膽南星中豬、牛、羊源性成分實時熒光PCR 檢測＊

田妮娜，朱仁愿，劉 荔，邵長春，王月玲，宋玉霞

（1.蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730050；2.河西學院，甘肅 張掖 734000）

膽南星是一種常用的中藥材，為天南星與牛、羊或豬膽汁經(jīng)加工或發(fā)酵而成[1]；有息風定驚、清熱化痰之功效，臨床上多用于小兒百日咳、癲癇病、中風等疾病的治療；現(xiàn)行版藥典中對膽南星的檢測項目包括性狀鑒別、顯微特征鑒別和理化反應鑒別三項。近年來，關于膽南星的研究頗多，主要是以膽汁中的膽汁酸類成分為指標性成分，采用薄層色譜法、高效液相色譜法等技術研究炮制方法、藥效學、質(zhì)量標準等方面的內(nèi)容。但是，膽南星中牛羊豬源性成分的檢測未見報道。為明確膽南星中膽汁的來源，對膽南星的動物源性進行鑒別。這是因為不同動物、不同組織來源的膽南星，其藥效可能存在一定差異。例如，陳江寧等研究發(fā)現(xiàn)不同膽汁制備的膽南星膽酸類成分及其解熱作用存在差別[2]。同時明確膽南星的種屬來源對防止瘋牛病、羊瘙癢病等疾病的傳播有重要作用。因此，建立鑒別膽南星動物源性的方法對控制膽南星的質(zhì)量具有重要意義。

此外，關于膽南星偽品多有報道，廣州市白云區(qū)藥檢所何倩京發(fā)現(xiàn)一種膽南星偽品，采用薄層鑒別方法未檢出膽酸、豬去氧膽酸及去氧膽酸[3]；浙江省長興縣中醫(yī)院沈忠明發(fā)現(xiàn)一種深灰的泥土經(jīng)壓制加工而成的膽南星偽品[4]；江蘇省泰州市藥品檢驗所仇雅靜發(fā)現(xiàn)人工偽造的假膽南星，其顯微鏡下檢出大量泥砂及葉、果實組織；由上述可見膽南星偽品較多，市場情況比較混亂[5]。因此，為了能準確的鑒別膽南星的來源與混偽品，建立鑒別膽南星動物源性的方法同樣意義重大。

以DNA 為基礎的檢測方法是目前動物源性檢測領域的常用方法。膽南星由牛、羊或豬膽汁制成，故本文擬采用TaqMan 探針法，參照牛羊豬源性成分實時PCR 檢測方法[6]，選用實時熒光定量PCR 法對膽南星中牛羊豬源性成分進行鑒定并進行討論。采用雙標記熒光PCR 技術，根據(jù)動物種間多態(tài)性的差異，對線粒體DNA 基因及內(nèi)參照同時進行擴增，通過兩種不同熒光物質(zhì)（FAM、VIC）的特異性探針進行鑒定。

1 儀器與材料

艾本德5810R 高速臺式離心機，艾本德Biospectrometer Basic 紫外分光光度計，賽默飛世爾科技QuantStudio 7 Flex 實時熒光PCR 擴增儀，牛、羊、豬實時熒光PCR 試劑盒選用takara Real Time PCR Porcine/Ovine/Bovine DNA Detection Kit；提取試劑盒選用TIANGEN 血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒。膽南星，參考《中國藥典》的方法，選用天南星加牛、羊、豬膽汁發(fā)酵制成。商品膽南星(四川百勝藥業(yè)有限公司和四川千方中藥有限公司)，經(jīng)蘭州市食品藥品檢驗所中藥室鑒定為正品。實驗中以天南星加雞膽汁發(fā)酵制成的樣品作為DNA 提取、擴增陰性對照。

2 方法與結(jié)果

2.1 DNA 的提取

將樣品打碎后，用試劑盒或核酸提取儀提取DNA，方法如下：取預先處理好的樣品約20mg，置于1.5mL 離心管中，加300μl 緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。加入30μl 蛋白酶K 溶液，混勻。置56℃金屬浴中過夜至完全裂解，離心，然后用試劑盒或核酸提取儀提取DNA。

2.2 DNA 濃度和純度的測定

利用紫外分光光度計測量所提DNA 濃度及A260nm/A280nm，經(jīng)測定，A260nm/A280nm 的值均＞1.7，表明可用于PCR 實驗等后續(xù)的操作。同時將濃度稀釋至2～10ng/μl，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 引物和探針

采用Premier5.0 引物設計軟件，經(jīng)比對后選取豬、牛、羊的特異性引物和探針，內(nèi)參基因引物探針序列選用真核生物18SrRNA 基因，均由大連寶生物有限公司合成。

2.3.1 豬朊蛋白基因檢測用引物探針序列

5’端引物：5’-TTTGTGCATGCTGCGTCAAC-3’

3’端引物：5’-CTTGGTGGTCGTGGTCACTGT-3’

探針：5’ -FAM -CACCGTCAAGCAGC -(NFQ)(MGB)-3’

2.3.2 羊線粒體細胞色素b 基因檢測用引物探針序列

5’端引物：5’-ACACAACTTCTACCACAACCE-3’

3’端引物：5’-AAACAATGAGGGTAACGAGGG-3’

探針：5’-FAM-ACACCGAAACAAAATACTCC TTGAGAAACA-(TAMRA)-3’

2.3.3 牛生長激素基因檢測用引物探針序列

5’端引物：5’-CCGATGGATGTTCAGAGCT-3’

3’端引物：5’-GCCAAATGTCTGGGTGTAGAT ACC-3’探針：5’-FAM-TGGGCTTTAGGGCTTCCG AATGAATGTGAA-(TAMRA)-3’

2.4 反應體系與反應條件

反應體系（總體系25μl)：2X Premix 12.5μl，引物、探針和模板DNA1μl。

反應條件：95℃預變性10s，1 個循環(huán)；95℃變性5s，60℃退火30s，40 個循環(huán)。

2.5 實時熒光PCR 結(jié)果判定

PCR 反應完成后以Ct 值判定結(jié)果。陽性對照FAM 和VIC 有熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型的擴增曲線且Ct 值應小于28.0；陰性對照有VIC 熒光信號檢出而無FAM 熒光信號檢出。若樣品Ct 值大于35.0 或無擴增曲線，表明不含所檢測的動物源性成分。若樣品Ct 值小于等于35.0 并出現(xiàn)典型的擴增曲線，表明含所檢測的動物源性成分[7]。

2.6 特異性試驗

分別取天南星加牛、羊、豬、雞發(fā)酵的樣品，共4份樣品，進行熒光定量PCR 特異性檢測試驗。根據(jù)典型擴增曲線和各反應體系循環(huán)閾（Ct）值的不同來驗證牛、羊、豬源性引物和探針對于不同動物的DNA 模板的特異性。結(jié)果如圖1 所示，試驗結(jié)果表明天南星加牛、羊、豬發(fā)酵樣品的DNA 提取液中分別僅檢出相應的動物源性成分，而未檢出其他三種動物源性成分。說明本研究建立的檢測方法對膽南星牛、羊、豬源性成分檢測具有特異性。

圖1 牛、羊、豬源性成分特異性試驗

2.7 檢出限試驗

將10ng/μl 的牛羊豬DNA 提取液加滅菌雙蒸水開始開始進行10 倍梯度稀釋，稀釋至最低濃度為0.0001ng/μl，以不同稀釋濃度的樣品DNA 為模板進行熒光定量PCR 擴增反應程序，進行檢出限檢測的檢測試驗。結(jié)果如圖2 所示，牛羊豬源性成分可檢測到的最低樣品濃度為0.1、0.001 和0.001ng/μl。

圖2 牛、羊、豬源性成分

2.8 動物源性成分檢測

分別用牛、羊、豬源檢測試劑盒進行實時熒光PCR 反應。結(jié)果顯示，四川百勝藥業(yè)有限公司和四川千方中藥有限公司各3 批膽南星樣品中均不含有牛、羊源性成分，但都含有豬源性成分，結(jié)果如圖3 所示。

3 討論

本研究采用的TaqMan 探針實時熒光PCR 方法能有效鑒別膽南星中的動物源性成分。且方法簡便，只需配好反應體系，設置好實時熒光PCR 儀的參數(shù)即可，免去了常規(guī)PCR 檢測電泳和DNA 測序等步驟，同時避免了PCR 產(chǎn)物的污染和溴化乙錠帶來的危害，反應只需1h[8]，適用于膽南星中的動物源性成分快速鑒別。

不同動物膽汁所含化學成分大體相同，理化鑒別方法很難對膽南星膽汁的來源做出準確判斷，而分子鑒別方法在物種鑒別方面優(yōu)勢明顯。本研究通過摸索膽南星藥材的DNA 提取方法、參照《SN/T 2051-2008 食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法實時PCR 法》的引物和探針，并對方法的特異性和檢出限進行檢測，高選擇性的擴增出膽南星中動物源性成分的DNA 片段，建立了膽南星動物源性成分檢測專屬性方法，對明確膽南星中膽汁的來源，膽南星的真?zhèn)舞b別，控制膽南星藥材質(zhì)量，促進與該品種相關的中藥市場的健康發(fā)展有重要意義。