懷山藥內(nèi)生真菌Alternaria sp.L12的次生代謝產(chǎn)物研究

劉明爽，田若丹，葛夢煥，文春南，王旭光，劉淼*，麻兵繼，*（.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 中藥材系，鄭州 450046；.河南白云牧港生物科技有限公司，河南 登封 45400）

內(nèi)生真菌是植物生活史的部分或全部階段定殖于健康植物組織中，同時又不引起植物發(fā)生明顯病變的真菌[1]。研究表明，植物內(nèi)生真菌是結(jié)構(gòu)多樣、生物活性廣泛的天然產(chǎn)物的重要來源[2]，已成為藥物先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的重要途徑。同時，有些植物內(nèi)生真菌具有促進宿主植物生長發(fā)育、增強其抗逆性等作用[3]。因此，針對植物內(nèi)生真菌的研究引起了越來越多的關(guān)注。

薯蕷（Dioscorea oppositaThunb.）為薯蕷科纏繞草質(zhì)藤本植物，其根莖入藥稱為山藥，具有益氣養(yǎng)陰、補脾益腎、固精止帶等功效[4]。山藥不僅作藥用，亦作食用，具有較高的營養(yǎng)價值，是我國著名的藥食同源中藥材。山藥在我國很多省區(qū)以栽培方式生產(chǎn)，以古懷慶府（今河南省焦作市溫縣、沁陽市、武陟縣等沿沁河一帶）質(zhì)量最佳，其為我國道地產(chǎn)區(qū)[5]，習(xí)稱“懷山藥”。當(dāng)前，針對懷山藥的研究主要集中在其栽培技術(shù)、次生代謝產(chǎn)物以及多糖提取工藝等方面，而對其內(nèi)生真菌的研究還比較薄弱。

近年來本研究組一直致力于懷山藥藥材品質(zhì)以及內(nèi)生真菌資源的開發(fā)與利用等研究。在前期研究中，通過高通量測序技術(shù)分析了懷山藥中內(nèi)生真菌種群分布情況[6]，明確了懷山藥主要優(yōu)勢內(nèi)生真菌的種群結(jié)構(gòu)；對懷山藥可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌進行了系統(tǒng)分離和鑒定[7]；對懷山藥內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物開展了初步研究[8]，并發(fā)現(xiàn)一株懷山藥內(nèi)生鐮孢屬真菌能夠分泌生長激素3-吲哚乙酸[9]。這些研究為探討懷山藥品質(zhì)與內(nèi)生真菌之間的聯(lián)系以及挖掘懷山藥內(nèi)生真菌活性次生代謝產(chǎn)物提供了實驗基礎(chǔ)。

為了研究懷山藥內(nèi)生真菌中活性次生代謝產(chǎn)物，進一步開發(fā)利用懷山藥內(nèi)生真菌資源，本研究選取一株懷山藥內(nèi)生真菌Alternariasp.L12 為研究對象，對其大米發(fā)酵物乙酸乙酯萃取部位的化學(xué)成分進行研究，以期發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的活性物質(zhì)。

1 儀器與試藥

Avance Ⅲ400 MHz 超導(dǎo)核磁共振儀（瑞士Bruker 公司）；Agilent 1100 分析型高效液相色譜 儀（美 國Agilent 公 司）；Amethyst C18-H 分析 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）（美 國Sepax 公司）；Waters 1525 制備型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；ZORBAX SB-C18半制備柱（5 μm，9.4 mm×250 mm）（美國Agilent 公司）；SWCJ-2D 型雙人凈化工作臺（上海蘇京工業(yè)儀器）；GXZ 多段編程型智能培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；LDZX-30FBS 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

薄層硅膠板GF254（青島鼎康硅膠有限公司）；柱層析硅膠（80 目，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（美國通用）；RP-C8（日本富士）；色譜甲醇、乙腈（天津四友）；PDA、PDB 培養(yǎng)基（Solarbio 生物試劑有限公司）；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等試劑均為分析純（天津富宇）。

2 方法

懷山藥新鮮樣品采自道地產(chǎn)區(qū)焦作懷山藥種植基地，采用PDA 培養(yǎng)基從懷山藥中分離得到實驗菌種。通過5.8S rDNA-ITS 測序技術(shù)，對比GenBank 數(shù)據(jù)庫，將其鑒定為鏈格孢屬真菌（菌株編號為Alternariasp.L12）。因該菌株鑒定到屬水平，故列出其ITS 序列為TGGAACCTCTCGG GGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGT CTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTT CGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTT GTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAAT AATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTT CTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG ATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAAT CATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTT GGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGT CATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGG GCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGC CTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTT CGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCA GCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTT CAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATAC CCGCTGAACTTAAGCATTCAATAAGCGGAGG AA。

2.1 菌種的活化、培養(yǎng)與發(fā)酵

將保存于－80℃冰箱中的菌種于常溫下活化后，接種于已滅菌的PDA 培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 備用。然后將在PDA 培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)的菌種接種到PDB 培養(yǎng)基（200 mL）中，在恒溫搖床中28 ℃、120 r·min－1條件下振蕩培養(yǎng)5 d，得真菌發(fā)酵種子液。在600 mL 的圓形發(fā)酵瓶中，加入100 g 大米和100 mL 去離子水，于121℃高壓滅菌20 min 后放冷備用。將已制備的種子液加入發(fā)酵瓶中（共20 瓶，每瓶約10 mL），在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28 d，即得。

2.2 真菌發(fā)酵物的提取與分離

將Alternariasp.L12 大米發(fā)酵物用甲醇浸提，每次3 d，共提取3 次，抽濾。取濾液經(jīng)減壓濃縮除去甲醇后，用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮除去有機溶劑得到乙酸乙酯浸膏64.97 g。乙酸乙酯浸膏經(jīng)硅膠柱層析，用不同比例二氯甲烷-丙酮（1∶0、2∶1、0∶1，V/V）依次洗脫，得到3個組分（Fr.1 ～3）。Fr.1 經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20 凝膠柱層析分離得到化合物3（7.4 mg）。將Fr.2 部分通過反相中壓柱色譜，用20%、40%、60%、80%、100%甲醇依次洗脫，得到5 個亞組分（Fr.2.1 ～2.5）。Fr.2.1（20%甲醇洗脫部分）經(jīng)硅膠柱層析、凝膠柱層析和半制備HPLC 分離得到化合物8（11.7 mg）；Fr.2.2 經(jīng)硅膠柱層析和半制備HPLC 分離得到化合物5（25.9 mg）、6（13.9 mg）、7（20.3 mg）；Fr.2.4 經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20 凝膠柱層析和半制備HPLC 分離得到化合物1（10.1 mg）、2（9.6 mg）、4（7.4 mg）。

3 結(jié)果

化合物1：棕色油狀物。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：5.35（1H，brs，H-9），4.04（1H，dd，J＝12.6，5.2 Hz，H-2），1.44（3H，s，Me-14），0.98（3H，d，J＝6.9 Hz，H-22），0.86（3H，d，J＝6.7 Hz，H-21）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：199.7（C-1），72.3（C-2），31.1（C-3），28.9（C-4），174.1（C-5），88.4（C-7），44.5（C-8），119.8（C-9），149.9（C-10），46.0（C-11），16.2（C-12），106.8（C-13），23.4（C-14），34.0（C-15），36.5（C-16），26.1（C-17），34.5（C-18），36.9（C-19），68.5（C-20），17.2（C-21），20.9（C-22）。該化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻[10-11]報道基本一致，故鑒定為tricycloalternarene 1b（見圖1）。

化合物2：白色針晶（二氯甲烷-甲醇）。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δH：11.84（1H，s，7-OH），10.37（1H，s，3-OH），7.24（1H，d，J＝1.9 Hz，H-10），6.73（1H，d，J＝2.3 Hz，H-2），6.66（1H，d，J＝2.3 Hz，H-4），6.63（1H，d，J＝1.9 Hz，H-8），3.92（3H，s，H-12），2.74（3H，s，H-11）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δC：138.9（C-1），118.1（C-2），159.0（C-3），102.1（C-4），164.6（C-7），99.6（C-8），166.6（C-9），103.9（C-10），25.5（C-11），56.3（C-12），153.1（C-4a），98.9（C-6a），138.3（C-10a），109.3（C-10b）。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，故鑒定為alternariol-9-O-monomethyl ether（見圖1）。

化合物3：白色無定形粉末。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：6.53（1H，d，J＝8.5 Hz，H-7），6.26（1H，d，J＝8.5 Hz，H-6），5.22（2H，dd，J＝15.2，7.6 Hz，H-22，H-23），3.77（1H，m，H-3），1.02（3H，d，J＝6.8 Hz，H-21），0.94（3H，d，J＝6.8 Hz，H-28），0.91（3H，s，H-19），0.89（3H，s，H-19），0.86（3H，overlap，H-27），0.84（3H，overlap，H-26）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：34.5（C-1），29.5（C-2），65.6（C-3），36.8（C-4），82.1（C-5），135.4（C-6），130.3（C-7），79.3（C-8），51.3（C-9），36.4（C-10），20.0（C-11），39.3（C-12），44.4（C-13），51.7（C-14），23.0（C-15），28.4（C-16），56.2（C-17），11.9（C-18），17.2（C-19），39.7（C-20），20.2（C-21），135.4（C-22），132.1（C-23），42.9（C-24），33.0（C-25），18.7（C-26），19.0（C-27），16.8（C-28）。參考文獻[13]報道的波譜數(shù)據(jù)，鑒定為過氧麥角甾醇（見圖1）。

化合物4：淺黃色結(jié)晶（二氯甲烷-甲醇）。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δH：7.26（1H，d，J＝1.6 Hz，H-10），6.72（1H，d，J＝2.3 Hz，H-2），6.64（1H，d，J＝2.3 Hz，H-4），6.38（1H，d，J＝1.6 Hz，H-8），2.71（3H，s，H-11）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δC：138.3（C-1），117.5（C-2），158.4（C-3），101.5（C-4），164.0（C-6），164.3（C-7），100.8（C-8），165.4（C-9），104.3（C-10），25.2（C-11），152.6（C-4a），97.3（C-6a），138.0（C-10a），108.9（C-10b）。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，故鑒定為alternariol（見圖1）。

化合物5： 白色針晶（甲 醇）。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：7.11（2H，d，J＝8.2 Hz，H-2，6），6.74（2H，d，J＝8.2 Hz，H-3，5），3.50（2H，s，H-7）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：126.9（C-1），131.5（C-2，6），116.4（C-3，5），157.6（C-4），41.2（C-7），176.4（C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，故鑒定為對羥基苯乙酸（見圖1）。

化合物6： 白色結(jié)晶（甲 醇）。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：7.07 ～7.14（2H，overlap，H-4，H-6），6.77 ～6.80（2H，overlap，H-3，H-5），3.60（2H，s，H-7）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：123.0（C-1），156.9（C-2），116.0（C-3），129.4（C-4），120.6（C-5），132.2（C-6），36.8（C-7），176.4（C-8）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻[16]報道的一致，故鑒定為鄰羥基苯乙酸（見圖1）。

化合物7： 無色結(jié)晶（甲 醇）。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：7.23 ～7.35（5H，m，H-2，3，4，5，6），3.61（2H，s，H-7）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：136.2（C-1），130.5（C-2，6），129.6（C-3，5），128.0（C-4），42.1（C-7），175.8（C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，故鑒定為苯乙酸（見圖1）。

化合物8：白色結(jié)晶（甲 醇）。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：7.05（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2，6），6.72（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3，5），3.70（2H，t，J＝7.1 Hz，H-8），2.73（2H，t，J＝7.1 Hz，H-7）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：131.2（C-1），131.0（C-2，6），114.7（C-3，5），156.9（C-4），39.6（C-7），64.7（C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致，故鑒定為對羥基苯乙醇（見圖1）。

圖1 化合物1 ～8 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structure of compound 1 ～8

4 結(jié)論與討論

前期研究表明，懷山藥含有豐富的鏈格孢屬內(nèi)生真菌。本研究首次對一株懷山藥鏈格孢屬內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物開展了化學(xué)成分研究，共分離得到8 個化合物，經(jīng)鑒定均為已知化合物。其中化合物1 為混合萜類真菌毒素，化合物2 和4 為鏈格孢酚類真菌毒素，因此，在懷山藥飲片安全檢測中要引起重視。尤其是懷山藥藥材儲藏期間這些真菌毒素是否存在累積效應(yīng)還需要進一步研究。另有文獻表明，化合物1、2 和4 還具有多種生物活性，如化合物1 對Lewis 肺癌細胞3LL 和人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y 具有顯著的體外細胞毒活性[19]；化合物2 和4 對 KB 和KBv200 癌細胞具有顯著的細胞毒活性[20]。因此，不管是從食品安全的角度，還是從挖掘懷山藥鏈格孢屬內(nèi)生真菌的活性次生代謝產(chǎn)物角度，該屬真菌都具有繼續(xù)深入研究的意義和價值。