高產(chǎn)活性成分蛹蟲草菌株的篩選

柯軼，王娜，魏瑜，周昀，余寶珍，張貴和，陳玉舜

摘要：對(duì)7株不同的蛹蟲草菌株進(jìn)行比較分析，以期篩選得到高產(chǎn)活性成分的優(yōu)質(zhì)蛹蟲草菌株。通過對(duì)7株蛹蟲草菌株子實(shí)體的形態(tài)、產(chǎn)量、子實(shí)體中活性成分（蟲草素、蟲草酸、腺苷、蟲草粗多糖）的含量等進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果表明，菌株H05綜合品質(zhì)最好，子實(shí)體產(chǎn)量可達(dá)204 g·瓶-1，蟲草素含量為0523%、腺苷含量為0556%、蟲草酸含量為497%，蟲草粗多糖含量為989%。此菌株子實(shí)體產(chǎn)量高，活性成分含量也較高，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，值得開發(fā)利用。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草;子實(shí)體;活性成分;高含量

中圖分類號(hào)：S 5673 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2021）02-0014-05

DOI： 1013651/jcnkifjnykj202102003

Screening of Cordyceps Militaris Strains Produced Highyield Active Ingredients

KE Yi1， WANG Na1， WEI Yu1， ZHOU Yun1， YU Baozhen2， ZHANG Guihe2， CHEN Yushun3

（1. Fujian Vocational College of Bioengineering， Fuzhou， Fujian 350008， China; 2. Fuzhou Huisheng Edible

Fungi Co.， Ltd.， Fuzhou， Fujian 350008， China; 3. HUNGKUANG University， Taichung， Taiwan 43302， China）

Abstract： Seven different strains of Cordyceps militaris were compared and analyzed in order to select the highquality strains of Cordyceps militaris with highyield active ingredients. The morphology， yield and content of active ingredients （cordycepin， cordycepic acid， adenosine and cordyceps crude polysaccharide） in the fruiting body of the seven strains of Cordyceps militaris were studied comparatively. The results showed that the strain H05 had the best comprehensive quality， and the yield of fruiting body was 20.4 g per bottle， the cordycepin content was 0.523%， adenosine content was 0.556%， cordycepic acid content was 4.97%， and the cordyceps crude polysaccharide content was 9.89%. The strain had high yield of fruiting body， high content of active ingredients and high economic value， and was worthy of development and utilization.

Key words： Cordyceps militaris; Fruiting body; Active ingredients; High content

蛹蟲草Cordyceps militaris又稱為北蟲草、北冬蟲夏草，隸屬于真菌界的子囊菌們Ascomycota、肉座菌目Hypocreales、麥角菌科Clavicip itaceae，是世界性廣布種＼[1＼]。在我國的遼寧、福建、陜西、云南、臺(tái)灣等地區(qū)均有分布＼[2-3＼]。通過對(duì)蛹蟲草的化學(xué)成分和藥理研究表明，其營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多種活性物質(zhì)，如蟲草素、蟲草酸、腺苷、蟲草多糖、氨基酸、麥角固醇、多酚等，具有鎮(zhèn)靜催眠、提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、防止衰老、保護(hù)心肺組織等多種藥理作用＼[4-6＼]。文獻(xiàn)報(bào)道蛹蟲草的成分與天然的冬蟲夏草十分相似，《全國中草藥匯編》記載：“蛹蟲草的子實(shí)體及蟲體也可作為冬蟲夏草入藥”，且藥用活性成分平均含量如蟲草素、氨基酸等，明顯高于冬蟲夏草＼[7-10＼]，這一特性，使得蛹蟲草可以作為冬蟲夏草的良好替代品?，F(xiàn)今，蛹蟲草已在全國各地實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化栽培，具有廣闊的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展前景。但是菌種退化、產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺失、精品缺乏等問題依然困擾著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

蛹蟲草的活性成分含量決定了蛹蟲草的保健價(jià)值＼[11＼]。沈陽師范大學(xué)蛹蟲草研究團(tuán)隊(duì)于2008年提出了功能性蛹蟲草概念，重點(diǎn)圍繞菌種、成分、評(píng)價(jià)和產(chǎn)品四個(gè)方向開展研究工作＼[12＼]。目前關(guān)于蛹蟲草菌株篩選的研究，對(duì)綜合子實(shí)體產(chǎn)量及多種活性成分含量的研究較少，更多集中于子實(shí)體的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)量以及形態(tài)等方面，對(duì)子實(shí)體中活性成分含量的研究?jī)H集中于1～2種活性成分上，如多糖、蟲草素等＼[13-22＼]。

本研究通過對(duì)7株不同的蛹蟲草菌株進(jìn)行了子實(shí)體栽培試驗(yàn)及4種活性成分（蟲草素、蟲草酸、腺苷、蟲草粗多糖）檢測(cè)，綜合蛹蟲草子實(shí)體形態(tài)、產(chǎn)量及4種活性成分含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以期篩選得到具有高產(chǎn)活性成分的優(yōu)良蛹蟲草菌株，提升蛹蟲草的開發(fā)價(jià)值，為蛹蟲草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供科學(xué)參考。

1材料與方法

11材料、試劑和儀器

柯軼等：高產(chǎn)活性成分蛹蟲草菌株的篩選2021年第2期2021年第2期柯軼等：高產(chǎn)活性成分蛹蟲草菌株的篩選111供試菌株蛹蟲草菌株H01、H02、H03來自臺(tái)灣弘光科技大學(xué)陳玉舜教授實(shí)驗(yàn)室，菌株H04來自福州惠生食用菌有限公司自有菌株，菌株H05、H06、H07來自福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院柯軼老師實(shí)驗(yàn)室。

112主要試劑和儀器標(biāo)準(zhǔn)品腺苷、蟲草素（3′脫氧腺苷）、D無水葡萄糖均來自中國食品藥品鑒定研究院，純度99%;試劑乙腈、磷酸二氫鉀為色譜純，磷酸鉀、過碘酸鈉、硫酸、硫代硫酸鈉、碘化鉀、VB1、VB2、硫酸鎂為分析純。

113主要設(shè)備LC2030 3D高效液相色譜儀（日本島津株式會(huì)社）、T6可見/紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）。

12培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：土豆200 g、葡萄糖20 g、KH2PO4 5 g、MgSO4 2 g、VB1 10 mg、VB2 5 mg、水1000 mL、pH 64 的比例配成液體種子培養(yǎng)基。

固體培養(yǎng)基：按土豆200 g、葡萄糖20 g、KH2PO4 2 g、MgSO4 1 g、VB2 5 mg、水1000 mL、瓊脂20 g、pH 64的比例配成固體培養(yǎng)基。

大米栽培培養(yǎng)基：將大米和水按（1∶1～1∶11）的比例范圍加入透明的食品級(jí)玻璃瓶中，瓶口密封，每瓶大米裝料量為35 g。

137株蛹蟲草子實(shí)體的培養(yǎng)

131原種制作在無菌條件下將菌株接種至固體培養(yǎng)基平板活化，22℃黑暗培養(yǎng)。

132栽培種選擇菌絲潔白無轉(zhuǎn)色，長(zhǎng)勢(shì)旺盛的原種平板，在無菌條件下，取2～3塊05 cm2的菌塊接種到500 mL三角瓶中，裝液量約為瓶容量的35%，22℃、150 r·min-1黑暗振蕩培養(yǎng)5～7 d。

133人工栽培選取菌液澄清透明，菌絲呈球狀、片狀和絲狀均勻分布，無異味，無雜菌的栽培種，在無菌條件下，以2 mL·瓶-1的接種量接入栽培瓶。接種后的培養(yǎng)基移入培養(yǎng)室，溫度18～22℃，濕度60%～70%，避光培養(yǎng)17～20 d，待菌絲布滿整個(gè)瓶面并深扎到瓶底，開始見光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度控制在（200±50） lx，光照時(shí)間 （10±1）h·d-1，溫度（20±2）℃，濕度65%～75%，培養(yǎng)至原基出現(xiàn)。調(diào)整光照時(shí)間為 8 h·d-1，溫度（18±1）℃，濕度控制在85%～90%，培養(yǎng)45～50 d至子實(shí)體成熟并長(zhǎng)滿全瓶時(shí)收獲，記錄每瓶子實(shí)體產(chǎn)量及菌株形態(tài)。

14活性成分測(cè)定

樣品經(jīng)60℃烘至恒重后測(cè)定蟲草粗多糖、蟲草素、蟲草酸、腺苷的含量。蟲草粗多糖提取采用先醇提再水提的方法進(jìn)行，含量測(cè)定采用苯酚硫酸法進(jìn)行。蟲草酸的檢測(cè)采用滴定法進(jìn)行檢測(cè)。核苷類成分采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，其中蟲草素的檢測(cè)條件色譜柱為ZORBAX SBAq （250 mm×46 mm），流動(dòng)相為乙腈∶水（10∶90），流速為1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20 μL＼[23＼];腺苷的檢測(cè)條件為，色譜柱：RP18e（250 mm×46 mm，merck），流動(dòng)相：乙腈∶001 mol·t-1 NaHPO4（5∶95），流速：1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20 μL＼[11＼];每個(gè)檢測(cè)樣品做3個(gè)平行試驗(yàn)。

15品質(zhì)評(píng)價(jià)

為了便于不同單位、不同量級(jí)的指標(biāo)能夠進(jìn)行比較和加權(quán)，利用最大-最小歸一化算法處理＼[24＼]，Y=（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）進(jìn)行歸一化處理，對(duì)7株蛹蟲草菌株中活性成分含量及子實(shí)體產(chǎn)量進(jìn)行分析。再綜合各成分所得的分值，繪制雷達(dá)圖，進(jìn)行品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)。

16數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 170進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行單因素Anova分析，以Duncan′s分析比較差異顯著性。

2結(jié)果與分析

217株蛹蟲草菌株人工栽培形態(tài)比較分析

從圖1和表1可以看出，7株蛹蟲草子實(shí)體中，菌株H05、H03的長(zhǎng)勢(shì)較好，粗細(xì)均勻，子實(shí)體長(zhǎng)度較長(zhǎng)，出草率高，菌株H01的長(zhǎng)勢(shì)最差，幾乎不出草。

227株蛹蟲草菌株子實(shí)體產(chǎn)量比較分析

在相同培養(yǎng)條件下栽培得到7個(gè)蛹蟲草菌株子實(shí)體，針對(duì)菌株固體栽培生長(zhǎng)情況進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定。從表2可知，7株菌株的子實(shí)體產(chǎn)量存在極顯著差異，說明，菌株是影響子實(shí)體產(chǎn)量的最重要因素。其中菌株H05的子實(shí)體產(chǎn)量最高，為（204±032） g·瓶-1，其次為菌株H03。

237株蛹蟲草菌株活性成分含量比較分析

對(duì)相同培養(yǎng)條件下獲得的7株蛹蟲草菌株子實(shí)體中的腺苷、蟲草素、蟲草粗多糖、蟲草酸等活性成分進(jìn)行檢測(cè)分析。從表3可知，7株蛹蟲草菌株中的活性成分差別較大，各菌株間蟲草素、腺苷、蟲草酸、蟲草粗多糖的含量均達(dá)到極顯著差異（P<001），其中腺苷H05菌株的含量最高，H01菌株的含量最低;蟲草素H05菌株的含量最高，H06菌株的含量最低;蟲草粗多糖H06菌株含量最高，H02菌株的含量最低;蟲草酸H06菌株的含量最高，H02菌株的含量最少。

247株蛹蟲草菌株品質(zhì)評(píng)價(jià)結(jié)果分析

從表3可以看出，H05菌株的腺苷、蟲草素含量及子實(shí)體的產(chǎn)量最高，H06菌株的蟲草粗多糖、蟲草酸含量較高。對(duì)7株蛹蟲草菌株中的活性成分的含量及子實(shí)體的產(chǎn)量進(jìn)行歸一化算法后，得分情況見表4。雷達(dá)圖可以較為直觀地反映出菌株中各組分的分布情況。利用對(duì)不同菌株各組分進(jìn)行最大-最小歸一化算法得出的具體分值作圖3，從圖3可知，菌株H05的各組分分布較為均勻，說明其綜合品質(zhì)較高，且組分都處于較高水平。

3討論與結(jié)論

范志微＼[19＼]對(duì)14株野生蛹蟲草菌株進(jìn)行人工栽培子實(shí)體生長(zhǎng)狀況篩選試驗(yàn);吳憲等＼[20＼]對(duì)6株蛹蟲草菌株進(jìn)行子實(shí)體栽培及蟲草素和多糖含量進(jìn)行檢測(cè)，篩選獲得的優(yōu)質(zhì)菌株中，蟲草素的含量最高可達(dá)046%;于海洋等＼[21＼]對(duì)8株蛹蟲草菌株的菌絲生長(zhǎng)速度、菌落平均直徑、液體發(fā)酵菌絲體干重、培養(yǎng)周期以及子實(shí)體形態(tài)、重量、粗多糖含量的對(duì)比研究，篩選優(yōu)良蛹蟲草菌株;張俊等＼[22＼]用4個(gè)蓖麻蠶品種的5齡4 d幼蟲和4株蛹蟲草菌Cordyceps militaris菌株培育蠶蛹蟲草，以蓖麻蠶感染僵化率、出草率以及蠶蛹蟲草中腺苷、蟲草素、噴司他丁含量為指標(biāo)，篩選最佳配對(duì)蓖麻蠶品種及蛹蟲草菌株，其蟲草素含量為148～194 mg·g-1、腺苷含量為069～082 mg·g-1;朱麗娜等＼[24＼]對(duì)市售的16株蛹蟲草子實(shí)體樣本中的活性成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)市售樣品中，各活性組分含量具有極大差異，蟲草素含量平均值為032%，最高為037%，多糖含量平均為304%，最高為48%，腺苷含量平均為0153%，最高為019%。先前的關(guān)于蛹蟲草菌株選育的研究大多數(shù)集中于對(duì)菌株的菌絲、子實(shí)體生長(zhǎng)方面，對(duì)活性成分的研究相對(duì)較少，且大多數(shù)研究結(jié)果活性成分的含量低于本次篩選得到的菌株。

本研究通過對(duì)閩臺(tái)兩岸7株不同來源的蛹蟲草菌株中蟲草素、蟲草粗多糖、腺苷、蟲草酸的含量進(jìn)行檢測(cè)，綜合菌株人工栽培情況，篩選出H05菌株為較為優(yōu)質(zhì)的菌株，其子實(shí)體中腺苷量可達(dá)0556%，蟲草素含量可達(dá)0523%，蟲草粗多糖含量可達(dá)989%，蟲草酸含量可達(dá)497%，平均子實(shí)體產(chǎn)量可達(dá)204 g·瓶-1。

但本研究?jī)H對(duì)蛹蟲草菌株進(jìn)行了簡(jiǎn)單的篩選，采用的是常規(guī)的培養(yǎng)方法，并未對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，也未對(duì)菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性的研究，不能保證菌株的優(yōu)良特性能得以延續(xù)。因此如果想要獲得更高的活性成分含量，還需進(jìn)一步的研究，優(yōu)化培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基配方，并對(duì)菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究，獲得穩(wěn)定高產(chǎn)的菌株。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊益廣，黃作喜蛹蟲草人工培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2019，25（14）：21-24

[2]CHINGPENGCHIUA，TSONGLONGHWANG，et al.Research and development of Cordyceps in Taiwan[J].Food Science and Human Wellness，2016（5）：177-185

[3]文庭池，查嶺生，康冀川，等蛹蟲草研究和開發(fā)過程中的一些問題和展望[J]菌物學(xué)報(bào)，2017，36（1）：14-27

[4]涂俊銘，王碧，夏險(xiǎn)蛹蟲草生物活性成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]食用菌，2020，42（6）：4-7

[5]樊慧婷，林洪生蛹蟲草化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]中國中藥雜志，2013，38（15）：2549-2552

[6]盧麗麗蛹蟲草活性組分的提取及其抗腫瘤效果的研究[D]杭州：浙江理工大學(xué)，2012

[7]周蘇冬蟲夏草及蟲草制品中活性成分檢測(cè)方法的建立及含量測(cè)定[D]上海：上海海洋大學(xué)，2013

[8]艾中，錢正明，李文佳，等冬蟲夏草核苷類成分分析研究進(jìn)展[J]菌物學(xué)報(bào)，2016，35（4）：388-403

[9]周蘇冬蟲夏草及蟲草制品中活性成分檢測(cè)方法的建立及含量測(cè)定[D]上海：上海海洋大學(xué)，2013

[10]鐘石，李有貴，陳詩，等人工培養(yǎng)蛹蟲草與冬蟲夏草的主要活性成分比較[J]蠶業(yè)科學(xué)，2009，35（4）：831-836

[11]張瑞華蛹蟲草在保健食品中的應(yīng)用[J]齊魯工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，34（3）：17-20

[12]張?chǎng)螁矗旆叫?，柳葉飛，等不同來源多種蟲草核苷類物質(zhì)檢測(cè)分析比較[J]生物化工，2019，5（1）：98-102

[13]唐賢華，張崇軍，隋明，等 高產(chǎn)蟲草酸蛹蟲草菌株的分離鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]中國釀造，2019，38（11）：134-139

[14]曹莉蛹蟲草菌種分離及保藏方法對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)發(fā)育及生物活性成分積累的影響[D] 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020

[15]柴林山，馮敏，徐沖，等野生蛹蟲草菌株培養(yǎng)特性及子實(shí)體多糖含量比較分析[J]微生物學(xué)雜志，2020，40（4）：78-83

[16]王惠高產(chǎn)子實(shí)體蛹蟲草菌株的選育[D]長(zhǎng)沙：中南林業(yè)科技大學(xué)，2015

[17]曹照平高產(chǎn)蛹蟲草菌株的誘變選育及其積累蟲草素的研究[D]大連：大連工業(yè)大學(xué)，2014

[18]王蕾，羅巍，胡瑕，等蟲草素高產(chǎn)菌株的篩選及不同添加物對(duì)蟲草素產(chǎn)量的影響研究[J]菌物學(xué)報(bào)，2012，31（3）：382-388

[19]范志微蛹蟲草優(yōu)良菌株的篩選及其營(yíng)養(yǎng)特性的分析[D]哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2013

[20]吳憲，張國財(cái)，張杰，等蛹蟲草菌株的栽培與篩選[J]中國林副特產(chǎn)，2013（3）：6-8

[21]于海洋，王延鋒，史磊，等蛹蟲草優(yōu)良菌株的篩選[J]中國食用菌，2017，36（5）：17-20

[22]張俊，張曉，顏新培，等適合培育蠶蛹蟲草的蓖麻蠶品種和蛹蟲草菌株篩選試驗(yàn)[J]蠶業(yè)科學(xué)，2019，45（6）：862-869

[23]張麗艷，張春梅，張鳳梅，等蟲草素水提取工藝的研究[J]安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)（上半月刊），2010，16（7）：31-33

[24]朱麗娜，劉艷芳，張紅霞，等不同來源的蛹蟲草子實(shí)體活性成分的比較[J]菌物學(xué)報(bào)，2018，37（12）：1695-1706

（責(zé)任編輯：柯文輝）

柯軼，王娜，魏瑜，等高產(chǎn)活性成分蛹蟲草菌株的篩選＼[J＼]福建農(nóng)業(yè)科技，2021，51（2）：14-18.

收稿日期：2021-01-12

作者簡(jiǎn)介：柯軼，女，1986年生，講師，主要從事食用菌栽培、食品微生物學(xué)應(yīng)用方向研究。

基金項(xiàng)目：福州市農(nóng)業(yè)科技星火項(xiàng)目（2019-N-18）;福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目（JAT171014）。