羅曦,李天嬌,2,3,包永睿,2,3,王帥,2,3,孟憲生,2,3*(.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,遼寧 大連 6600;2.遼寧省中藥多維分析專(zhuān)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心,遼寧 大連 6600;3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 6600)
枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí),歸脾、胃經(jīng),具有理氣寬中、行滯消脹的功效[1],最早記載于南北朝《雷公炮炙論》[2],主要含有黃酮類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、香豆素類(lèi)和生物堿類(lèi)等化學(xué)成分[3],具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性[4]。結(jié)腸癌是消化道腫瘤中常見(jiàn)的惡性腫瘤,中醫(yī)理論認(rèn)為,“邪之所湊,其氣必虛”,脾胃虛弱是結(jié)腸癌的病理基礎(chǔ),西醫(yī)治療方法手術(shù)和化療可能會(huì)進(jìn)一步損傷脾胃功能,故中醫(yī)藥治療結(jié)腸癌以健脾理氣為主要方法[5]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,中醫(yī)臨床治療結(jié)腸癌的處方中經(jīng)常出現(xiàn)理氣藥枳殼[6-8],但其抗結(jié)腸腫瘤方面的相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)基于人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 體外藥效實(shí)驗(yàn),通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以HT-29 細(xì)胞抑制率為指標(biāo),對(duì)枳殼治療結(jié)腸腫瘤藥效物質(zhì)組分的提取工藝進(jìn)行篩選,并結(jié)合層次分析法,優(yōu)選可代替藥效指標(biāo)綜合評(píng)分的權(quán)重系數(shù),以期為枳殼合理利用、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究提供前期基礎(chǔ)。
UV-1750 型紫外分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司);HSS 型電子恒溫水浴鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);YJ-200A 型高速中藥粉碎機(jī)(億健品牌);JE1002 電子天平(上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司);Mettler Toledo ME55 分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)NUAIRE 公司);倒置顯微鏡(德國(guó)麥克奧迪公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Drvices 公司);枳殼藥材(亳州市康美中藥有限公司,批號(hào):20200716,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí));蘆丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究所,批號(hào):100080-201418,供含量測(cè)定用);無(wú)水乙醇(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);胎牛血清、McCoy’s 5A 培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國(guó)GIBCO 公司);青霉素/鏈霉素溶液、CCK-8 增強(qiáng)型溶液(Meilunbio 公司)。
人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù))。
2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取蘆丁對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,用無(wú)水乙醇溶解稀釋成質(zhì)量濃度為0.15 mg·mL-1的對(duì)照品溶液,備用。
2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH 比色法[9],精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液2 mL置于10 mL 量瓶中,依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.50 mL,振搖后靜置6 min,加入10%硝酸鋁溶液0.30 mL,搖勻,靜置6 min,再加入4%氫氧化鈉溶液2 mL,加30%乙醇至刻度,混合搖勻,靜置15 min。不加蘆丁對(duì)照品按照以上方法制備空白對(duì)照,在400 ~750 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描,結(jié)果對(duì)照品溶液在510 nm 處有最大吸收,故確定510 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。
2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 蘆丁對(duì)照品溶液,置于10 mL量瓶中,依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.50 mL,振搖后靜置6 min,加入10%硝酸鋁溶液0.30 mL,搖勻,靜置6 min,再加入4% 氫氧化鈉溶液2 mL,加30% 乙醇至刻度,混合搖勻,靜置15 min。在 510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以蘆丁含量為橫坐標(biāo)(X),吸光度為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行回歸,得方程為A=0.0011X-0.0069(r=0.9996)。結(jié)果顯示,蘆丁在 0 ~600 μg·mL-1內(nèi)與吸光度A呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29,按貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法,接種于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、1% 雙抗的McCoy’s 5A 培養(yǎng)基中,在溫度為 37 ℃、5% CO2、濕度為70%~80%的條件下常規(guī)培養(yǎng)。隔日換液、傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2.2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29,用含0.25% EDTA 的胰蛋白酶消化,以 7500 cell /孔的密度接種于96 孔板,設(shè)調(diào)零孔、空白孔和加藥實(shí)驗(yàn)孔。于37℃、5% CO2、濕度為70%~80% 的條件培養(yǎng)24 h 后,加藥實(shí)驗(yàn)組加入樣品溶液100 μL,空白對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液(每組5 個(gè)復(fù)孔),繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后,采用CCK-8 法,用酶標(biāo)儀在450 nm 處掃描,測(cè)定吸光度(OD)。計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率,細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。
2.3.1 乙醇濃度單因素考察 對(duì)水、30%、50%、75%、95% 乙醇進(jìn)行考察,結(jié)果黃酮含量分別為3.42%、4.01%、4.99%、5.39%、5.02%。表明75%乙醇對(duì)枳殼黃酮類(lèi)成分的提取率最高,因此選用75%乙醇作為最佳提取溶劑。
2.3.2 正交設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)[10],取枳殼適量,60℃下烘干后粉碎,精密稱(chēng)取9 份過(guò)40目的枳殼藥材粉末,每份5 g,采用75%乙醇為提取溶劑進(jìn)行提取,選擇溶劑用量(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)作為影響因素,每個(gè)因素取3個(gè)水平,進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1。精密稱(chēng)取9 組正交實(shí)驗(yàn)獲得的提取物粉末,配制成0.01 g(生藥)·mL-1濃度的含藥培養(yǎng)液,作用于HT-29 細(xì)胞,以細(xì)胞抑制率為指標(biāo),優(yōu)選提取工藝,正交結(jié)果見(jiàn)表2,方差分析見(jiàn)表3。
表1 因素水平Tab 1 Factor and level
表2 正交設(shè)計(jì)直觀分析Tab 2 Orthogonal design visual analysis
表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance
以人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞抑制率為指標(biāo),直觀分析及方差分析影響提取工藝的因素順序?yàn)锳 >B >C,其中溶劑用量(A)、提取時(shí)間(B)對(duì)細(xì)胞抑制率影響較大(P<0.05),為主要因素;提取溫度(C)影響較小。由于提取時(shí)間(B)也是影響提取工藝的主要因素,故為驗(yàn)證優(yōu)選提取時(shí)間的準(zhǔn)確性,在其他提取條件均為最優(yōu)時(shí),對(duì)其進(jìn)行單因素考察。分別對(duì)2、2.5、3 h 進(jìn)行單因素考察,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞抑制率分別為 77.04%、79.17%、79.51%,為提高生產(chǎn)效率,確定提取時(shí)間為2.5 h。綜上所述,結(jié)合抑制率結(jié)果篩選出最佳提取條件為A2B2C2,即25 倍量75%乙醇,在75℃下提取2.5 h。
以黃酮含量和出膏率為指標(biāo),評(píng)價(jià)枳殼治療結(jié)腸腫瘤藥效物質(zhì)組分的提取工藝,建立評(píng)價(jià)目標(biāo)模型,結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 枳殼治療結(jié)腸腫瘤藥效物質(zhì)組分提取工藝評(píng)價(jià)模型Fig 1 Evaluation model of extraction process of effective components from Fructus aurantii for colon tumor
通過(guò)比較同一層次目標(biāo)(黃酮含量和出膏率)的相對(duì)重要程度,構(gòu)成一系列兩兩比較矩陣。利用Analytic Hierarchy Process(AHP)軟件,計(jì)算權(quán)重系數(shù)隨機(jī)一致性比率CR(CR=CI/RI),其可作為衡量所得權(quán)重系數(shù)是否合理的指標(biāo),得到9 組CR=0.0000 <0.1,即認(rèn)為矩陣具有滿意的一致性,表明9 組權(quán)重系數(shù)合理有效,可用于提取工藝優(yōu)選的綜合評(píng)分中,見(jiàn)表4。
表4 兩種指標(biāo)在不同重要程度下的權(quán)重系數(shù)Tab 4 Weight coefficient of two indexes in diffrent importance degree
按照各指標(biāo)不同的權(quán)重系數(shù)來(lái)計(jì)算綜合評(píng)分,作為提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo),以“比較重要”為例,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表5 和表6 [綜合評(píng)分1 =(黃酮含量/最大黃酮含量)×0.8333 +(出膏率/最大出膏率)×0.1667;綜合評(píng)分2 =(黃酮含量/最大黃酮含量)×0.1667 +(出膏率/最大出膏率)×0.8333]。
以綜合評(píng)分1 為指標(biāo),直觀分析及方差分析影響提取工藝的因素順序?yàn)锳 >B >C,其中溶劑用量(A)影響最大(P<0.05),為主要影響因素。提取時(shí)間(B)和提取溫度(C)無(wú)顯著影響,而且 B2 和B3,C2 和C3 結(jié)果相差不大,從提高生產(chǎn)效率和節(jié)約能源角度考慮,確定提取時(shí)間為2.5 h,提取溫度為75℃。
表5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析結(jié)果Tab 5 Orthogonal experiment design and visual analysis
表6 方差分析Tab 6 Analysis of variance
以綜合評(píng)分2 為指標(biāo),直觀分析及方差分析影響提取工藝的因素順序?yàn)?C >A >B,其中提取溫度(C)影響最大(P<0.05),溶劑用量(A)和提取時(shí)間(B)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。從提高生產(chǎn)效率和節(jié)約溶劑角度考慮,優(yōu)選出的工藝條件為A1B1C3,即20 倍量75%乙醇,在80℃下提取2 h。
當(dāng)黃酮含量和出膏率的權(quán)重系數(shù)分別為0.8333、0.1667 時(shí),以綜合評(píng)分1 與細(xì)胞抑制率為指標(biāo)優(yōu)選的最佳提取條件一致,說(shuō)明在此權(quán)重系數(shù)下,兩者的綜合評(píng)分可代替細(xì)胞抑制率,作為枳殼治療結(jié)腸腫瘤藥效物質(zhì)組分提取工藝的考察指標(biāo)。當(dāng)權(quán)重系數(shù)為0.1667、0.8333 時(shí),以綜合評(píng)分2 為指標(biāo)優(yōu)選的最佳提取條件與以細(xì)胞抑制率為指標(biāo)優(yōu)選出的提取工藝不一致。
同時(shí),對(duì)其他權(quán)重系數(shù)計(jì)算綜合評(píng)分,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)直觀分析和方差分析,得到黃酮含量和出膏率最佳的權(quán)重系數(shù)范圍分別為0.75 ~0.90、0.10 ~0.25。在此權(quán)重系數(shù)范圍內(nèi),其綜合評(píng)分可代替細(xì)胞抑制率,作為提取工藝的考察指標(biāo)。
平行稱(chēng)取3 份等量藥材,按照優(yōu)選出的最佳提取工藝,即25 倍量 75% 乙醇,在75℃水浴條件下,回流提取 2.5 h,進(jìn)行提取。黃酮含量分別為6.106%、6.127%、6.149%,出膏率分別為25.92%、25.99%、25.86%,細(xì)胞抑制率分別為73.92%、74.08%、74.15%,3 項(xiàng)指標(biāo)的RSD分別為0.35%、0.25%、0.18%,說(shuō)明優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定可行,且體外藥效穩(wěn)定。選取2 個(gè)權(quán)重系數(shù)范圍內(nèi)外的數(shù)值,對(duì)其綜合評(píng)分與細(xì)胞抑制率進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析[11-14],確定權(quán)重系數(shù)范圍的準(zhǔn)確性和合理性,結(jié)果見(jiàn)表7。
表7 權(quán)重系數(shù)范圍驗(yàn)證結(jié)果Tab 7 Validation of weight coefficient range
根據(jù)前面得出的黃酮含量和出膏率最佳的權(quán)重系數(shù)范圍,通過(guò)Pearson 相關(guān)性分析可知,在確定的權(quán)重系數(shù)范圍內(nèi)(組別1),綜合評(píng)分與細(xì)胞抑制率的相關(guān)系數(shù)較大;在權(quán)重系數(shù)范圍外(組別2),相關(guān)系數(shù)較小,說(shuō)明黃酮含量和出膏率的權(quán)重系數(shù)范圍合理。
枳殼為健脾理氣、寬腸行滯的常用藥,同時(shí)具有抗炎、抗氧化以及抗腫瘤等藥理作用,常被加入“健脾理氣法”治療結(jié)腸癌的中藥處方中使用。目前尚無(wú)其在抗結(jié)腸腫瘤藥效物質(zhì)組分提取工藝方面的報(bào)道,因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行研究,為開(kāi)發(fā)以枳殼為原料的抗腫瘤新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
中藥化學(xué)成分復(fù)雜,且各化學(xué)物質(zhì)組之間相互影響,因此藥效物質(zhì)組的含量與藥效之間不呈線性相關(guān)。若單以藥效物質(zhì)組分的含量為提取工藝的考察指標(biāo),不能保證所選提取工藝的提取物達(dá)到最佳藥效;若單以細(xì)胞抑制率結(jié)果為評(píng)價(jià)指標(biāo),雖能保證藥效,但操作繁瑣費(fèi)時(shí)。因此,本實(shí)驗(yàn)針對(duì)中藥化學(xué)成分的特點(diǎn),運(yùn)用層次分析法[15-18],將枳殼治療結(jié)腸腫瘤藥效物質(zhì)組分提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)構(gòu)成單層次、兩指標(biāo)體系,在主觀判斷的基礎(chǔ)上進(jìn)一步處理,使其在權(quán)重系數(shù)的賦予上更加科學(xué)、合理,同時(shí)建立黃酮含量、出膏率與藥效的關(guān)聯(lián),即通過(guò)細(xì)胞抑制率結(jié)果為指標(biāo)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果,篩選出代替細(xì)胞抑制率的黃酮含量和出膏率綜合指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)及其范圍。本實(shí)驗(yàn)篩選出了影響提取工藝的主要和次要因素,避免了賦予權(quán)重系數(shù)的偶然性,不但能確保提取物的藥效,且避免了復(fù)雜的操作,使工藝更加合理可行。通過(guò)Pearson 相關(guān)性分析可知,在權(quán)重系數(shù)范圍內(nèi),其綜合評(píng)分可代替藥效指標(biāo),作為其抗腫瘤藥效物質(zhì)組分提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)。
本實(shí)驗(yàn)以綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)代替藥效,對(duì)枳殼治療結(jié)腸腫瘤的藥效物質(zhì)組分提取工藝進(jìn)行研究可為其合理開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ),為其治療結(jié)腸腫瘤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)。