基于4種皂苷的定量分析評(píng)價(jià)干燥方式對(duì)菊葉薯蕷有效成分的影響

馬境謙，崔乃菠，余河水，3，李正，，3，劉二偉，別松濤，3*（.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥制藥工程學(xué)院，天津 3067；.組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 3067；3.中藥制藥工程市級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，天津 3067）

干燥是中藥材產(chǎn)地加工的重要環(huán)節(jié)，通過(guò)干燥處理可有效防止中藥霉變、蟲蛀、變色等現(xiàn)象的產(chǎn)生，方便藥材運(yùn)輸及儲(chǔ)藏。歷史文獻(xiàn)中記載了大量的傳統(tǒng)干燥方式[1-2]，其中曬干法和陰干法因成本低、操作簡(jiǎn)單而廣泛應(yīng)用于白芷、紅參、黃芩等藥材的干燥[3-5]。隨著中藥工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，熱風(fēng)干制逐漸受到人們的關(guān)注，因其不受天氣因素制約及干燥時(shí)間、溫度可控等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于山藥、大棗、柴胡、三七、山豆根、五味子等中藥材的干燥[6-8]。

菊葉薯蕷（Dioscorea compositaHemsl.）是薯蕷科薯蕷屬多年生纏繞性草本植物[9]，原產(chǎn)于墨西哥，因用于提取甾體激素藥物起始原料皂素而聞名[10]。菊葉薯蕷的有效成分為根莖中存在的呋甾型與螺甾型甾體皂苷[11-12]，具有祛痰截瘧、化濕利水、解毒消腫等功能，被用于風(fēng)濕麻木、糖尿病、骨質(zhì)疏松、肥胖和高尿酸血癥的治療[13]；同時(shí)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中，菊葉薯蕷的抗炎、抗過(guò)敏、抗菌等藥用作用被不斷開發(fā)[14]。3年生菊葉薯蕷根莖的鮮品，單株重約15 kg，富含水分和淀粉，采挖后不宜儲(chǔ)藏和運(yùn)輸，由于種植規(guī)模及產(chǎn)能的逐漸擴(kuò)大，產(chǎn)地干制工序成為菊葉薯蕷產(chǎn)地加工的關(guān)鍵步驟。當(dāng)前，工業(yè)上多采用將采收后菊葉薯蕷根莖的鮮品去除外部泥沙、切厚片，經(jīng)傳統(tǒng)干燥獲得干片的方式進(jìn)行產(chǎn)地干燥。中藥材干燥的過(guò)程與其藥性的形成密切相關(guān)[15]，目前干燥方式對(duì)菊葉薯蕷皂苷類有效成分的影響未見報(bào)道。

本研究選用云南省會(huì)澤縣3年生菊葉薯蕷根莖鮮品作為實(shí)驗(yàn)材料，采用陰干法、曬干法、60 ℃熱風(fēng)干制的方式，以原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用HPLC-ELSD 的方法測(cè)定其含量變化，篩選出適宜的產(chǎn)地干制方式，旨在為菊葉薯蕷的產(chǎn)地加工及質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695HPLC 色譜系統(tǒng)（四元泵、真空在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和Empower 色譜工作站）、2424 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Waters）；SB-5200DTD 型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；AB135-S 電子分析天平（瑞典 Mettler Toledo 公司）；中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯儀器有限公司）；全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國(guó) Millipore 公司）。

1.2 試藥

原薯蕷皂苷對(duì)照品（批號(hào)：P13A9F58572，純度≥98%）、偽原薯蕷皂苷對(duì)照品（批號(hào)：S07M6L1，純度≥97%）、重樓皂苷Ⅱ 對(duì)照品（批號(hào)：P11A11F73858，純度≥ 98%）、薯蕷皂苷對(duì)照品（批號(hào)：Y20A10Z95575，純度≥98%）（上海源葉生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher 公司）；無(wú)水乙醇（色譜純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。菊葉薯蕷藥材，采自云南省會(huì)澤縣，采收時(shí)間為2020年4月份，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室張麗娟、宋新波教授鑒定為薯蕷科植物Dioscorea compositaHemsl.的根莖鮮品。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同干燥方式下菊葉薯蕷樣品的制備

新鮮的菊葉薯蕷樣品，清水沖洗，洗凈外部泥沙，切厚度為2 ～4 mm 厚片，將菊葉薯蕷片隨機(jī)分成4 組，每組約1000 g，按對(duì)應(yīng)的方式處理，計(jì)算干燥樣品折干率。

第一組為陰干法干制薯蕷，將菊葉薯蕷厚片均勻攤開于篩網(wǎng)中，置于室內(nèi)、陰涼、避光、通風(fēng)處，干燥168 h。

第二組為鮮品薯蕷，切制厚片，不做任何干燥處理。

第三組為曬干法干制薯蕷，將菊葉薯蕷厚片均勻攤開于篩網(wǎng)中，置于室外日光下或光線佳處晾曬，夜間收回，干燥144 h。

第四組為熱風(fēng)干制薯蕷，采用熱風(fēng)干燥的方法制備，60℃，風(fēng)速0.15 m·s－1，干燥48 h。

2.2 菊葉薯蕷中水分、灰分及浸出物測(cè)定

菊葉薯蕷中水分的測(cè)定參照2020年版《中國(guó)藥典》通則0832 項(xiàng)下的烘干法，菊葉薯蕷中灰分的測(cè)定參照2020年版《中國(guó)藥典》通則2302 項(xiàng)下的總灰分測(cè)定法，菊葉薯蕷中浸出物的測(cè)定參照2020年版《中國(guó)藥典》通則2201 項(xiàng)下的水溶性浸出物冷浸法，結(jié)果見表1。

2.3 溶液的制備

表1 不同干燥方式干燥菊葉薯蕷的水分、總灰分、浸出物、干燥時(shí)間、折干率Tab 1 Moisture，ash，extract，drying time and drying rate of Dioscorea composita Hemsl.dried by different drying methods

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取各對(duì)照品適量，加70%乙醇定容至10 mL 量瓶中，分別制成含原薯蕷皂苷1.028 mg·mL－1、偽原薯蕷皂苷1.023 mg·mL－1、重樓皂苷Ⅱ1.026 mg·mL－1、薯蕷皂苷1.024 mg·mL－1的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取適量菊葉薯蕷干片粉碎，過(guò)40 目篩，精密稱定菊葉薯蕷粉末0.67 g，置100 mL 具塞三角瓶中，加70%乙醇50 mL，密塞，精密稱定，超聲提取30 min（功率360 W，頻率40 kHz），放冷后用70%乙醇補(bǔ)足重量，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用。

2.4 色譜條件

色譜柱為Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0 ～5 min，25% ～30%A；5 ～6 min，30% ～31%A；6 ～10 min，31%A；10 ～20 min，31% ～60%A；20 ～30 min，60% ～95%A；30 ～32 min，95%A；32 ～35 min，95%～25%A）；體積流量為1.0 mL·min－1，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30 ℃，檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（漂移管溫度70 ℃，氣體流速2.8 L·min－1）。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取適量“2.3.1”項(xiàng)下的各對(duì)照品溶液，加70%乙醇按照1、2、4、6、10、15 倍稀釋獲得系列梯度的混合對(duì)照品溶液。按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（X），以峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得各成分校正曲線方程，結(jié)果見表2，4 種皂苷在各自線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5.2 檢測(cè)限（LOD）與定量限（LOQ）考察取“2.3.1”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液，用70%乙醇逐步稀釋，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比3∶1 和10∶1 分別計(jì)算4 種皂苷的檢測(cè)限與定量限，結(jié)果見表2。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液（臨用新配），按“2.4”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄各成分峰面積值，計(jì)算原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷峰面積的RSD值分別為2.2%、3.2%、3.7%、3.3%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取熱風(fēng)干制的菊葉薯蕷干燥樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷含量RSD分別為1.7%、2.0%、2.4%、2.3%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取熱風(fēng)干制的菊葉薯蕷干燥樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件分別于 0、2、4、6、10、12 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷的峰面積RSD值分別為4.4%、2.1%、4.1%、2.3%，表明供試品溶液在制備后12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的熱風(fēng)干制的菊葉薯蕷干燥樣品6 份，分別準(zhǔn)確加入4種對(duì)照品適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷平均加樣回收率分別為98.3%、97.9%、98.7%、98.2%，RSD（n＝6）分別為2.0%、2.1%、2.3%、2.8%。

2.6 含量測(cè)定

取“2.1”項(xiàng)下菊葉薯蕷樣品，每組各3 份，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。各供試品（按干品計(jì)算）色譜圖見圖1，原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷的含量見表3。

圖1 菊葉薯蕷鮮品及各干制品的HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of Dioscorea composita Hemsl.fresh and dried by different methods

表3 菊葉薯蕷鮮品及各干制品中4 種皂苷的含量(n ＝3，mg·g－1)Tab 3 Contents of 4 saponins in Dioscorea composita Hemsl.fresh and dried by different methods (n ＝3，mg·g－1)

與菊葉薯蕷鮮品相比，陰干法、曬干法干制4 種皂苷的含量變化較大，其中原薯蕷皂苷降低、偽原薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷含量升高；60 ℃熱風(fēng)干制的菊葉薯蕷樣品與鮮品相比，4 種皂苷的含量差異最小。

3 討論

3.1 HPLC-ELSD 法定量分析菊葉薯蕷中4 種皂苷的含量

菊葉薯蕷中的皂苷類成分發(fā)色基團(tuán)較少，在紫外低波長(zhǎng)200 ～210 nm 處有末端吸收，容易受溶劑等因素影響，基線不穩(wěn)定且檢測(cè)困難，影響含量測(cè)定的準(zhǔn)確性；而在200 ～210 nm 以外波長(zhǎng)區(qū)域測(cè)定皂苷組分時(shí)，部分皂苷組分重疊，限制了UV檢測(cè)器的使用[16]。由于菊葉薯蕷中皂苷類成分組成復(fù)雜且結(jié)構(gòu)相差不大，極性僅有細(xì)微的不同，采用單一溶劑的流動(dòng)相實(shí)現(xiàn)良好分離效果的可能性很小，因此示差檢測(cè)器（RI）檢測(cè)器很少用于皂苷類的分析。雖然理論上柱前衍生可以彌補(bǔ)UV 和RI檢測(cè)器的不足，但由于皂苷的立體結(jié)構(gòu)及功能性基團(tuán)羥基取代率的不同使部分皂苷不易衍生化，而且某些皂苷可能生成多個(gè)衍生物而進(jìn)一步增加對(duì)皂苷類成分定量分析的復(fù)雜性[17-18]。ELSD 是一種非質(zhì)量選擇性檢測(cè)器，其檢測(cè)效果不受樣品分子中官能團(tuán)影響，對(duì)各種物質(zhì)均有響應(yīng)，溶劑在漂移管中的蒸發(fā)消除了溶劑峰對(duì)基線的干擾，波動(dòng)小[19]。目前，ELSD 已廣泛應(yīng)用于皂苷類、糖類、內(nèi)酯類及部分生物堿等成分的檢測(cè)[20-22]。本文采用HPLCELSD 定量分析菊葉薯蕷4 種皂苷的含量，蒸發(fā)光信號(hào)響應(yīng)良好，4 種指標(biāo)成分分離度高，峰形佳且相互無(wú)干擾，從而克服UV 檢測(cè)器末端吸收性差、基線不平穩(wěn)等因素的干擾。

3.2 干燥對(duì)菊葉薯蕷水分、灰分、浸出物及折干率的影響

不同干燥方式干燥菊葉薯蕷的折干率在28.13%～32.08%，其中，60℃熱風(fēng)干燥僅需要48 h，而陰干法需要168 h，曬干需要144 h。采用不同干燥方式干燥菊葉薯蕷樣品（參照薯蕷科植物薯蕷（Dioscorea compositaThunb.），依據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》對(duì)水分、灰分和浸出物進(jìn)行規(guī)定[23]：其中水分在9.03%～10.98%，均小于16%，符合藥典規(guī)定；灰分在3.51%～3.68%，均小于4%，符合藥典規(guī)定；浸出物含量在18.24%～21.70%，高于藥典要求的不小于7%。通過(guò)上述各干燥樣品的外在指標(biāo)分析，3 種干燥方式在水分、灰分、浸出物及折干率上沒(méi)有明顯的差別，從干燥時(shí)間及環(huán)境可控的角度，熱風(fēng)干燥更加適合于菊葉薯蕷規(guī)?；a(chǎn)地加工。

3.3 干燥對(duì)菊葉薯蕷有效成分保留方面的影響

不同干燥方式所獲得的干品及鮮品定量分析結(jié)果表明，菊葉薯蕷中4 種皂苷的含量因?yàn)楦稍锓绞降牟煌嬖诓町?，該結(jié)果與文獻(xiàn)[24]闡明的“干燥是中藥材加工的關(guān)鍵技術(shù)，干燥的過(guò)程也是中藥材藥性形成的過(guò)程”的研究結(jié)論相吻合。從有效成分保留方面來(lái)看，60℃熱風(fēng)干制更適合于菊葉薯蕷的產(chǎn)地加工。陰干法干制和曬干法干制導(dǎo)致菊葉薯蕷皂苷成分顯著變化的原因，可能在于這兩種干制的方式時(shí)間長(zhǎng)、條件溫和，非常適宜菊葉薯蕷本身的苷酶及外界微生物（曲霉、酵母等）發(fā)揮酶解或微生物轉(zhuǎn)化作用，從而導(dǎo)致原薯蕷皂苷等原生皂苷含量降低，而薯蕷皂苷等次生皂苷的含量升高[25]。60℃熱風(fēng)干制4 種皂苷類成分變化不大，可能是采用加熱處理能夠“殺酶保苷”，避免有效成分水解[26]。

文章采用HPLC-ELSD 法同時(shí)定量測(cè)定菊葉薯蕷中4 種皂苷，方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于菊葉薯蕷及其他含皂苷類藥材的質(zhì)量控制；研究基本闡明了3 種干燥方式對(duì)菊葉薯蕷中4 種皂苷含量的影響，可為菊葉薯蕷的產(chǎn)地干燥加工及質(zhì)量控制提供參考。