跑臺運動訓練對脊髓損傷大鼠肺功能及HMGB-1表達的影響

王志濤，陳源，王鳳霞，陳彥，王先斌,2，吳霜,2

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后肺不張、呼吸衰竭等嚴重并發(fā)癥是造成SCI患者高死亡率的主要原因[1-2]。除高位脊髓損傷可造成嚴重的神經(jīng)源性呼吸動力障礙之外，脊髓損傷后繼發(fā)的肺損傷也是導致脊髓損傷患者呼吸功能障礙，甚至致死的重要原因。有研究發(fā)現(xiàn)，在肺損傷大鼠肺組織中檢測到的高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box-1 protein,HMGB1)較正常對照組明顯升高，通過抑制HMGB1的表達和分泌，可明顯減輕大鼠肺損傷程度，提高大鼠的存活率[3]。而跑臺運動訓練作為肺康復的主要康復訓練方法，被廣泛應用于SCI、腦卒中等疾病的康復治療中[4-5]。研究證實通過跑臺運動訓練能夠提高全身各肌群包括呼吸肌群的肌力和肌耐力，并改善1秒用力呼氣量(FEV1)等多項肺功能指標，改善心肺儲備功能[5-6]。但其對脊髓損傷后繼發(fā)的肺損傷會造成何種影響，目前未見明確報道。本實驗通過對胸段SCI大鼠進行跑臺運動訓練后的帶氧能力、肺組織病理學改變、HMGB1表達水平變化等指標的檢測以探究跑臺運動訓練對胸段脊髓損傷后大鼠肺功能，及肺組織內(nèi)HMGB1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SPF級6周齡SD雌性大鼠，200±20g，實驗動物來源：貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院實驗動物中心，質(zhì)量合格證編號SYXK(黔)2018-0001：本動物實驗經(jīng)貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查通過。適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為正常組、假手術(shù)組、脊髓損傷非訓練組、脊髓損傷訓練組，每組各24只。實驗過程中動物處置均符合貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會標準。

1.2 方法 ①動物模型制備及術(shù)后護理：大鼠用10%的水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉。俯臥位四肢外展固定于手術(shù)臺，常規(guī)術(shù)區(qū)備皮、消毒，鋪無菌孔巾。以T10棘突為中心，沿棘突做縱行切口約2 cm，切開皮膚及淺筋膜，并皮下游離。尖刀片緊貼棘突骨面兩側(cè)(以減少因切開肌肉所致肌間出血)做椎旁肌縱行切開，顯微撐開器撐開兩側(cè)椎旁肌，暴露術(shù)野，咬除T10棘突，顯露椎板，蚊式止血鉗橫向輕輕鉗夾摩擦椎板直至顯露硬膜囊外間隙。由尾側(cè)向頭側(cè)咬除椎板直至兩側(cè)椎弓根，完整暴露脊髓。參考趙雪燕等[7]方法，眼科手術(shù)刀于T10節(jié)段處連同硬脊膜和脊髓一同快速切斷，可見大鼠后肢痙攣性抽搐數(shù)次后軟癱，切除2 mm寬脊髓組織，并以彎頭顯微鑷輕抬起脊髓兩斷端，直視下兩人證實脊髓完全橫斷。創(chuàng)口敷灑慶大霉素。逐層縫合肌肉、筋膜、皮膚，術(shù)畢。假手術(shù)組僅剝離椎板，不傷及脊髓，其他處理均同脊髓橫斷組。大鼠分籠飼養(yǎng)，室溫(23±2)℃，相對濕度(50±10)%，明暗12h交替，飲食水自由攝取。術(shù)后常規(guī)每日慶大霉素(2～4)×104 U/kg 腹腔注射。每天按摩、擠壓膀胱協(xié)助排尿2～3次。為預防腸梗阻和壓瘡的發(fā)生，每日輕揉大鼠腹部及雙后肢2次并保持皮毛干燥。脊髓損傷非訓練組和脊髓損傷訓練組在造模過程中各有3只于術(shù)后2～24h死亡，予以及時補充。②干預方法：脊髓損傷后運動組大鼠于術(shù)后第3天開始跑臺運動訓練，訓練過程中根據(jù)大鼠前肢運動情況選擇跑臺內(nèi)置的聲音、光照刺激及跑道與大鼠足趾接觸處給與電流刺激，保證大鼠維持在跑道上的持續(xù)運動，每日早晚各訓練1次，每次訓練時間為15min，速度為15m/min[8]。

1.3 評定標準

1.3.1 大鼠運動功能評價 分別在造模前、造模后即刻、造模后第3天及第14天對所有大鼠采用雙盲法用BBB評分表進行運動功能評價[9]，該評分表分值為0～21分，0分表示無可見后肢運動，21分表示活動正常。

1.3.2 動脈血氣分析 對各組大鼠于術(shù)后第3天、第14天經(jīng)大鼠腹主動脈取動脈血1.5ml做動脈血氣分析，觀察并記錄動脈氧分壓值(partial pressure of oxygen,PaO2)、動脈二氧化碳分壓值(partial pressure of carbon dioxide,PaCO2)。

1.3.3 肺組織濕/干重比檢測 各組大鼠分別于術(shù)后第3d、14d經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉，取大鼠整肺，用濾紙吸干表面水分，在電子天平上稱重，得到肺濕重，將肺組織放到65℃烘箱中72h烘干至恒重，在電子天平上稱重，得到肺干重，計算二者之比。

1.3.4 肺組織HE染色及肺損傷評分 各組大鼠分別于術(shù)后3d、14d經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉，自左心室插管后剪開右心耳，快速灌注生理鹽水沖洗，待流出的液體清亮后，用4%多聚甲醛經(jīng)心內(nèi)灌注，取出右下葉肺組織，在4%多聚甲醛中固定12 h，入30%蔗糖磷酸鹽緩沖液至組織塊下沉為止。石蠟切片制作15 μm厚切片以備做HE染色及免疫組織化學染色。取各組大鼠肺組織切片進行HE染色，切片在二甲苯(Ⅰ)、(Ⅱ)中各脫蠟10min。順次將切片移入無水乙醇2min、95%、90%、80%乙醇各1min，蒸餾水洗2min。蘇木素染色5min，自來水沖洗。使用0.5%鹽酸乙醇(70%乙醇配制)分化，提插數(shù)下。自來水浸泡15min。使用0.5% 伊紅染液染色2min。依次移入80%、90%、95%及無水乙醇中各1min 進行脫水。二甲苯透明2 次，各5min。中性樹脂封片。最后在光鏡下觀察，并用圖像采集系統(tǒng)留取圖片。

1.3.5 肺損傷評分 分別對各組大鼠肺組織進行肺損傷評分[10]，取組內(nèi)評分，平均值作為各組大鼠的肺組織損傷程度評分。肺損傷評分標準為：①肺泡充血和間質(zhì)水腫:無異常為0分，輕度異常為1分，中度異常為2分，重度異常為3分;②肺內(nèi)出血：無紅細胞為0分，極少數(shù)為1分，較多數(shù)為2分，充滿肺泡腔為3分；③肺泡腔或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集：無白細胞為0分，極少數(shù)為1分，較多數(shù)為2分，充滿肺泡腔為3分；④肺泡壁增厚和透明膜形成：無透明膜形成為0分，<20%肺泡出現(xiàn)透明膜為1分，20%～50%肺泡出現(xiàn)透明膜為2分，>50%肺泡出現(xiàn)透明膜為3分。

1.3.6 免疫組織化學染色 取各組大鼠肺組織切片投入PBS緩沖液，經(jīng)抗原修復液95℃存放20 min，緩沖液清洗2次，再入3%H2O2溶液內(nèi)，室溫20 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶。然后，切片孵育在10%山羊血清溶液中1h，以減少非特異性反應。一抗Anti-HMGB1(兔單克隆抗體)經(jīng)1%山羊血清與0.15%Triton X100緩沖液配制。每片滴加100μ一抗Anti-HMGB1(1∶200，貨號：ab79823，Abcam公司)后，在4℃孵育過夜，次日經(jīng)緩沖液洗滌3次后，加相應抗兔二抗(1∶400，貨號：ab6721，Abcam公司)溶液，室溫孵育1 h，緩沖液洗滌3次。底物呈色反應劑采用DAB(貨號：CDLG-4456，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。呈色反應后，切片經(jīng)逐級脫水并中性樹脂封片。每例標本測5張切片。HMGB1陽性率的計算采用陽性著色細胞計數(shù)法。在40倍光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，人工計數(shù)陽性著色細胞和視野內(nèi)的總細胞數(shù)，每組5張不同動物組織切片，取被檢各切片之均值。HMGB1陽性率=HMGB1陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分 正常組和假手術(shù)組大鼠BBB評分術(shù)前、術(shù)后第3天、第14天均為21分；SCI非訓練組和SCI訓練組BBB評分術(shù)前均為21分，術(shù)后第3天評分均為0分，術(shù)后第14天評分均為0～1分。術(shù)后14天 SCI非訓練組和SCI訓練組BBB評分差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 動脈血氣分析 術(shù)后第3天，正常組與假手術(shù)組比較，PaO2、PaCO2差異無統(tǒng)計學意義；與正常組及假手術(shù)組比較，SCI非訓練組、SCI訓練組PaO2均顯著降低，PaCO2均顯著升高(均P<0.05)；SCI非訓練組與SCI訓練組比較，PaO2、PaCO2差異無統(tǒng)計學意義。術(shù)后第14天，正常組與假手術(shù)組比較，PaO2、PaCO2差異無統(tǒng)計學意義；與正常組及假手術(shù)組比較，SCI非訓練組、SCI訓練組PaO2均明顯低于正常組及假手術(shù)組，PaCO2均明顯高于正常組及假手術(shù)組(均P<0.05)。組內(nèi)術(shù)后第14天分別與術(shù)后第3天比較，SCI非訓練組和SCI訓練組PaO2均明顯升高，PaCO2均明顯降低(均P<0.05)，且SCI訓練組較SCI非訓練組PaO2升高更顯著，PaCO2下降也更顯著(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠PaO2、PaCO2術(shù)后比較

2.3 肺組織濕/干重比 術(shù)后第3天，正常組與假手術(shù)組肺組織濕/干重比值差異無統(tǒng)計學意義；SCI非訓練組、SCI訓練組肺組織濕/干重比值均顯著高于假手術(shù)組(均P<0.05)；SCI非訓練組與SCI訓練組肺組織濕/干重比值差異無統(tǒng)計學意義。術(shù)后第14d，正常組與假手術(shù)組肺組織濕/干重比值差異無統(tǒng)計學意義；SCI非訓練組肺組織濕/干重比值明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；與SCI非訓練組比較，SCI訓練組肺組織濕/干重比值明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠肺組織在不同時間點濕/干重比值比較

2.4 肺組織HE染色 HE染色結(jié)果顯示，正常組和假手術(shù)組各時間點肺泡結(jié)構(gòu)完整，無紅細胞滲出及炎性細胞浸潤，正常組和假手術(shù)組無明顯差別，見圖1；SCI非訓練組和SCI訓練組大鼠損傷3d后肺組織中毛細血管擴張充血，肺泡壁增厚及肺間質(zhì)可見紅細胞、炎性細胞浸潤，肺泡破裂，部分肺泡腔融合，見圖2(A、C)；與術(shù)后第3天比較，術(shù)后第14天SCI非訓練組、SCI訓練組紅細胞、炎性細胞浸潤、肺泡破裂，部分肺泡腔融合等程度均有所減輕，且SCI訓練組較SCI非訓練組減輕更加明顯，見圖2(B、D)。肺損傷評分結(jié)果如表3所示。各組大鼠術(shù)后第14天，正常組與假手術(shù)組肺損傷評分，差異無統(tǒng)計學意義；SCI非訓練組、SCI訓練組肺損傷評分均顯著高于假手術(shù)組(均P<0.05)，且SCI訓練組顯著低于SCI非訓練組(P<0.05)。術(shù)后第14天，與假手術(shù)組比較，SCI非訓練組、SCI訓練組肺損傷評分均顯著增高(均P<0.05)；且SCI訓練組顯著低于SCI非訓練組(P<0.05)。與術(shù)后第3天比較，術(shù)后第14天SCI非訓練組、SCI訓練組肺損傷評分均顯著降低(P<0.05)。且SCI訓練組肺損傷評分顯著低于SCI非訓練組(P<0.05)。

圖1 A～C 肺組織形態(tài)學；A.正常組14dHE染色結(jié)果；B.假手術(shù)組術(shù)后3d染色結(jié)果C.假手術(shù)組術(shù)后14dHE染色結(jié)果；比例尺=200μm

圖2 A～D 肺組織形態(tài)學及肺損傷評分結(jié)果；A.非訓練組術(shù)后3d HE染色結(jié)果；B.非訓練組術(shù)后14d HE染色結(jié)果；C.訓練組術(shù)后3d HE染色結(jié)果；D.訓練組術(shù)后14d HE染色結(jié)果；比例尺=100μm

表3 4組肺損傷評分結(jié)果比較 分，

2.5 肺組織HMGB1蛋白免疫組化檢測 各組肺組織HMGB1蛋白免疫組化檢測結(jié)果見圖3A～F。術(shù)后第3天，與假手術(shù)組比較，SCI非訓練組和SCI訓練組肺組織中HMGB1蛋白的表達水平均顯著升高(均P<0.05)；SCI非訓練組與SCI訓練組比較，肺組織中HMGB1蛋白的表達水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義。術(shù)后第14天，與假手術(shù)組比較，SCI非訓練組和SCI訓練組肺組織中HMGB1蛋白的表達水平均顯著升高(P<0.05)；但SCI訓練組HMGB1表達量顯著低于SCI非訓練組(P<0.05)；且SCI訓練組組內(nèi)比較，術(shù)后第14天HMGB1的表達水平明顯低于術(shù)后第3天時HMGB1的表達水平(P<0.05)。見表4。

圖3 A～F 各組肺組織HMGB1蛋白免疫組化檢測結(jié)果；HMGB1蛋白陽性如紅色箭頭所示。A.假手術(shù)組，術(shù)后3d；B.假手術(shù)組，術(shù)后14d；C.脊髓損傷非訓練組，術(shù)后3d；D.脊髓損傷非訓練組，術(shù)后14d；E.脊髓損傷訓練組，術(shù)后3d；F.脊髓損傷訓練組，術(shù)后14d。比例尺=50μm。

表4 4組HMGB1陽性率結(jié)果比較

3 討論

脊髓損傷不僅導致?lián)p傷平面以下的運動、感覺等功能障礙，還將繼發(fā)多種并發(fā)癥，呼吸功能障礙就是其中致死率最高的一種[11]。目前研究認為SCI后發(fā)生繼發(fā)性肺損傷的機制主要包括以下兩方面：①SCI后全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)：SCI后早期不僅會引起損傷脊髓局部的炎癥，還會導致全身炎癥反應綜合征，造成多器官功能障礙，而肺是SCI后全身炎癥反應作用的主要靶器官，SCI后循環(huán)炎癥細胞激活并向肺、肝、腎等遠隔器官遷移，在多種細胞因子的參與下，最終導致繼發(fā)性肺損傷[12]；②神經(jīng)源性肺水腫：神經(jīng)源性肺水腫是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴重損害后肺水腫急性發(fā)作作為主要特征的一種臨床綜合征，可由脊髓損傷引起[13]。有研究已證實了以上兩種假說，如Bo等[1]用改良Allen法建立大鼠T10水平脊髓挫傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCI后12h，肺組織病理切片可見出血性病變，尤其是雙肺下葉，傷后24h出現(xiàn)肺水腫，傷后3d出血、水腫達高峰，傷后7d水腫明顯減輕，14d后仍可見明顯出血。Wu等[12]用打擊法建立大鼠T10水平SCI模型，傷后3d肺組織病理切片出現(xiàn)充血、水腫、肺泡結(jié)構(gòu)破壞等肺損傷表現(xiàn)。這些研究表明，大鼠胸段脊髓損傷將會引起肺損傷，其機制可能即存在遠隔器官的炎癥反應，也存在神經(jīng)源性的肺水腫。本研究結(jié)果顯示，T10水平損傷的大鼠SCI非訓練組及SCI訓練組，損傷后第3天肺組織病理切片顯示毛細血管擴張充血，肺泡及肺間質(zhì)紅細胞、炎性細胞浸潤，肺泡破裂，部分肺泡腔融合，肺組織濕/干重比值升高，PaO2下降，PaCO2升高，結(jié)果同以往研究一致。本實驗還發(fā)現(xiàn)，在第14天時SCI及SCI訓練組肺組織病理程度均較前減輕，肺組織濕/干重比值降低，PaO2較前上升，PaCO2較前降低，提示大鼠SCI后的肺損傷可能存在一定的自限性。

大量研究證明，跑臺運動訓練可保護脊髓損傷后的骨骼肌質(zhì)量和脊柱四肢的殘余力量，還可能參與調(diào)節(jié)脊髓損傷后抑制性遞質(zhì)的水平，如GABA和甘氨酸[14-15]。而早期跑臺運動訓練可能通過減輕損傷脊髓水腫、減輕炎癥反應、降低細胞凋亡、減少相關信號通路對神經(jīng)干細胞增殖分化的抑制作用，從而改善SCI后大鼠運動功能[16]。大鼠脊髓損傷節(jié)段以上的呼吸肌群作為跑臺運動中提供有氧代謝的動力，在運動功能得到改善的同時也可得以加強。Ching等[17]的研究發(fā)現(xiàn)跑臺運動可減輕糖尿病大鼠內(nèi)毒素血癥時肺組織病理損傷，同時使PaO2升高，PaCO2下降，降低內(nèi)毒素血癥大鼠死亡率。本實驗結(jié)果顯示經(jīng)過14d跑臺訓練的SCI訓練組大鼠各項肺功能指標均顯著優(yōu)于SCI非訓練組，我們推測跑臺運動訓練可能有利于大鼠胸段脊髓損傷后肺損傷的恢復，但其機制不明。

HMGB1作為一種新的炎癥介質(zhì)參與炎癥反應的調(diào)節(jié)，如參與了腦卒中、急性心肌梗死、關節(jié)炎、哮喘等多種疾病的發(fā)生[18-21]。與CXCL12結(jié)合的完全還原的HGMB1，在組織損傷的初始階段介導炎性細胞的募集，從而誘導單核細胞的遷移，并調(diào)節(jié)中性粒細胞的黏附和遷移功能[22]。HMGB1還可介導TNF /IL-1，IL-6，IL-8，CCL2，CCL3，CCL4和CXCL10等細胞因子/趨化因子的釋放，從而參與炎癥反應的調(diào)節(jié)[23,25]。目前認為在原發(fā)性的肺損傷的發(fā)生發(fā)展中，HMGB1可能發(fā)揮著重要的作用，研究證實在大鼠肺損傷后，大鼠HMGB-1 mRNA在肺組織中的表達明顯升高[25]。Liu等[26]的研究指出肺損傷大鼠服用芍藥醇后可通過抑制HMGB1的表達和分泌，從而使肺損傷大鼠的存活率得到提高。本實驗通過對脊髓損傷后大鼠進行跑臺運動訓練，明顯抑制了大鼠肺組織內(nèi)HMGB1的表達，大鼠肺功能和肺組織損傷程度均較SCI非訓練組獲得明顯改善，提示HMGB1可能參與并介導了SCI后肺損傷的發(fā)生，跑臺運動訓練可能通過下調(diào)炎癥介質(zhì)HMGB1的表達，從而減輕了全身炎癥反應所致的肺損傷。

通過跑臺運動訓練可明顯減輕大鼠SCI后肺損傷程度，并下調(diào)HMGB1的表達，改善SCI后大鼠肺功能。具體機制還需進一步實驗研究，有望為臨床指導治療脊髓損傷后肺損傷提供新的理論依據(jù)。