外周血淋巴細胞亞群分布對同種免疫型復發(fā)性流產(chǎn)病因及淋巴細胞免疫治療效果的評估價值

陳麗莉 陳建安 黎麗芬 朱學海 林偲思

【摘要】 目的：探討外周血淋巴細胞亞群對同種免疫型復發(fā)性流產(chǎn)病因及淋巴細胞主動免疫治療（LIT）效果的評估價值。方法：選取2015年4月-2018年4月本院收治的自愿接受LIT的同種免疫型復發(fā)性流產(chǎn)患者85例作為觀察組，以同期正常妊娠者78例作為對照組，比較兩組外周血淋巴細胞亞群分布差異。對接受LIT的患者，比較一療程組與兩療程組患者外周血淋巴細胞亞群分布差異。結(jié)果：觀察組與對照組的外周血CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、Th/Ts、CD19+B細胞、CD3-CD56+NK細胞比例比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;一療程組治療前CD4+CD25+T細胞比例顯著高于兩療程組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;一療程組與兩療程組治療前的CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、CD19+B細胞、CD3-CD56+NK細胞、CD3-CD56+CD16-NK細胞比例比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論：外周血CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、Th/Ts、CD19+B細胞及CD3-CD56+NK細胞比例不能對同種免疫型復發(fā)性流產(chǎn)進行病因評估，外周血淋巴細胞亞群是否能評估同種免疫型復發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生仍需多組數(shù)據(jù)論證。患者外周血CD4+CD25+T細胞可在淋巴細胞免疫治療前預評估封閉抗體轉(zhuǎn)為陽性情況，為評估治療效果提供參考。

【關(guān)鍵詞】 同種免疫型復發(fā)性流產(chǎn) 淋巴細胞亞群 淋巴細胞免疫治療 封閉抗體

[Abstract] Objective： To evaluate the value of peripheral blood lymphocyte subsets on the etiology of recurrent alloimmune abortion and the efficacy of lymphocyte immunotherapy treatment （LIT）. Method： A total of 85 cases of voluntary LIT recurrent alloimmune abortion patients admitted to our hospital from April 2015 to April 2018 were selected as the observation group， 78 cases of normal pregnancy during the same period were taken as the control group. The distribution of peripheral blood lymphocyte subsets was compared between the two groups. For patients received LIT， the distribution of peripheral blood lymphocyte subsets between the one-course group and two-course group was compared. Result： The ratio of CD3+T cells， CD3+CD4+T cells， CD3+CD8+T cells， Th/Ts， CD19+B cells and CD3-CD56+NK cells in peripheral blood of the observation group and the control group were compared， the differences were not statistically significant （P>0.05）. The proportion of CD4+CD25+T cells in the one-course group before treatment was significantly higher than that in the two-course group， the difference was statistically significant （P<0.05）. The ratio of CD3+T cells， CD3+CD4+T cells， CD3+CD8+T cells， CD19+B cells， CD3-CD56+NK cells and CD3-CD56+CD16-NK cells in the one-course group and two-course group were compared， there were no significant differences （P>0.05）. Conclusion： The ratio of CD3+CD4+T cells， CD3+CD8+T cells， Th/Ts， CD19+B cells and CD3-CD56+NK cells in peripheral blood cannot be used to evaluate the etiology of recurrent alloimmune abortion， and multiple sets of data are still needed to evaluate whether the lymphocyte subsets in peripheral blood can evaluate the occurrence of recurrent alloimmune abortion. CD4+CD25+T cells in peripheral blood of patients can be used to evaluate the positive status of blocking antibody before lymphocyte immunotherapy， providing a reference for the evaluation of treatment effect.

復發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion， RSA）是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次及以上妊娠28周前的自然流產(chǎn)，其發(fā)生率為1%～4%[1-3]。在RSA的眾多病因中，同種免疫異常所占比例最高[4]。同種免疫型復發(fā)性流產(chǎn)又被稱為不明原因復發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion， URSA），即排除遺傳、解剖、內(nèi)分泌、感染、自身免疫、血栓前狀態(tài)、孕婦的全身性疾病等病因的RSA。以往許多研究集中在URSA發(fā)病機制與淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)關(guān)系上，但對于外周血淋巴細胞是否能反映母胎界面免疫狀態(tài)的結(jié)論多不一致。另外，國內(nèi)研究認為淋巴細胞免疫治療（lymphocyte immunotherapy treatment， LIT）可明顯改善URSA患者的妊娠結(jié)局，但目前對LIT的治療劑量和方案沒有統(tǒng)一標準[5-6]，對于不同患者的治療方案調(diào)整亦沒有理論依據(jù)支持，因此本文擬評估本院URSA患者外周血淋巴細胞亞群對URSA發(fā)生的價值，進而評估LIT前URSA患者外周血淋巴細胞亞群對LIT療效的預評估作用?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年4月-2018年4月本院收治的自愿接受LIT的同種免疫型復發(fā)性流產(chǎn)患者85例以及同期正常妊娠者78例為研究對象。納入標準：（1）連續(xù)3次以上自然流產(chǎn)且封閉抗體陰性;（2）通過分泌物檢查排除生殖器感染;（3）通過超聲或?qū)m腔鏡排除生殖器異常及其他病變;（4）抗子宮內(nèi)膜抗體、抗卵巢抗體、抗絨毛膜促性腺激素抗體、抗精子抗體、抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體均為陰性;（5）凝血功能正常;（6）男方精液常規(guī)正常、抗精子抗體、支原體、衣原體、乙肝病毒、HIV、梅毒抗體等均為陰性;（7）夫妻TORCH-IgM病毒抗體陰性;（8）夫妻染色體核型分析正常且非近親結(jié)婚;（9）研究對象以往均未接受過LIT。排除標準：（1）通過輔助生殖技術(shù)受孕的患者;（2）年齡大于43歲的患者。以85例患者為觀察組，以78例正常妊娠者為對照組。夫妻雙方均對LIT充分了解，研究對象均簽署知情同意書，研究已經(jīng)醫(yī)院倫理學委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 檢測及治療方法 （1）封閉抗體檢測：采集患者肘靜脈血2 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗進行外周血封閉抗體檢測，每次檢測均設(shè)陰性、陽性和空白對照，檢測步驟及結(jié)果判讀嚴格按照試劑盒說明書進行。（2）外周血淋巴細胞亞群檢測：采集患者肘靜脈血2 mL EDTA-K2抗凝，分別取抗凝全血50 μL加入4個流式細胞計數(shù)試管中，分別往第1管加入CD45-FITC、CD3-PC5、CD8-ECD、CD4-RD1抗體各5 μL，第2管加入CD45-FITC、CD19-ECD、CD56-RD1抗體各5 μL，第3管加入CD45-Cy7、CD4-PE、CD25-FITC抗體各5 μL，第4管加入CD45-FITC、CD3-PC5、CD16-PE、CD56-RD1抗體各5 μL，避光反應20 min后，加入紅細胞裂解液500 μL，避光反應20 min后加入PBS緩沖液，用流式細胞儀分析計算淋巴細胞亞群比例。（3）淋巴細胞分離方法：患者丈夫無肝炎、梅毒、艾滋病及TORCH病毒感染方可作為LIT的細胞供給者。采集淋巴細胞供給者外周血30 mL（肝素鈉抗凝），緩緩加入到20 mL淋巴細胞分離液中，2 000 r/min離心30 min，收集中間層細胞放入含6 mL生理鹽水的試管中混勻，2 000 r/min離心5 min，棄去上清后用生理鹽水反復洗滌沉淀物2次，最后配制成濃度為（2～4）×107/mL的淋巴細胞懸液。（4）LIT方法：取濃度為（2～4）×107/mL的淋巴細胞懸液在患者手臂內(nèi)側(cè)進行8～10個點皮內(nèi)注射。每3周1次，4次為1個療程，治療1個療程后復查封閉抗體，封閉抗體轉(zhuǎn)為陽性即指導受孕，受孕后每2周接受LIT 1次，直至妊娠10周后調(diào)整治療方案為每3周接受LIT 1次，直到妊娠16周治療結(jié)束。治療1療程后封閉抗體仍未轉(zhuǎn)為陽性者，繼續(xù)下一療程治療，直至封閉抗體轉(zhuǎn)為陽性后再鼓勵受孕。經(jīng)過兩個療程治療后封閉抗體仍未轉(zhuǎn)為陽性者，不列入本次研究范疇。

1.2.2 儀器與試劑 封閉抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）為北京索奧生生物科技有限公司提供，淋巴細胞分離液為美德太平洋（天津）生物科技股份有限公司提供，CD3-PC5、CD8-ECD、CD4-RD1、CD45-FITC、CD19-ECD、CD56-RD1、CD3-ECD、CD4-PE、CD25-FITC、CD56-PE、CD16-FITC、CD45-Cy7等熒光抗體試劑為美國貝克曼-庫爾特公司提供，F(xiàn)C500 MCL流式細胞儀為美國貝克曼-庫爾特公司生產(chǎn)，BC5380全自動血球分析儀為深圳邁瑞公司生產(chǎn)，飛鴿牌Anke TDL-5-A型水平離心機，廣州陽普EDTA-K2抗凝管、分離膠-促凝劑促凝管，肝素鈉注射液（生產(chǎn)廠家：上海第一生化藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字H31022051，規(guī)格：2 mL︰12 500單位）。

1.3 觀察指標及判定標準 比較兩組外周血淋巴細胞亞群;比較LIT一療程組與兩療程組治療前外周血淋巴細胞亞群比例。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;不符合正態(tài)分布以[M（P25，P75）]描述，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗;計數(shù)資料用率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 觀察組年齡24～42歲，平均（30.8±4.6）歲;對照組年齡22～40歲，平均（29.5±4.2）歲。兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組外周血淋巴細胞亞群比較 兩組外周血CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、Th/Ts、CD19+B細胞、CD3-CD56+NK細胞比例比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

2.3 一療程組與兩療程組治療前外周血淋巴細胞亞群比例比較 85例接受LIT的URSA患者中，經(jīng)一療程治療后封閉抗體轉(zhuǎn)為陽性者占75.3%（64/85），經(jīng)兩療程治療后封閉抗體轉(zhuǎn)為陽性者占23.5%（20/85），1例經(jīng)兩療程治療后封閉抗體仍為陰性。一療程組年齡25～42歲，平均（31.3±4.9）歲，流產(chǎn)3～6次，平均（4.2±0.8）次;兩療程組年齡24～41歲，平均（30.7±4.5）歲，流產(chǎn)3～6次，平均（3.9±0.7）次。兩組患者年齡、流產(chǎn)次數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。一療程組治療前CD4+CD25+T細胞比例顯著高于兩療程組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;一療程組與兩療程組的CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、CD19+B細胞、CD3-CD56+NK細胞、CD3-CD56+CD16-NK細胞比例比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

3 討論

同種免疫耐受異常被認為是URSA發(fā)生的主要原因，但造成同種免疫耐受異常的因素很多，具體病理機制尚未明確[7-9]。近年來很多研究表明同種免疫耐受機制與T淋巴細胞、自然殺傷（NK）細胞、巨噬細胞等多種職能細胞的表達及調(diào)節(jié)功能等因素相關(guān)，在妊娠后，胚胎得以在母體內(nèi)存活主要依靠母體與胚胎之間形成的免疫耐受，如果兩者之間的免疫耐受失衡，母體對胚胎就會產(chǎn)生排斥反應，最終導致流產(chǎn)[10]。目前對母體免疫職能細胞的研究主要分兩部分，一部分為研究母體外周血淋巴細胞，另一部分為研究母胎界面的淋巴細胞。其中對母體外周血淋巴細胞的研究結(jié)論爭議較大，有研究顯示外周血T淋巴細胞數(shù)量及活性與URSA無相關(guān)性，NK淋巴細胞數(shù)量及活性與URSA明顯相關(guān)[11-12]，另有研究則認為URSA患者外周血T淋巴細胞、NK淋巴細胞數(shù)量及活性均顯著增高[13]。另一方面，羅智華等[14]對母胎界面的淋巴細胞進行研究，認為子宮內(nèi)膜的淋巴細胞與外周血相應的淋巴細胞之間無顯著相關(guān)性，子宮內(nèi)膜淋巴細胞亞群比例變化可能才是母胎交互作用的重要反映。本文通過對比URSA患者與正常妊娠者的外周血淋巴細胞亞群比例，結(jié)果顯示兩組外周血CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、Th/Ts、CD19+B細胞、CD3-CD56+NK細胞比例比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與上述研究結(jié)論較為一致，推測外周血淋巴細胞亞群比例并不能反映母胎界面的免疫狀況。這里值得注意的是，雖然本研究顯示URSA患者外周血淋巴細胞亞群比例與正常妊娠人群沒有顯著差異，但不排除兩者的外周血淋巴細胞活性存在差異，因此外周血淋巴細胞能否反映同種免疫耐受的機制尚需多組數(shù)據(jù)論證。

封閉抗體（blocking antibody， BA）是針對胚胎人類白細胞Ⅱ類抗原（HLA-Ⅱ）和滋養(yǎng)淋巴細胞交叉抗原（TLX）而產(chǎn)生的，可通過與胎兒胎盤滋養(yǎng)層抗原結(jié)合或與母體淋巴細胞結(jié)合而防止胚胎父系抗原被母體免疫系統(tǒng)識別和殺傷，阻止胚胎滋養(yǎng)細胞遭受免疫攻擊[15]。BA缺乏是URSA發(fā)生的重要原因之一[16]，目前對于BA缺乏的URSA患者，較多采用丈夫或第三方外周血淋巴細胞進行免疫治療，治療后當BA轉(zhuǎn)為陽性時即指導患者受孕[17-18]。本次研究發(fā)現(xiàn)，部分患者經(jīng)一個療程治療后即可使封閉抗體轉(zhuǎn)為陽性，而部分患者則需要兩個療程才能使封閉抗體轉(zhuǎn)為陽性，但對于不同的患者，目前均采用相同的治療劑量和治療方案，如能篩選出對免疫治療療效起到預評估作用的指標，則可為治療劑量或方案的調(diào)整提供參考。本次研究結(jié)果顯示，一療程組治療前CD4+CD25+T細胞比例顯著高于兩療程組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;一療程組與兩療程組的CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、CD19+B細胞、CD3-CD56+NK細胞、CD3-CD56+CD16-NK細胞比例比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。CD4+CD25+T細胞是近年發(fā)現(xiàn)的CD4+T淋巴細胞的子集，其通過細胞間抑制或分泌抑制性細胞因子發(fā)揮作用，是一種具有免疫抑制作用的細胞群[19]。CD4+CD25+T細胞除了可增強母體對胚胎的免疫耐受，保護胚胎不受同種異體免疫攻擊外[20]，本文結(jié)果還提示治療前外周血CD4+CD25+T細胞可評估患者免疫治療后BA轉(zhuǎn)為陽性情況，為預評估免疫治療療效及免疫治療劑量或方案調(diào)整提供參考。

URSA病因復雜，本文暫未發(fā)現(xiàn)外周血CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、Th/Ts、CD19+B細胞及CD3-CD56+NK細胞比例可對URSA進行病因評估，外周血淋巴細胞亞群是否能評估URSA的發(fā)生仍需多組數(shù)據(jù)論證。而對于URSA患者，接受免疫治療前外周血CD4+CD25+T細胞比例可評估免疫治療后BA轉(zhuǎn)為陽性的情況，CD4+CD25+T細胞比例低的患者，其BA轉(zhuǎn)為陽性的治療療程長，因此外周血CD4+CD25+T細胞可為免疫治療的劑量及方案調(diào)整提供參考。

參考文獻

[1]中華醫(yī)學會婦產(chǎn)科學分會產(chǎn)科學組.復發(fā)性流產(chǎn)診治的專家共識[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2016，51（1）：3-9.

[2]翟志成.免疫異常流產(chǎn)機制研究進展[J].海南醫(yī)學，2019，30（8）：1069-1072.

[3]黃紅麗，何文鳳，姜艷華，等.染色體微陣列技術(shù)用于復發(fā)性流產(chǎn)病因診斷中的價值評價[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2019，16（30）：132-135.

[4]孟麗麗，王振花，陳慧，等.復發(fā)性流產(chǎn)的高危因素分析[J].廣東醫(yī)學，2013，34（9）：1397-1400.

[5] Pandey M K，Thakur S，Agrawal S.Lymphocyte immunotherapy and its probable mechanism in the maintenance of pregnancy in women with recurrent spontaneous abortion[J].Arch Gynecol Obstet，2004，269（3）：161-172.

[6] Pandey M K，Agrawal S.Induction of MLR-Bf and protection of fetal loss： a current double blind randomized trial of paternal lymphocyte immunization for women with recurrent spontaneous abortion[J].Int Immunopharmacol，2004，4（2）：289-298.

[7]李莉，喬杰，王海燕.不明原因復發(fā)性流產(chǎn)免疫學發(fā)病機制的研究進展[J].中華生殖與避孕雜志，2017，37（2）：160-165.

[8]錢金鳳，李大金，王凌.Treg/Th17在不明原因復發(fā)性流產(chǎn)中的作用機制[J].中華生殖與避孕雜志，2017，37（11）：942-946.

[9]羅娜，林彤，范立青.Th17/Treg細胞及IL-17與不明原因復發(fā)性流產(chǎn)關(guān)系的研究[J].解放軍醫(yī)學院學報，2018，39（6）：487-490.

[10]蔡小核.外周血單核細胞CD169表達與不明原因復發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性研究[D].溫州：溫州醫(yī)科大學，2017.

[11] Park D W，Lee H J，Park C W，et al.Peripheral blood NK cells reflect changes in decidual NK cells in women with recurrent miscarriages[J].Am J Reprod Immunol，2010，63（2）：173-180.

[12]李醫(yī).不明原因復發(fā)性自然流產(chǎn)患者NK細胞的數(shù)量及活性研究[J].中國婦幼保健，2015，30（33）：5827-5828.

[13]司斯.不明原因復發(fā)性自然流產(chǎn)患者外周血T淋巴細胞亞群和NK細胞特征分析[J].臨床軍醫(yī)雜志，2016，44（6）：634-636.

[14]羅智華，姚吉龍.復發(fā)性流產(chǎn)患者主動免疫治療前后種植窗外周血及子宮內(nèi)膜淋巴細胞亞群變化[J].東南大學學報（醫(yī)學版），2018，37（1）：91-96.

[15]彭婀娜，姚若進.不明原因復發(fā)性流產(chǎn)主動免疫治療前后封閉抗體的變化及其意義[J].實用婦產(chǎn)科雜志，2010，26（10）：773-775.

[16]石瑛，路璐，王云鳳，等.反復自然流產(chǎn)與封閉抗體相關(guān)性的Meta分析[J].中國實驗診斷學，2017，21（7）：1195-1198.

[17]方勝英，楊曉琴.阿司匹林聯(lián)合肝素對高D-二聚體復發(fā)性流產(chǎn)TXA2、PGI2的影響[J].中外醫(yī)學研究，2017，15（21）：31-33.

[18]吳培莉，薛晴.不明原因復發(fā)性流產(chǎn)的免疫治療策略[J].中國計劃生育學雜志，2018，26（12）：1259-1264.

[19] Dasgupta A，Saxena R.Regulatory T cells： a review[J].Natl Med J India，2012，25（6）：341-351.

[20]郭玉琪，李曉倩，張俊清，等.復發(fā)性流產(chǎn)患者免疫治療前后T淋巴細胞表達率與治療效果的臨床觀察[J].中國計劃生育學雜志，2014，22（1）：41-43.

（收稿日期：2020-01-09） （本文編輯：姬思雨）