg·kg－1和80 mg·kg－1可顯著升高老齡動物血清ADPN 水平，分別升高33%和44%（P＜0.05）（見圖4）。

3.5 老齡小鼠BAT 及iWAT 的HE 染色結果

圖4 大黃素對老齡小鼠血清中LEP 及ADPN 的影響（±s，n ＝10）Fig 4 Effect of emodin on LEP and ADPN in the serum of aging mice（±s，n ＝10）

HE 染色結果顯示，與非老齡組比較，老齡組小鼠BAT 細胞直徑較大，細胞白色化趨勢顯著；與老齡組小鼠相比，大黃素40、80 mg·kg－1組及羅格列酮10 mg·kg－1組小鼠BAT 較為緊密，細胞變小，細胞核明顯，細胞間具有豐富的毛細血管。在iWAT 中，與非老齡組比較，老齡組小鼠脂肪組織較為松散，脂肪細胞直徑較大，白色脂肪特征明顯；與老齡組相比，大黃素40、80 mg·kg－1組及羅格列酮10 mg·kg－1組小鼠皮下白色脂肪細胞變小，棕色化趨勢顯著（見圖5）。

3.6 大黃素對老齡小鼠BAT、iWAT 部位UCP1蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示，與非老齡組比較，老齡組小鼠BAT 中UCP1 陽性細胞表達顯著減少（P＜0.01）；與老齡組比較，大黃素40、80 mg·kg－1組及羅格列酮10 mg·kg－1組UCP1 陽性細胞表達明顯增多（P＜0.01）。在iWAT 中，老齡組UCP1 陽性細胞表達明顯減少（P＜0.01）；與老齡組比較，大黃素40、80 mg·kg－1組及羅格列酮10 mg·kg－1組UCP1 陽性細胞表達明顯增多（P＜0.05 或P＜0.01）（見圖6）。

4 討論

老年機體常伴隨脂質代謝的異常，表現(xiàn)為脂質異位沉積、血液黏稠度增加等，高脂血癥是肥胖癥、動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等疾病的重要易感因素[16]。脂肪組織在維持全身脂質穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，脂肪組織以TG 的形式存儲能量，當機體需要能量時，TG 分解為FFA 和甘油提供能量[17]。WAT 脂解產(chǎn)生的脂肪酸可在肝臟內(nèi)合成極低密度脂蛋白（VLDL），VLDL 進入循環(huán)后轉變?yōu)長DL，LDL 是誘發(fā)動脈粥樣硬化的因素之一[18]。過量的血清脂肪酸可能會誘發(fā)炎癥反應，從而導致胰島素抵抗[19]。此外，脂肪細胞大小是血脂和胰島素穩(wěn)態(tài)變化的重要預測因子，其變化可增加患心血管疾病的風險[20]。

本實驗中，與非老齡組比較，老齡組小鼠血清TC、TG、FFA 含量顯著增加，同時可以觀察到皮下白色脂肪細胞更加肥大，棕色脂肪細胞“白色化”更加明顯。與老齡組比較，大黃素40 mg·kg－1、80 mg·kg－1組小鼠血清TC、TG 含量顯著下降，大黃素40 mg·kg－1組小鼠血清FFA 含量顯著降低。此外，大黃素干預組小鼠血清中脂肪因子ADPN 水平明顯升高。ADPN 主要由脂肪細胞分泌，具有增加胰島素敏感性并直接改善脂肪組織脂質代謝的作用[21]。LEP 主要由皮下脂肪細胞分泌，可作用于神經(jīng)及免疫系統(tǒng)，具有降低體質量、調(diào)節(jié)能量代謝和促進WAT 褐變的作用[22-23]。LEP 水平與脂肪組織質量具有相關性，老年機體白色脂肪堆積導致LEP 水平升高，持續(xù)高水平的LEP 導致其利用率降低進而產(chǎn)生LEP 抵抗[24]。本研究結果顯示老齡動物血清LEP 水平升高，大黃素對LEP 未見明顯調(diào)節(jié)作用。

BAT 是高度血管化和神經(jīng)支配的組織，在嚙齒類動物中主要存在于肩胛處、腎周圍和主動脈周區(qū)，棕色脂肪細胞具有多室脂滴和大量的線粒體以及豐富的交感神經(jīng)和毛細血管[25]。UCP1 是位于棕色脂肪細胞線粒體內(nèi)膜上的蛋白，是BAT產(chǎn)熱的必需蛋白[26]。UCP1 可破壞線粒體內(nèi)膜兩側的H＋濃度，使氧化與磷酸化解偶聯(lián)，能量以熱能的形式釋放[27]。BAT 可加快脂肪的氧化產(chǎn)熱，增加機體的能量代謝，從而消除脂肪組織功能障礙[28]。BAT 可吸收血液中富含TG 的脂蛋白釋放的脂肪酸，儲存在細胞內(nèi)，作為H＋的同向轉運體激活UCP1 促進產(chǎn)熱，同時降低血清TG水平并增加肝臟VLDL 殘留清除率[28]。在β-腎上腺素能受體激動劑或冷暴露下，原本具有白色脂肪細胞特征的脂肪細胞脂滴逐漸增多、線粒體數(shù)量增加、UCP1 大量表達、產(chǎn)熱增加，表現(xiàn)出棕色脂肪細胞樣形態(tài)及功能，這個過程稱為“白色脂肪棕色化”[29]，目前WAT 褐變成為改善相關代謝疾病的潛在靶標。本實驗中HE 染色結果顯示，與老齡組相比，大黃素40 mg·kg－1、80 mg·kg－1組小鼠白色脂肪細胞出現(xiàn)多室，細胞變小變圓細胞更加致密，具有明顯的“褐變”趨勢，同時棕色脂肪細胞分布明顯增多，細胞間毛細血管更加豐富，大黃素可顯著增加iWAT 及BAT 中UCP1 的表達。

綜上，老齡小鼠可出現(xiàn)脂質代謝紊亂，WAT比重增加，脂肪呈現(xiàn)白色化趨勢；大黃素可改善老齡動物的脂質代謝紊亂，作用可能與抑制白色脂肪，減少周圍脂質釋放，促進脂肪棕色化，改善能量代謝有關。

圖5 大黃素對老齡小鼠脂肪組織形態(tài)的影響（HE 染色，×400）Fig 5 Effect of emodin on the morphology of adipose tissue in aging mice（HE staining，×400）

圖6 大黃素對老齡小鼠脂肪組織UCP1 蛋白表達的影響（±s，n ＝10）Fig 6 Effect of emodin on the expression of UCP1 protein in adipose tissue of aging mice（±s，n ＝10）