短期高原抗阻練習對人骨骼肌的影響及基因芯片分析

王寧琦 包大鵬 龔麗景 晏冰 胡揚

1 北京體育大學（北京100084）

2 武漢體育學院健康科學學院，運動訓練監(jiān)控湖北省重點實驗室（武漢430079）

肌肉萎縮是高原適應(yīng)過程中常見的一種肌肉功能障礙。目前已知，缺氧是高原肌肉萎縮的主要誘導因素。低氧可以通過抑制蛋白合成、加強蛋白分解等方式對骨骼肌的體積產(chǎn)生負面的影響。早期研究發(fā)現(xiàn)，適當?shù)捏w力活動可減緩高原暴露導致的肌肉萎縮[1，2]。近些年來有報道指出，在常壓低氧環(huán)境下進行抗阻練習能提高肌肉力量和體積[3，4]，但高原抗阻練習究竟通過怎樣的途徑對骨骼肌產(chǎn)生影響，尚未見相關(guān)人體實驗報道。目前，基因芯片技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學和醫(yī)學領(lǐng)域的研究中，利用該技術(shù)我們可以同時觀測成千上萬個基因的表達，將研究視角從某個靶基因，或某條靶通路延伸到全基因表達水平，從而更加全面地探索機體的生理和病理變化，為治療和干預提供準確的靶目標。本研究采用基因芯片技術(shù)篩選高原抗阻訓練前后骨骼肌差異基因，并通過生物信息學手段篩選關(guān)鍵調(diào)控通路，旨在探討抗阻訓練對高原肌肉萎縮的干預機理，為該訓練手段在高原環(huán)境的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 研究對象

12 名男性大學生分為訓練組和對照組，每組各6人。受試者身體健康，無呼吸系統(tǒng)疾病及任何心肺功能疾病史，均為北方漢族平原居民，并在6個月內(nèi)未到過高原或模擬高原環(huán)境中。受試者有抗阻練習經(jīng)歷，但在實驗期間沒有參與其他規(guī)律性抗阻練習。實驗前受試者被詳細告知實驗流程并簽署知情同意書。受試者基本情況見表1。

表1 受試者基本情況（x ± s）

1.2 實驗設(shè)計

受試者暴露于海拔3700 米高原（拉薩）10 天。對照組每日進行基本的日?；顒?，而訓練組除此之外隔天進行抗阻練習。兩組的飲食和日常生活與平原保持一致?？棺杈毩暦桨赴凑誂CSM’S Guidelines for Exer?cise Testing and Prescription制定[5]。主要采用負重深蹲練習（75% 1RM）。輔助訓練采用負重屈小腿練習和負重拉杠鈴鍛煉股后肌群。每種練習進行5 組，每組重復10 次，組間間歇1 分鐘。整個訓練在教練指導下完成。

1.3 測試指標與方法

1.3.1 形態(tài)學指標測試

兩組受試者在高原暴露前后的常氧環(huán)境中進行測試。采用雙能X 線法測試體成分、大腿脂肪、瘦體重（雙能骨密度測試儀NOLAND）。采用Philips Achieva 3T 核磁共振成像系統(tǒng)（Philips Medical System）的SE（TR 500 ms，TE 20 ms ）序列掃描，連續(xù)掃描24 張片，層厚5 mm；矩陣560 × 560。以股骨大轉(zhuǎn)子為標志點向下20cm，選取大腿中部的一層進行分析。使用Matlab 圖像處理軟件（北京大學研發(fā)）對選取的圖片進行分割，計算大腿肌肉橫截面積（cross sectional area，CSA）。

1.3.2 取材

采用肌肉活檢技術(shù)，分別在高原暴露前后常氧環(huán)境下提取兩組受試者的股外側(cè)肌中部肌肉。高原暴露前一周禁止劇烈運動，高原暴露后返回平原即刻進行取材。具體步驟：碘酊擦拭活檢區(qū)域，然后用酒精擦拭活檢區(qū)域周邊；用鋪巾蓋住非手術(shù)區(qū)，暴露手術(shù)切口。注射利多卡因進行局部麻醉，待產(chǎn)生局麻效果后在手術(shù)區(qū)開1 cm小口，調(diào)試好活檢針插入傷口進行肌肉采集。將采集到的肌肉迅速放入生理鹽水中清洗，一部分放入RNA later 保存液而后置于4℃冰箱過夜后轉(zhuǎn)置于－20℃冰箱保存，用于芯片測試；另一部分放入凍存管后投入液氮，而后置于－80℃冰箱保存，用于RTqPCR檢測。

1.3.3 芯片分析

采用Agilent 全基因組表達譜芯片（SurePrint G3 Human Gene Expression）篩查高原暴露前后骨骼肌差異基因。由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司提供芯片雜交相關(guān)設(shè)備和技術(shù)支持。采用GeneSpring 軟件進行數(shù)據(jù)歸一化和差異表達分析篩出差異表達mRNA（Ab?solute Fold change≥1.5）?；贕ene ontology 數(shù)據(jù)庫進行基因功能（Gene ontology，GO）注釋，得到差異基因參與的所有生物學過程；基于KEGG數(shù)據(jù)庫，對差異基因進行Pathway注釋。

1.3.4 檢驗芯片

從差異基因所富集的顯著性通路中篩選差異基因進行熒光實時定量PCR（RT-qPCR）驗證。使用Prim?er5 軟件進行引物設(shè)計，使用NCBI-Blast 進行引物檢驗，引物由生工生物（上海）股份有限公司合成。目的基因和內(nèi)參基因（RPS18）引物見表2。

配置RT-qPCR體系（見表3）。使用兩步法反應(yīng)程序進行RT-qPCR反應(yīng)（見表4）。

表2 RT-qPCR引物列表

表3 RT-qPCR體系

表4 RT-qPCR反應(yīng)條件

1.3.5 所用數(shù)據(jù)庫及分析平臺

數(shù) 據(jù) 庫：（1）GenBank: http://www.nvbi.nlm.nih.gov ；（2）Gene Ontology annotaition: http://www.geneon?tology.org；（3）KEGG: http://www.genome，jp/kegg/；（4）BLAST: http://www.ncbi.nlm.nih.gov

分析平臺: （1）KOBAS（KEGG Orthology Based Annotation System）；（2）DAVID Bioinformatics Re?sources: https://david.ncifcrf.gov/

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

形態(tài)學各項指標的數(shù)據(jù)以平均值±標準差（x±s）表示，每組自身前后變化采用配對樣本t檢驗。差異基因篩選采用獨立樣本t檢驗方法計算P值，采用Ben?jamini Hochberg FDR 方法對P值進行校正。RT-qP?CR數(shù)據(jù)分析采用△△Ct 值法。計算目標基因表達相較于相應(yīng)對照組基因的改變倍數(shù)。使用獨立樣本t檢驗分析訓練組的芯片中差異基因mRNA變化值與RTqPCR 檢驗的差異基因mRNA 變化值是否具有顯著性差異，用于判斷芯片的有效性。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 研究結(jié)果

2.1 實驗前后體重、瘦體重以及CSA的變化

實驗前后兩組體重均無顯著性變化。與實驗前相比，對照組全身和腿部瘦體重分別顯著下降1.86%和2.06%（P<0.05），訓練組全身和腿部瘦體重均無明顯變化。對照組CSA 顯著降低了3.3%（P<0.05），訓練組僅下降了2.46%，但未達到顯著性。見表5、表6。

2.2 實驗前后全身脂肪和下肢脂肪的變化

實驗前后，兩組的全身和下肢脂肪量無顯著性改變，見表7。

2.3 差異表達基因分析

通過1.5倍的差異基因篩選（P<0.05），訓練組差異基因共計432 個，其中上調(diào)192 個，下調(diào)240 個。對照組差異基因454個，其中上調(diào)199個，下調(diào)255個，聚類分析見圖1。

2.4 差異基因顯著性功能篩選和分析

GO注釋包括生物過程、細胞組成和分子功能三個部分。受高原缺氧環(huán)境的影響，對照組差異基因主要涉及的生物學過程有（P<0.01，F(xiàn)DR<0.01）：細胞周期、細胞生長、細胞增殖、激素反應(yīng)、酶活性、氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)分解等。主要涉及的細胞組成包括紡錘體、無膜細胞器、細胞骨架、微管、收縮成分、肌原纖維等。分子功能主要涉及泛素蛋白酶活性、酶結(jié)合、泛素硫酯酶活性、蛋白激酶活性、胰島素受體結(jié)合和肌肉結(jié)構(gòu)成分等。

圖1 兩組高原暴露前后差異基因聚類分析

表5 實驗前后體重和CSA的變化

表6 實驗前后瘦體重的變化

表7 實驗前后脂肪的變化

受高原缺氧和抗阻練習的雙重影響，訓練組差異基因主要涉及的生物過程有（P<0.01，F(xiàn)DR<0.01）：細胞周期、激素反應(yīng)、肌肉生長、氧化應(yīng)激以及蛋白代謝等過程。主要涉及的細胞組成包括紡錘體、受體復合體、細胞骨架、微管和無膜細胞器等。分子功能主要涉及酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白激酶活性和泛素硫酯酶活性等。

2.5 差異基因涉及的信號通路分析

結(jié)果顯示，對照組和訓練組分別有4 條和10 條調(diào)控通路具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，校正P<0.05），見表8、表9。在訓練組中，與調(diào)控肌肉體積相關(guān)的通路有FOXO 信號通路（FOXO signaling pathway，hsa04068）、胰島素通路（Insulin signaling pathway，hsa04910）和ErbB 信號通路（ErbB signaling pathway，hsa04012）（見圖2、圖3、圖4）。此外，大多數(shù)通路與癌癥相關(guān)，如結(jié)腸癌（Colorectal cancer，hsa05210）、膀胱癌（Bladder cancer，hsa05219）等。

表8 對照組信號通路分析結(jié)果

表9 訓練組信號通路分析結(jié)果

（續(xù)表9）

圖2 FOXO信號通路

2.6 差異基因RT-PCR結(jié)果及訓練組芯片驗證結(jié)果

按照公式△ct=cttargct-ctreference計算△ct。結(jié)果顯示，訓練組的MYC（v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog）、CUL5（cullin 5）、STAT1（signal transducer and activator of transcription 1）、Jak3（Ja?nus kinase 3）、UBE4A（ubiquitination factor E4A）、ErbB3以及IGF-1（insulin like growth factor 1）基因在高原抗阻訓練后出現(xiàn)顯著變化（P<0.05），見表10。芯片驗證結(jié)果顯示，基因芯片和RT-qPCR分析結(jié)果較為一致，說明芯片檢測結(jié)果準確，見圖5。

圖3 胰島素信號通路

圖4 ErbB信號通路

表10 差異表達基因RT-qPCR結(jié)果

3 分析討論

3.1 短期高原抗阻練習對體重、體成分以及骨骼肌形態(tài)學指標的影響

早期研究表明，長期高原暴露能引發(fā)較為明顯的肌肉量丟失，并且伴隨肌肉力量的下降[6-8]。但也有研究認為，全身蛋白合成速率在高原暴露初期已開始下降，同時蛋白分解速率持續(xù)增加[9]。近些年來有研究發(fā)現(xiàn)[10]，7～9 天的高原暴露（4559 米）可導致蛋白分解增加并影響肌肉的蛋白調(diào)控過程。該研究認為低氧誘導mTOR（mechanistic target of rapamycin kinase）表達下降并抑制蛋白合成通路，導致肌肉量丟失。本研究發(fā)現(xiàn)，10天高原（海拔3700米）暴露可引起對照組體重和全身瘦體重的顯著性下降，并且下肢瘦體重的丟失更為明顯，同時伴有大腿肌肉橫截面積的減小。這與Holm 等[11]的研究結(jié)果相一致，他認為短期高原暴露即可導致全身性的蛋白分解。然而本研究中的訓練組在高原暴露前后未出現(xiàn)明顯的肌肉丟失。研究發(fā)現(xiàn)，高原停留期間從事適當?shù)捏w力活動（比如自行車，足球，籃球，攀巖等）可以維持肌肉體積[2]。Imoberdorf 等[1]等近一步證實了在高原上運動對蛋白合成的有利作用。運動對蛋白合成的刺激效應(yīng)與肌肉收縮引發(fā)的促合成激素增加以及蛋白合成通路信號增強有關(guān)?？棺杈毩曌鳛橐豁椵o助性治療手段已廣泛應(yīng)用于多種肌肉萎縮的治療[12，13]，它對肌肉的機械性刺激較強，能有效促進骨骼肌肥大并提高肌肉力量。本研究為了控制日常體力活動和飲食對本實驗的影響，對兩組在高原暴露期間的飲食和出行進行了統(tǒng)一安排。因此，本研究推測，高原暴露前后，訓練組的肌肉量及形態(tài)學指標未出現(xiàn)顯著性變化，可能是由于抗阻訓練激活了骨骼肌中蛋白質(zhì)合成通路，從而削弱了缺氧對蛋白合成的抑制作用及促蛋白分解作用。這提示，高原暴露早期進行抗阻練習可在一定程度上減緩肌肉的丟失。

圖5 芯片驗證結(jié)果（以訓練組訓練后芯片結(jié)果為代表）

3.2 高原抗阻練習對骨骼肌基因表達的GO分析

為了進一步探究高原抗阻練習對骨骼肌作用的機理，本研究利用mRNA芯片掃描篩選差異基因，并采用GO 分析對差異基因的功能以及參與的生物學過程進行注解，結(jié)果顯示，對照組和訓練組的差異基因均參與了細胞周期、激素反應(yīng)、細胞生長、氧化應(yīng)激、磷酸化、泛素依賴性蛋白分解以及細胞內(nèi)生物合成等相關(guān)過程。這說明高原缺氧對細胞的影響是廣泛的，不僅抑制細胞生長，還能促使機體氧化應(yīng)激升高，從而引發(fā)多種有害的細胞效應(yīng)[14]。此外，高原缺氧對機體的代謝過程也會產(chǎn)生很大影響，低氧對肌肉蛋白代謝的影響尤為明顯[15]，本研究結(jié)果與此較為一致。本研究結(jié)果顯示，對照組差異基因所富集的多個生物過程與蛋白分解相關(guān)，如GO:0030163 protein catabolic process、

GO:0051603 proteolysis involved in cellular protein catabolic process、GO:0044257 cellular protein catabol?ic process，說明高原暴露初期低氧誘導骨骼肌蛋白分解代謝加強可能是引發(fā)肌肉量丟失的主要原因。與對照組不同，在訓練組的GO 分析結(jié)果主要涉及蛋白修飾、信號轉(zhuǎn)導、胰島素受體、大分子生物合成以及細胞運動等生物過程?？梢酝茰y，高原抗阻練習可能抑制了某些與分解代謝相關(guān)的基因，因而可能在一定程度上緩解了低氧誘導的肌肉丟失。

3.3 高原抗阻練習對骨骼肌基因表達的信號通路分析

信號通路分析是通過Pathway 的主要公共數(shù)據(jù)庫KEGG 對差異基因進行分類。本研究將針對訓練組差異基因富集的與骨骼肌蛋白調(diào)控相關(guān)的主要信號通路進行分析。

3.3.1 高原抗阻練習對FOXO信號通路的影響

FOXO 是O 型叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族，主要包括FOXO1、FOXO3、FOXO4 和FOXO6 等4 個轉(zhuǎn)錄因子[16]。FOXO家族主要參與多種重要的生物過程，如細胞周期停滯、DNA修復以及細胞凋亡[17]。其中FOXO1、FOXO3的表達與肌肉萎縮相關(guān)[18，19]。在FOXO 信號通路中，F(xiàn)OXO位于整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心位置。本研究發(fā)現(xiàn)，高原暴露后對照組FOXO1基因有上調(diào)趨勢，而該基因在訓練組呈下調(diào)趨勢。FOXO1轉(zhuǎn)錄因子是胰島素通路下游Akt 蛋白的作用靶點，在促肌肉萎縮中起重要作用。動物實驗和細胞培養(yǎng)實驗均已證實FOXO1 的表達增加能降低骨骼肌細胞體積，因為它可以使誘導蛋白分解的相關(guān)基因MAFbx/atrogin-1（F-box protein 32）上調(diào)[20，21]。有研究發(fā)現(xiàn)，長期離心運動可使小鼠肌肉中FOXO1 的mRNA 表達顯著性下降，急性離心運動則上調(diào)該基因表達[22]，認為氧化應(yīng)激對FOXO1 的表達有重要作用。當機體在低氧環(huán)境下暴露時會增加氧化應(yīng)激效應(yīng)，促使FOXO1表達增加。訓練組FOXO1基因表達下調(diào)可能與10天的抗阻練習有關(guān)，該訓練模式可能有利于機體對低氧的適應(yīng)，從而降低低氧引發(fā)的氧化應(yīng)激效應(yīng)。

本研究結(jié)果表明，高原抗阻練習可以通過下調(diào)FOXO通路中的核心轉(zhuǎn)錄因子FOXO1基因的表達減緩骨骼肌內(nèi)的蛋白分解過程，從而對高原暴露誘導的骨骼肌萎縮有抵抗作用。

3.3.2 高原抗阻練習對胰島素信號通路的影響

胰島素通路涉及多條分支，其中包括了葡萄糖轉(zhuǎn)運通路以及蛋白合成通路。低氧刺激對蛋白合成的負面影響已被大量報道證實[10]，低氧能夠從多個環(huán)節(jié)對蛋白合成通路產(chǎn)生抑制作用。一方面，在ATP 耗竭之后，低氧可以直接通過激活AMPK/PRKAA1（protein ki?nase AMP-activated catalytic subunit alpha 1）抑制mTOR 而不依賴于HIF-1α（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha）[23]；另一方面，低氧也可通過TSC1/TSC2（TSC complex subunit 1/2）抑制mTOR[24]。本研究結(jié)果顯示，在胰島素通路中，INSR（insulin receptor）、IRS（in?sulin receptor substrate）、PI3K（phosphoinositide 3-ki?nase）以及Akt基因均下調(diào)。IRS是IGF-1受體底物，此基因是蛋白合成通路上游的重要基因，其下調(diào)可導致細胞對IGF-1 的敏感性下降，直接影響蛋白合成過程。PI3K 和Akt 基因是PI3K/Akt/mTOR 通路的重要成員，其表達下調(diào)可能對于蛋白合成有不利影響。不過，在芯片結(jié)果中發(fā)現(xiàn)IGF-1 基因上調(diào)，同時經(jīng)RT-qPCR驗證也發(fā)現(xiàn)其顯著性升高。因而可以推斷，高原抗阻練習仍然可以有效增加IGF-1 的表達，但由于胰島素受體受低氧的影響，IGF-1的增加不能有效與受體進行結(jié)合，因此不能增強蛋白合成通路。而本研究中，10天高原抗阻練習不能對蛋白合成通路中的基因起上調(diào)作用可能與低氧對該通路的抑制作用有關(guān)。有報道指出，低氧對小鼠負重訓練后促肌肉肥大效應(yīng)的影響是短暫的，只發(fā)生在低氧暴露的前12 天。之后，負重訓練的促蛋白合成效應(yīng)將逐漸恢復而不受低氧的影響[25]。本研究的高原暴露時間僅為10 天，也即高原適應(yīng)的初期，機體對低氧的反應(yīng)較為強烈，因而可能會對抗阻練習后的促蛋白合成效應(yīng)產(chǎn)生一定影響。另外，本研究的訓練強度是根據(jù)常氧環(huán)境下促肌肉肥大的訓練負荷制定的，受低氧的影響，該負荷可能不足以激活蛋白合成通路的基因，因而提示，今后可以嘗試通過增加訓練強度來增加其對肌肉的刺激程度，從而更深入地探索高原抗阻練習對蛋白合成通路的影響。

3.3.3 高原抗阻練習對ErbB信號通路的影響

NRG（neuregulin）/ErbB 通路在調(diào)節(jié)骨骼肌代謝中起重要作用[26]。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白NRG通過激活Ⅰ型受體酪氨酸激酶（RTKs）亞家族的三個受體ErbB2、ErbB3和ErbB4 發(fā)揮其調(diào)控作用[27]。在骨骼肌中，NRG作為調(diào)控神經(jīng)肌肉接頭分化和生長的調(diào)節(jié)基因已被廣泛研究。其中，神經(jīng)性和肌源性NRG 家族成員對肌管形成、肌肉的生長和分化有重要作用[28，29]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過電刺激模式的抗阻訓練可激活NRG/ErbB通路，因而認為運動可通過NRG/ErbB 通路對骨骼肌代謝和增殖產(chǎn)生影響[30]。在本研究差異基因所富集的通路中也發(fā)現(xiàn)了ErbB通路，從該通路的調(diào)控圖中可以看出NRG/ErbB 中的NRG 和ErbB3 基因顯著性升高，而ErbB2 基因顯著性下調(diào)。不過，ErbB2 的下游靶分子SHC3（SHC adaptor protein 3）的基因表達升高，因而本研究認為，在高原環(huán)境下進行抗阻訓練同樣可以激活NRG/ErbB通路。有研究在去除神經(jīng)的肌肉中發(fā)現(xiàn)，NRG以及ErbB3 表達增加伴隨葡萄糖轉(zhuǎn)運載體的增強，認為NRG/ErbB 有利于提高肌肉對葡萄糖的攝取。因此推測，高原抗阻練習可以通過NRG/ErbB通路影響骨骼肌的代謝過程，但其對肌肉質(zhì)量的調(diào)控還有待于進一步研究。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在ErbB 通路中，MAPK1/ERK2（mitogen-activated protein kinase 1）下游的靶基因MYC的表達也顯著性升高。有研究證明，ERK1/2通路可以通過調(diào)控核糖體RNA 的基因表達促進蛋白質(zhì)的合成[31]，同時也受到IGF-1 的影響，對調(diào)控肌肉肥大效應(yīng)有重要作用[32]。因而，MAPK1 的上調(diào)有利于促進肌肉的蛋白合成作用。MYC 是一種編碼絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化蛋白質(zhì)的原癌基因，不僅參與早期胚胎發(fā)生、細胞生長和分化過程，而且MYC 在細胞體積的調(diào)控中也發(fā)揮著重要作用[33，34]。研究發(fā)現(xiàn)，負重訓練后骨骼肌中MYC 蛋白表達增加對于衛(wèi)星細胞的增殖以及肌細胞的肥大性生長有重要作用[35]?？棺杈毩曀T導的肌肉肥大常伴隨較強的蛋白合成作用，滿足這一過程不僅需要激活核糖體復合物，同時還要有較高的蛋白翻譯水平，而提高蛋白翻譯水平需要增強核糖體RNA 的合成。MYC 能誘導多種核糖體蛋白轉(zhuǎn)錄水平的增加并提高蛋白合成作用。有研究發(fā)現(xiàn)，抗阻練習24小時后MYC的表達增加伴有核糖體RNA的增多，該研究認為，核糖體合成增強是影響運動后肌肉肥大的重要因素之一[36]。有研究顯示，小鼠在進行急性抗阻練習6 小時后MYC mRNA 水平顯著升高，并認為MYC mRNA 表達增加是肌肉肥大的早期反應(yīng)[37]。因而，本研究推測，高原抗阻練習后MYC mRNA 表達增加可能對于維持肌肉質(zhì)量有重要作用。

4 總結(jié)

高原抗阻練習對骨骼肌基因轉(zhuǎn)錄水平的影響是復雜的，涉及FOXO、ErbB以及胰島素等多條信號通路中相關(guān)基因的變化。一方面，低氧影響了抗阻練習對mTOR和MEK1/2/ERK等通路的激活作用，另一方面抗阻練習能削弱低氧對蛋白分解通路及相關(guān)基因如TSC2 和FOXO1 等的影響。本研究認為，高原暴露初期，雖然抗阻練習的促蛋白合成效應(yīng)會受到低氧的影響，但仍然可以削弱低氧對肌肉蛋白的分解代謝作用，從而維持肌肉質(zhì)量。不過，本研究僅從mRNA 轉(zhuǎn)錄水平上對該通路的差異基因進行分析，今后還應(yīng)從蛋白水平上對以上所篩選出的通路進行深入研究。