南湖菱殼中五沒食子酰葡萄糖提取工藝及其抗腫瘤活性研究

張牧原 李軍 黃佳 吳霽蓂 蔣琦 高廣春

摘要：為明確菱殼中五沒食子酰葡萄糖的最佳提取工藝條件，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法，以提取率為評價指標(biāo)研究提取工藝，并采用CCK8法對最優(yōu)單因素和最佳提取工藝條件下的提取物進行了抗SK-BR-3腫瘤細(xì)胞增殖的研究。結(jié)果表明，影響提取率的因素依次為提取溫度>乙醇濃度>超聲時間，乙醇濃度和提取溫度的交互作用最強，對提取率的影響最為顯著;最佳的提取工藝為料液比1 g ∶20 mL，乙醇濃度67%，提取溫度80 ℃，超聲時間 10 min，預(yù)測提取率為0.674 2%，實際提取率為0.675 5%，結(jié)果相符。各部分提取物對SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，并且呈現(xiàn)一定的時間和濃度依賴性。在濃度為100 μg/mL時，各部分提取物對受試細(xì)胞具有極顯著的抑制增殖作用（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法;南湖菱殼;五沒食子酰葡萄糖;抗腫瘤活性

中圖分類號：TS201.1 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）05-0173-07

南湖菱（Trapa acornisNakano）為菱科一年生水生草本植物，又稱青菱、餛飩菱、元寶菱，主要生長在嘉興南湖水域，是嘉興的一種特色農(nóng)產(chǎn)品。菱殼是菱角的非食用部分，資料顯示南湖菱殼在民間食療偏方里可用于治療生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)腫瘤[1]，藥理研究表明菱殼提取物具有抗腫瘤、保肝護肝、抗氧化和降血糖的功效。本項目組在前期研究中對嘉興本地的菱殼化學(xué)成分進行了HPLC和UPLC-MS分析鑒定，發(fā)現(xiàn)其乙醇水提取物中含有沒食子酸、1，3，6-三沒食子酰葡萄糖、1，2，3，6-四沒食子酰葡萄糖、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖類化合物（pentagalloylglucose，PGG）。沒食子酸和沒食子酰葡萄糖類化學(xué)成分是一類重要的多酚類化合物，這類化合物有很強的生理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抑菌、抗過敏、降血糖等功能。由此推斷菱殼臨床療效的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)為沒食子酸及沒食子酰葡萄糖類多酚成分。隨著PGG豐富的藥理學(xué)活性被發(fā)現(xiàn)，其生物來源和制備方法的研究也越來越多，據(jù)報道其存在于多種植物的根、莖、葉、種子和果實等部位，但未見其在菱科植物中的報道。菱殼作為菱角果實的廢棄物，提取原料成本廉價，如果能利用其作為原料提取PGG，將大大提高菱角的經(jīng)濟價值，也有助于緩解中藥資源的短缺。本項目組一直以來從事菱殼多酚提取制備工藝和抗腫瘤活性的研究，在前期研究的基礎(chǔ)上本研究將采用超聲輔助提取南湖菱殼中的多酚類化學(xué)成分，以PGG的提取率作為評價指標(biāo)通過響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，并利用CCK8法測定提取物對HER2陽性乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3的細(xì)胞毒活性。本研究為南湖菱資源的綜合開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)，也為菱殼多酚藥用價值的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年10月于嘉興采收南湖菱，新鮮剝?nèi)×鈿ず笄逑锤蓛簦陉帥鎏幜栏珊蠓鬯檫^60目篩備用。1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖對照品（純度≥ 98%）購于上海雅吉生物科技有限公司。色譜甲醇、無水乙醇、乙酸、蒸餾水購于華東醫(yī)藥有限公司。SK-BR-3人乳腺癌細(xì)胞購于上海銳賽生物技術(shù)有限公司。DMEM培養(yǎng)基、CCK8檢測試劑盒（Dojindo，CK04）購于上海復(fù)申生物科技有限公司。試驗于2018年9月至2019年12月在嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心完成。

1.2 試驗儀器與設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技），Agilent1200高效液相色譜儀（杭州瑞析科技有限公司），色譜柱Eclipse XDB-C18（250 nm×4.6 mm，5 μm 上海楚定分析儀器有限公司），Thermo MuLTiSKAN MK3酶標(biāo)儀（上海智巖科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 南湖菱殼多酚的提取

1.3.1.1 供試樣品的制備 精確稱取0.5 g菱殼粉末，按單因素及響應(yīng)面設(shè)計的條件進行超聲提取。將提取液過濾后離心20 min，準(zhǔn)確移取上清液 1 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后得菱殼多酚提取液。

1.3.1.2 單因素試驗設(shè)計 精確稱取0.5 g樣品于具塞三角燒瓶中，選取不同的乙醇濃度（10%、30%、50%、70%、90%），不同的浸提溫度（40、50、60、70、80 ℃），不同的超聲時間（10、15、20、25、30 min），不同的料液比（1 g ∶10 mL、1 g ∶15 mL，1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL）等因素浸提菱殼中的多酚類物質(zhì)，分析不同的因素對提取菱殼多酚類成分的影響。每處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3.1.3 響應(yīng)面法優(yōu)化PGG提取工藝 依據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，確定PGG最佳提取工藝條件。

1.3.2 HPLC法測定PGG的提取率

1.3.2.1 高效液相色譜條件 檢測波長280 nm，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5 μL。流動相A為甲醇，流動相B為乙酸水溶液;梯度洗脫：0～5 min，12%～20% A;5～15 min，20% A;15～25 min，20%～70% A;25～30 min，70% A。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精確稱取PGG標(biāo)準(zhǔn)品 8 mg，置于25 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，振蕩搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。分別移取一定量的儲備液于另一10 mL容量瓶中，甲醇定容，振蕩搖勻后，得質(zhì)量濃度為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/mL 的五沒食子酰葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，過045 μm微孔濾膜除去雜質(zhì)微粒后注入1.5 mL進樣瓶中依次編號，在 280 nm 處測定吸收峰，平行測定3次。以峰面積為縱坐標(biāo)，進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=13.283x-122.6（r2=0.999 3），五沒食子酰葡萄糖（12.5～400.0 μg/mL）與峰面積的線性關(guān)系良好。

1.3.2.3 供試樣品PGG提取率的測定 將供試樣品按照色譜條件進行色譜分析，每樣品平行測定3次，記錄峰面積，用峰面積和線性回歸方程計算得PGG提取率。

y（五沒食子酰葡萄糖）=13.283x-122.6;

提取率（%）=C×V/w×106。

式中：y為峰面積，x、C為多酚含量（μg/mL），V為溶液體積（mL），w為南湖菱殼粉末的質(zhì)量（g）。

根據(jù)單因素試驗中PGG提取率確定響應(yīng)面法試驗適當(dāng)?shù)囊蛩睾退健?/p>

1.3.3 細(xì)胞毒活性測定 采用CCK-8法測定4個最優(yōu)單因素提取條件和最佳提取工藝條件下得到的提取物。對4個樣品進行編號：最優(yōu)乙醇濃度提取物（A），最優(yōu)超聲時間提取物（B），最優(yōu)提取溫度提取物（C），最優(yōu)料液比提取條件（D）和最佳提取工藝條件（E）。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔1.0×104個接種于96孔板內(nèi)，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞充分貼壁后，分別加入不同濃度的菱殼多酚（25、50、100、200、400、800 μg/mL）的提取物，陽性對照為順鉑，每組設(shè)3個平行空。藥物處理24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK8，混勻后培養(yǎng)箱中孵育1 h，測定450 nm處吸光度。細(xì)胞增殖抑制率=1-藥物組（D）/陰性對照組（D）×100%。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 采用DesignExpert 8.0.6軟件，利用響應(yīng)面設(shè)計分析方法進行線性回歸和二項擬合，確定最佳提取工藝條件。細(xì)胞毒活性測定試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 5.0進行統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對PGG提取率的影響 由圖1-A所示，菱殼中PGG提取率隨乙醇濃度的不斷增大呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢，在乙醇濃度達到70%時，PGG提取率達到峰值。原因可能為低濃度乙醇溶液對菱殼中的水溶性成分如糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)及苷類等物質(zhì)的提取效果更好。隨著乙醇溶液濃度的升高，其極性逐漸減弱，多酚類物質(zhì)的溶解度隨之升高;但濃度較大時，其對極性較低的化學(xué)成分的提取效果更優(yōu)，所得總提取物中多酚類物質(zhì)含量降低。因此，選擇50%、70%、90%等3個乙醇濃度進行響應(yīng)面法試驗。

2.1.2 超聲時間對PGG提取率的影響 由圖1-B可知，菱殼中PGG的提取率隨超聲時間的不斷延長呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢，在超聲時間達到 15 min 時，PGG的提取率達到峰值。超聲時間過長時，可能其他物質(zhì)的提取率增加使得總提取物中PGG含量下降，因此選擇10、15、20min等3個超聲時間進行響應(yīng)面法試驗。

2.1.3 提取溫度對PGG提取率的影響 由圖1-C可知，菱殼中PGG的提取率隨提取溫度的不斷升高而不斷升高，提取溫度達到70 ℃時達到峰值，隨著溫度繼續(xù)升高提取率趨于平緩，因此選擇60、70、80 ℃ 等3個溫度進行響應(yīng)面法試驗。

2.1.4 料液比對PGG提取率的影響 由圖1-D可知，菱殼中PGG的提取率隨料液比的不斷增大呈現(xiàn)出先快速升高然后減緩的趨勢。當(dāng)料液比為 1 g ∶20 mL 時，提取率較高，繼續(xù)增大料液比提取率上升不明顯，考慮到實際生產(chǎn)時料液比增大會導(dǎo)致后期濃縮耗能耗時從而降低效率，故選擇料液比1 g ∶20 mL作為響應(yīng)面法試驗的最佳工藝條件。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化菱殼中PGG的提取工藝

2.2.1 因素水平表 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取乙醇濃度（X1）、浸提溫度（X2）、超聲時間（X3）3個因素作為自變量，確定出響應(yīng)面試驗的3因素3水平條件（表1）。

2.2.2 響應(yīng)面實驗設(shè)計和結(jié)果 響應(yīng)面法試驗方案和結(jié)果見表2。試驗數(shù)據(jù)實際測得值與擬合方程預(yù)測數(shù)值大部分都很接近，個別有所差別，但差別不大，均在誤差范圍內(nèi)。

2.2.3 響應(yīng)面法的模型評價及分析 使用Design-Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多項式逐項回歸模擬，可得到數(shù)學(xué)模型Y=0.63-0.029A+0.038B+0003 1C+0.029AB+0.019AC-0.003 65BC-0063A2-0.003 713B2+0.009 863C2。式中：Y為PGG提取率，A為乙醇濃度，B為提取溫度，C為超聲時間，P=0.0001，失擬項為0.064，R2=0.973 6。數(shù)學(xué)模型的方差分析和各項式系數(shù)顯著性分析結(jié)果見表3。從表3可知，回歸方程方差分析多項式回歸方程中的P=0.000 1<0.05，回歸方程模型較為可靠;失擬項為0.064>0.05，失擬不顯著;方程的擬合相關(guān)系數(shù)R2=0.973 6>0.9，表示估計值和預(yù)測值之間的匹配度較高。在選取的因素水平范圍內(nèi)，比較各因素的F值，A=0.003，B<0.000 1，C=0.503 3，可知各因素對試驗結(jié)果的影響大小順序為B（提取溫度）>A（乙醇濃度）>C（超聲時間）。方差分析結(jié)果表明，方程的模型對PGG的提取率影響極顯著（P<0.01）。

圖2-A的響應(yīng)面曲線最為陡峭，反映出乙醇濃度和提取溫度的交互作用對PGG提取率的影響極為顯著，當(dāng)乙醇濃度和提取溫度適當(dāng)增加時，PGG的提取率增加且有穩(wěn)定的最大值，因此，適當(dāng)增加乙醇濃度和升高浸提溫度有助于提高PGG的提取率。圖2-C的響應(yīng)面曲線較為陡峭，乙醇濃度和超聲時間的交互作用對PGG提取率的影響顯著，當(dāng)超聲時間一定時，適當(dāng)增加乙醇濃度，PGG的提取率隨之升高，繼續(xù)增加乙醇濃度，其提取率增加趨勢逐漸變緩甚至略有下降。圖2-E的響應(yīng)面曲線平緩，表明提取溫度和超聲時間的交互作用對PGG提取率的影響不顯著。由圖2-B、圖2-D、圖2-F

可知，乙醇濃度和提取溫度的交互作用等高線為橢圓形，表明交互作用最強，對PGG的提取率影響極為顯著;乙醇濃度和超聲時間的交互作用等高線為橢圓形，表明交互作用較強，對PGG的提取率影響顯著;提取溫度與超聲時間的交互作用等高線沒有明顯的呈現(xiàn)橢圓形，更接近圓形，表明交互作用不強，對PGG的提取率影響不顯著。

通過最優(yōu)化分析得到最佳提取條件為提取溫度80 ℃，乙醇濃度67%，超聲時間10 min，預(yù)測PGG提取率為0.674 2%。為檢驗結(jié)果的可靠性，本研究采用最佳提取工藝條件重復(fù)試驗3次，結(jié)果顯示PGG提取率0.681 2%、0.680 1%、0.665 4%，平均提取率為0.675 5%。綜上所述，實際試驗結(jié)果和回歸模型的預(yù)測值基本吻合，表明回歸模型能夠準(zhǔn)確的模擬和預(yù)測PGG提取率。

2.3 菱殼多酚對人源HER2腫瘤細(xì)胞株SK-BR-3 的細(xì)胞毒作用提取物A～E對人源HER2腫瘤細(xì)胞株SK-BR-3的抑制作用見圖3，結(jié)果顯示各提取物均能不同程度地抑制SK-BR-3腫瘤細(xì)胞株的增殖，抑制效果呈時間和濃度依賴性。與對照組相比，各提取物在25 μg/mL時抑制效果不明顯，50 μg/mL時提取物B、C、D表現(xiàn)顯著的抑制作用（P<0.05），隨著濃度的增加提取物A～E均表現(xiàn)出極顯著的抑制作用（P<0.01）。同時隨著處理時間的延長，各提取物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率提高（P<0.01）。因此菱殼多酚提取物對人源HER2腫瘤細(xì)胞SK-BR-3的增殖具有抑制作用。

3 結(jié)論與討論

響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件具有精密度高和效果預(yù)測準(zhǔn)確等優(yōu)點，是目前國內(nèi)外研究中常用的方法。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合HPLC和響應(yīng)面法確定了南湖菱殼中PGG的提取工藝，建立了相關(guān)性良好的擬合回歸方程。由方差分析可知模型的P=0.000 1<0.01，試驗所采用的二次模型顯著性較強，是有意義的模型。乙醇濃度、提取溫度的P值均小于0.05，對提取率的影響較為顯著，其中提取溫度對PGG的提取率影響最大，乙醇濃度次之，超聲時間有一定的影響。而交互項乙醇濃度和提取溫度（AB）對PGG提取率的影響達極顯著水平，乙醇濃度和超聲時間（AC）對PGG提取率的影響達顯著水平，提取溫度和超聲時間（BC）對PGG提取率的影響不顯著。最終確定最佳的提取工藝為料液比1 g ∶20 mL，乙醇濃度67%，提取溫度 80 ℃，超聲時間10 min，PGG提取率為 0.674 2%。菱殼提取物的細(xì)胞毒活性測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同條件下制備得到的提取物對人源HER2陽性乳腺癌細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，并且呈現(xiàn)一定的時間和濃度依賴性。在濃度為100 μg/mL時各部分提取物具有極顯著的抑制作用（P<0.01）。

植物多酚類成分對人類健康具有重要的意義，功能性食品和保健品越來越受到消費者的青睞，因此對功能性食品及其添加劑的研發(fā)也如火如荼。PGG是多酚類物質(zhì)中具有很好市場應(yīng)用前景的化合物[5]，其生物和化學(xué)合成、提取制備工藝、功能特性、穩(wěn)定性和毒性等一直是研究的熱點。菱殼是菱角的廢棄物，從中獲取植物多酚和PGG具有很好的經(jīng)濟效益和社會效益。HER2型乳腺癌在臨床上約占20%～30%，雖然比例不是最高，但由于HER2原癌基因的多拷貝的性質(zhì)使得該型腫瘤有生存率低、惡性程度高、病情發(fā)展迅速、易復(fù)發(fā)（15%～24%）和臨床預(yù)后較差的特點，因此被稱為“最危險的乳腺癌”[17]。現(xiàn)階段治療HER2陽性乳腺癌最有效的是使用單克隆抗體聯(lián)合放化療，但單克隆抗體價格較昂貴，在我國大部分地區(qū)很難常規(guī)治療，而且許多患者還會發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、不良反應(yīng)大、藥物耐藥性等諸多問題。植物提取物具有多靶點、整體性的作用特點，在腫瘤的預(yù)防和輔助治療方面也有較多的報道。因此研究開發(fā)菱殼多酚的提取制備工藝和抗腫瘤活性對于菱角資源的綜合開發(fā)利用具有重要的指導(dǎo)意義。

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