活化淋巴細(xì)胞免疫治療對不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的療效和機(jī)制探討

劉 璐，張 慧

[中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院（光明）產(chǎn)一科，廣東 深圳 518107]

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是婦產(chǎn)科臨床中的常見疾病，醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)在所有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中占比40%～50%，已成為臨床治療中的重點與難點[1]。自上世紀(jì)80年代以來，臨床開始應(yīng)用淋巴細(xì)胞主動免疫療法治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，但仍有近30%的患者治療后仍無法成功妊娠[2]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，通過對淋巴細(xì)胞群體進(jìn)行白介素-2（IL-2）、白介素-12（IL-12）體外活化，刺激其增殖后，可提升淋巴細(xì)胞主動免疫療法的治療效果[3]。對此，本次研究回顧性分析110例不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的臨床資料，旨在探究活化淋巴細(xì)胞免疫治療對不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的療效與機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料對中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院（光明）2017年1月至2019年10月收治的110例不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，根據(jù)治療方法的不同分為A組與B組，各55例。A組患者年齡22～42歲，平均（32.03±3.75）歲；流產(chǎn)次數(shù)2～5次，平均（3.43±1.15）次。B組患者年齡25～40歲，平均（31.57±3.68）歲；流產(chǎn)次數(shù)2～5次，平均（3.23±1.17）次。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），組間具有可比性。本研究經(jīng)院內(nèi)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：有2次及以上的自然流產(chǎn)史；夫妻雙方染色體G帶染色體核型分析正常，無家族遺傳病史；無明顯生殖道畸形或者形態(tài)學(xué)異常；無生殖道感染，生殖內(nèi)分泌激素檢查均正常；封閉抗體陰性；月經(jīng)周期正常，排卵正常；抗丈夫淋巴細(xì)胞毒性試驗呈陰性；研究前3個月未經(jīng)任何免疫治療或接種；未使用過任何調(diào)節(jié)免疫功能類藥物；男方精液分析正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有惡性腫瘤者；臨床血常規(guī)檢查結(jié)果存在異常者；近3個月內(nèi)接受過免疫治療、疫苗接種或者應(yīng)用過調(diào)節(jié)免疫功能藥物者。

1.2 方法 A組患者進(jìn)行常規(guī)淋巴細(xì)胞免疫治療，從計劃妊娠前3個月開始，由配偶提供外周靜脈血20 mL制作免疫原，采用密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞，無菌生理鹽水洗滌3次，清除血小板，以生理鹽水稀釋淋巴細(xì)胞懸液至濃度為（2～4）×107個/mL，從患者雙側(cè)前臂內(nèi)側(cè)選取4～6點進(jìn)行皮下注射，0.2～0.3 mL/點，30 min后觀察局部是否發(fā)生水泡、紅腫、血腫等，每2周注射1次，4次為1個療程。B組患者進(jìn)行活化淋巴細(xì)胞主動免疫治療，按照A組的方法獲取淋巴細(xì)胞，用IL-2、IL-12對細(xì)胞進(jìn)行活化增殖刺激，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后收集活化后的淋巴細(xì)胞，按照A組的方法稀釋淋巴細(xì)胞并對患者進(jìn)行注射治療，劑量與頻率同A組。完成免疫治療后2周檢測患者的封閉抗體，結(jié)果顯示陽性則建議計劃妊娠。確定妊娠后，每間隔3周分別再按上述免疫治療方法繼續(xù)進(jìn)行鞏固免疫治療直至妊娠16周。

1.3 觀察指標(biāo)①在首次治療前、治療1個療程后的2周，抽取患者的外周靜脈血5 mL，經(jīng)3 000 r/min離心10 min分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測封閉抗體；凡是封閉抗體轉(zhuǎn)為陽性者，即可進(jìn)行指導(dǎo)受孕。②外周血淋巴細(xì)胞Fas的檢測，血液采集方法同①，用流式細(xì)胞儀檢測外周血CD4+CD95+、CD8+CD95+、CD56+CD95+百分比。③采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清γ-干擾素（INF-γ）、白介素-4（IL-4）水平，血液采集與處理方法同①。④凡是孕期＞16周超聲提示活胎者可被定義為治療成功，對兩組患者的妊娠結(jié)局進(jìn)行統(tǒng)計比較。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用[例(%)]表示，采用χ2檢驗；計量資料用表示，采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 封閉抗體轉(zhuǎn)陽率 B組患者治療后封閉抗體轉(zhuǎn)陽率顯著高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者封閉抗體轉(zhuǎn)陽率比較[ 例(%)]

2.2 Fas 表達(dá)情況兩組患者治療后外周血CD8+CD95+、CD56+CD95+百分比均較治療前顯著降低，且B組患者外周血CD4+CD95+、CD8+CD95+、CD56+CD95+百分比均顯著低于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者Fas 表達(dá)情況比較( , %)

表2 兩組患者Fas 表達(dá)情況比較( , %)

注：與治療前比，*P＜0.05。

CD4+CD95+ CD8+CD95+ CD56+CD95+治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后A 組 55 18.88±3.28 18.56±1.75 14.08±2.33 11.76±2.87* 15.56±1.76 11.67±1.37*B 組 55 18.09±3.42 17.26±1.33 13.36±1.69 9.52±2.44* 15.19±1.12 9.22±1.06*t 值 1.236 4.386 1.855 4.409 1.315 10.489 P 值 ＞ 0.05 ＜ 0.05 ＞ 0.05 ＜ 0.05 ＞ 0.05 ＜ 0.05組別 例數(shù)

2.3 細(xì)胞因子指標(biāo)治療后兩組患者血清INF-γ 水平均顯著降低，B組顯著低于A組，B組患者血清IL-4水平均顯著升高，且顯著高于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表3 兩組患者細(xì)胞因子指標(biāo)比較()

表3 兩組患者細(xì)胞因子指標(biāo)比較()

注：與治療前比，*P＜0.05。INF-γ：γ-干擾素；IL-4：白介素-4。

組別 例數(shù) INF-γ(μg/L) IL-4(pg/mL)治療前 治療后 治療前 治療后A 組 55 15.23±1.97 13.56±1.82* 9.67±2.22 10.45±2.65 B 組 55 15.33±1.65 12.18±1.54* 10.37±3.18 13.65±2.33*t 值 0.293 4.293 1.339 6.725 P 值 ＞ 0.05 ＜ 0.05 ＞ 0.05 ＜ 0.05

2.4 妊娠結(jié)局 B組患者總治療成功率顯著高于A組，流產(chǎn)率顯著低于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表4。

表4 兩組患者妊娠結(jié)局比較[ 例(%)]

3 討論

目前醫(yī)學(xué)界將不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)定位為一種免疫性疾病，其治療以主動免疫療法與被動免疫治療為主。上世紀(jì)80年代初期，就有學(xué)者開創(chuàng)了淋巴細(xì)胞主動免疫療法，該治療方法可誘導(dǎo)母體產(chǎn)生足量的封閉抗體，降低了自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的數(shù)量與活性，調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞因子的生成，使得母體產(chǎn)生一種微嵌合的狀態(tài)，而這些生理上的改變都將改善最終的妊娠結(jié)局[4]。有研究數(shù)據(jù)顯示，接受了淋巴細(xì)胞主動免疫治療后，不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的妊娠成功率高達(dá)60%及以上，這個成功率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于沒有接受過淋巴細(xì)胞免疫療法的患者[5]。但是研究還發(fā)現(xiàn)，臨床上仍有30%左右患者經(jīng)過常規(guī)性淋巴細(xì)胞免疫治療后，仍無法取得有效的治療效果[6]。因此，在常規(guī)性免疫治療的基礎(chǔ)之上如何提升整體治療效果，提高不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的妊娠率與活產(chǎn)率是研究復(fù)發(fā)性流產(chǎn)治療方法的新難題與關(guān)鍵點。活化淋巴細(xì)胞免疫治療過程中主要應(yīng)用IL-2、IL-12對細(xì)胞進(jìn)行活化增殖刺激，其中IL-2可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖分化和誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒活性，IL-12單獨不能引起淋巴細(xì)胞增殖，但可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒活性，與IL-2協(xié)同可以使這種效應(yīng)明顯增強(qiáng)。本研究的結(jié)果顯示，B組患者治療后封閉抗體轉(zhuǎn)陽率顯著高于A組，總治療成功率顯著高于A組，流產(chǎn)率顯著低于A組，提示應(yīng)用了活化淋巴細(xì)胞免疫治療后，不僅提高了患者的封閉抗體的轉(zhuǎn)陽率，同時還提升了不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的妊娠率，降低了流產(chǎn)率，改善了妊娠結(jié)局，治療效果較為明顯。

不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的發(fā)病原因復(fù)雜，可能的發(fā)病機(jī)制為染色體異常、內(nèi)分泌紊亂、生殖道異常、感染等；隨著對疾病研究的深入，從生殖免疫學(xué)角度來說，正常情況下，母體與胚胎、胎兒之間可以建立免疫平衡，讓其穩(wěn)定生長，而不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生可能與孕期母體對胎兒來自父系抗原呈低識別和低反應(yīng)，無法產(chǎn)生足夠的保護(hù)性封閉性抗體，從而導(dǎo)致免疫動態(tài)失衡，一旦無法達(dá)成這種平衡，母體將對胚胎、胎兒產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫排斥，造成流產(chǎn)的發(fā)生[7-8]。本研究中，治療后B組患者外周血CD4+CD95+、CD8+CD95+、CD56+CD95+百分比均顯著低于A組，血清INF-γ 水平顯著低于A組，血清IL-4水平顯著高于A組，提示活化淋巴細(xì)胞免疫治療可能是通過降低外周血淋巴細(xì)胞Fas表達(dá)，調(diào)控血清INF-γ、IL-4水平，促進(jìn)Th1/Th2細(xì)胞因子恢復(fù)平衡而發(fā)揮治療作用。

綜上，與常規(guī)淋巴細(xì)胞免疫治療相比，活化淋巴細(xì)胞免疫治療不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的封閉抗體轉(zhuǎn)陽率升高，同時改善了患者的妊娠結(jié)局，可能與降低外周血淋巴細(xì)胞Fas表達(dá)，調(diào)控血清INF-γ、IL-4水平有關(guān)，值得臨床推廣。