生物散斑激光技術(shù)及在生鮮農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)控制中的應(yīng)用

左映平 孫國勇

摘要：生物散斑激光技術(shù)與Fujii法、絕對(duì)值差法、慣性矩法、廣義差法等定性定量分析方法相結(jié)合，可用于判斷果蔬瘀傷、果蔬成熟過程生化變化、肉類品質(zhì)、種子活力和果蔬真菌菌落感染程度等，該方法快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，可以保證生鮮農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量和安全。對(duì)生物散斑激光技術(shù)的原理、計(jì)算方法、在生鮮農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)控制中的應(yīng)用及面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行綜述，以期為生物散斑激光技術(shù)在生鮮農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)控制中的應(yīng)用實(shí)踐提供參考。

關(guān)鍵詞：生物散斑激光技術(shù);果蔬保鮮;生鮮農(nóng)產(chǎn)品;品質(zhì)控制

中圖分類號(hào)： S123文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）05-0045-06

生鮮農(nóng)產(chǎn)品包括生鮮果蔬及生鮮肉類，由于受到機(jī)械傷、呼吸作用或微生物污染等影響，生鮮果蔬在采摘、運(yùn)輸和加工處理過程中非常容易變質(zhì)，從而喪失貨架期[1]。若貯藏方式或加工方式不當(dāng)，生鮮肉類的成熟反應(yīng)和微生物生長就會(huì)加速，因此，對(duì)生鮮農(nóng)產(chǎn)品從種植、養(yǎng)殖基地到餐桌期間的品質(zhì)保障至關(guān)重要[2]。依據(jù)光學(xué)、超聲、電學(xué)和聲學(xué)特性原理，用于生鮮農(nóng)產(chǎn)品無損檢測(cè)的光學(xué)檢測(cè)方法包括顯微鏡、激光散斑、功能化原子力顯微鏡、多普勒光譜、高光譜成像技術(shù)、振動(dòng)光譜技術(shù)、圖像分析等。這些方法可用于生鮮農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、內(nèi)部缺陷、口感、含糖量等的檢測(cè)[3]，幾種適用于生鮮農(nóng)產(chǎn)品的無損檢測(cè)方法見表1[4]。

生物散斑激光技術(shù)屬于光學(xué)檢測(cè)技術(shù)之一，近年來在生鮮農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)控制領(lǐng)域被廣泛研究，包括鑒定果蔬機(jī)械傷、成熟度和成熟變化、肉類成熟、種子活力、真菌菌落感染等，該技術(shù)也被用于評(píng)估黏彈性食品的光學(xué)和動(dòng)態(tài)性能[5]。

1 生物散斑激光技術(shù)原理

生物散斑激光技術(shù)原理見圖1[6]，其主要設(shè)備是激光器、電荷耦合器件（CCD）相機(jī)、計(jì)算機(jī)等。首先，激光器發(fā)射激光照射生鮮農(nóng)產(chǎn)品樣品的表面及內(nèi)部，產(chǎn)生相干激光，由于受到背向散射光的干擾，在觀測(cè)平面上產(chǎn)生散斑圖。通過光的反射、透射等方式， CCD相機(jī)獲取到生物散斑圖像后傳輸?shù)接?jì)算機(jī)中，經(jīng)計(jì)算機(jī)內(nèi)特定軟件進(jìn)行分析，獲取生鮮農(nóng)產(chǎn)品的生理生化信息。生鮮農(nóng)產(chǎn)品樣本的散斑圖像一般有靜態(tài)圖像和動(dòng)態(tài)圖像2種。靜態(tài)圖像是生物組織的固定粒子，動(dòng)態(tài)圖像來自生物組織的粒子運(yùn)動(dòng)。其中，動(dòng)態(tài)散斑圖案是生物材料的1個(gè)顯著特征，被稱為生物散斑，激光（波長在 600 nm 以上）可用于生物散斑儀的照明過程。

2 生物散斑圖像計(jì)算方法

利用Fujii法、加權(quán)廣義差（WGD）、廣義差（GD）法、慣性矩（IM）法和絕對(duì)值差（AVD）法可以建立激光輻照度與散斑活性的函數(shù)關(guān)系，對(duì)生物散斑活性進(jìn)行分析。其中，AVD法、互相關(guān)法和IM法主要應(yīng)用于定量分析，而Fujii法、時(shí)間差分法 （TD）、激光散斑時(shí)間對(duì)比分析（LASTCA）、激光散斑對(duì)比分析（LASCA）和廣義差法常被用于定性分析[6]。

2.1 Fujii方法

Fujii方法由Nohira、Yamamoto、Ikawa和Ohura于1987年提出，該方法最初用于測(cè)量血流量，目前被廣泛用于生物散斑分析。該方法基于計(jì)算連續(xù)圖像幀之間灰度絕對(duì)差的加權(quán)和，其中每個(gè)幀取加權(quán)平均值[7]。Fujii方法的計(jì)算公式如下：

F（x，y）=∑nK=1Ik（x，y）-Ik+1（x，y）Ik（x，x）+Ik+1（x，y）。（1）

式中：k是序列{1，…，N}的圖像索引;Ik是一個(gè)具有x、y坐標(biāo)的像素的強(qiáng)度。

然而，F(xiàn)ujii法有一定的局限性，在描繪圖像的生物散斑活動(dòng)的較暗區(qū)域時(shí)會(huì)產(chǎn)生假動(dòng)作，糾正方法是利用小波變換完成頻率分解。

2.2 廣義差分法（GD）

廣義差分法是對(duì)Fujii法的補(bǔ)充[8]。廣義差分法去掉了加權(quán)步驟，特征是所有圖像之間像素強(qiáng)度差異的絕對(duì)估計(jì)值的累積總和，GD法計(jì)算公式如下：

GD（x，y）=∑N-1k=1∑Nl=k+1|Ik（x，y）-I1（x，y）|。（2）

式中：l、k為幀的下標(biāo);Ik為坐標(biāo)（x，y）下像素的強(qiáng)度。

GD值是分組中每個(gè)像素強(qiáng)度的所有可能的生物散斑圖像集合之間對(duì)比度的總值，對(duì)排列中的第1個(gè)圖像輪廓和漸進(jìn)圖像輪廓之間的相關(guān)性進(jìn)行處理，并考慮中點(diǎn)。與Fujii法相比，活動(dòng)圖上分析材料的圖像不太明顯。此外，GD計(jì)算是一種比較耗時(shí)的計(jì)算方法，這項(xiàng)技術(shù)的另一種變體是用平方值代替絕對(duì)值，此測(cè)量值表示為GD*[9]，其計(jì)算公式如下：

GD*（x，y）=∑N-1k=1∑Nl=k+12。（3）

與GD相比，GD*的生物斑點(diǎn)圖像顯示出更高的對(duì)比度。

而在加權(quán)廣義差分法（WGD）的計(jì)算中引入了1個(gè)附加的權(quán)值，其值隨時(shí)間序列的每次求和而變化[8]，以避免丟失瞬時(shí)數(shù)據(jù)。WGD計(jì)算公式如下：

WGD（x，y）=∑N-1k=1∑Nl=k+1|Ik（x，y）-Il（x，y）|Wp。（4）

式中：p=l-k，表示參考幀k的時(shí)間距離。隨著時(shí)間距離p改變，權(quán)重也改變，可以用來指示散斑強(qiáng)度的變化速度。GD、Fujii法可以解釋分析過程中散斑圖的完整活動(dòng)，但未能描述活動(dòng)的演變[10]。

2.3 時(shí)間序列散斑圖（THSP）

基于二維圖像時(shí)間序列散斑圖是一個(gè)由動(dòng)態(tài)生物散斑的各種漸進(jìn)圖片組成的矩陣。其中，行表示空間剖面，列表示在時(shí)間序列上的生物散斑圖像。THSP是通過使用從每張圖片中刪除的相似片段并將其放在一起而生成的。段按順序依次排列，THSP的寬度等于使用的圖片數(shù)，表示生物散斑的時(shí)間尺度。THSP圖像利用共同事件矩陣IM將每個(gè)THSP像素的變化量與鄰近變化量聯(lián)系起來[11]。THSP的計(jì)算公式如下：

ξ=1N-1∑N-1t=1（μt，t+1-μt）2μt。（5）

2.4 絕對(duì)值差（AVD）

絕對(duì)值差是一階統(tǒng)計(jì)矩，可以代替慣性矩法[12]。在某些情況下，AVD法表現(xiàn)出更好的生物散斑活性分析，特別是當(dāng)THSP矩陣不包含高頻數(shù)據(jù)時(shí)。AVD的計(jì)算公式如下：

AVD=∑ij{COM×|i-j|}。（6）

2.5 激光散斑時(shí)間對(duì)比分析（LASTCA）

LASTCA技術(shù)依賴于空間或時(shí)間對(duì)比度的估計(jì)，確定時(shí)間序列中每個(gè)幀像素的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的比值。動(dòng)態(tài)散斑的序列特征可以用來揭示暗的次表層項(xiàng)[13]。LASTCA的計(jì)算公式如下：

Kt（x，y）=1N-1{∑Nn=12}Ixyt。（7）

2.6 激光散斑對(duì)比度分析（LASCA）

激光散斑對(duì)比度分析是一種在線處理技術(shù)，它通過檢測(cè)顆粒模糊程度，使用1幅圖像來分析樣品的活性，是一種快速、經(jīng)濟(jì)的在線檢測(cè)方法。LASCA的計(jì)算公式如下：

Kx=σxIx。（8）

2.7 運(yùn)動(dòng)歷史圖像（MHI）

運(yùn)動(dòng)歷史圖像法能夠及時(shí)識(shí)別1組運(yùn)動(dòng)中的圖像，可以作為一種可行的在線工具被用于動(dòng)態(tài)散斑分析中[14]。MHI通過給每個(gè)像素（x，y）分配1個(gè)時(shí)間標(biāo)記（ms、s、min、h）來形成最終圖像，如果在規(guī)定的時(shí)間段后保持靜止，則圖像將被移除。在MHI圖中，較高密度的點(diǎn)表示高活性區(qū)域，而較小密度的點(diǎn)表示低活性區(qū)域[15]。在檢查有機(jī)和無機(jī)樣品時(shí)，MHI與LASCA均有良好的結(jié)果。此外，MHI還提供與GD和Fujii類似的離線檢測(cè)數(shù)據(jù)輸出。MHI法的計(jì)算公式如下：

MHI（x，y）=∑nJ=1TjKj。（9）

2.8 慣性矩（IM）

慣性矩是一種常用的數(shù)值計(jì)算方法，基于THSP矩陣建立，是作為中間圖像的共現(xiàn)矩陣（COM）[16]，此二階矩稱為矩陣的慣性矩。該方法由Arizaga等通過模擬創(chuàng)建，得到97%～98%范圍內(nèi)的可靠結(jié)果[8]。IM法公式：

IM=∑ijMij（i-j）2。（10）

3 生物散斑激光技術(shù)在生鮮農(nóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用

3.1 檢測(cè)園藝產(chǎn)品的機(jī)械損傷

新鮮農(nóng)產(chǎn)品遭受機(jī)械損傷后，游離水被排出，酚類化合物氧化，導(dǎo)致受損組織褐變，最終導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降。果蔬組織受到損害后，生物活性也隨之改變，且生物活性的變化可以被繪制成圖[17]，應(yīng)用生物散斑法可以檢測(cè)出果蔬表面、內(nèi)部的損傷。

Passoni等將生物散斑激光技術(shù)與GD法、Fujii法和LASTCA法相結(jié)合，識(shí)別并分析蘋果的機(jī)械傷，發(fā)現(xiàn)慣性矩法在蘋果新鮮區(qū)和損傷區(qū)的生物散斑活性差異最大，而灰色共生矩陣（GLCM）、BA值2個(gè)參數(shù)更有利于區(qū)分蘋果的新鮮度和損傷;蘋果在受到撞擊后，受損區(qū)的生物散斑活性減弱，初步建立了圖像參數(shù)與蘋果內(nèi)部品質(zhì)指標(biāo)（硬度和可溶性固形物含量）的擬合模型（R2≥0.8）。Samuel等將動(dòng)態(tài)激光散斑成像系統(tǒng)與交叉處理法、時(shí)間序列散斑圖結(jié)合并用其評(píng)估橙子、芒果、蘋果、番石榴和黃瓜的性質(zhì)[24]。Retheesh等通過研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)歷史圖（MHI）作為一種有效的在線損傷檢測(cè)工具，可被用于分析綠橙果實(shí)疤痕[15]。劉家瑋等利用 He-Ne 激光照射無損棗和損傷棗表面發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏時(shí)間的變化，棗的生物散斑活性有較大變化，且無損棗與損傷棗的變化趨勢(shì)不同[25]。劉海彬等通過比較Fujii法和加權(quán)廣義差分法（WGD法）區(qū)分皇冠梨缺陷（腐爛）部位及完好部位（花萼/果梗，無缺陷部位）的效果，發(fā)現(xiàn)WGD法識(shí)別缺陷的效果好，建模和預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率均達(dá)到97.5%。

3.2 生鮮農(nóng)產(chǎn)品成熟度的檢測(cè)

3.2.1 肉類成熟的檢測(cè) 結(jié)合慣性矩和絕對(duì)差的生物散斑法是分析、量化肉成熟過程中生物活性變化的有效工具，尤其是在牛肉品質(zhì)的評(píng)價(jià)方面。利用激光生物散斑技術(shù)可以檢測(cè)牛肉成熟過程中的生物變化[28]，灰度模板匹配法、小波變換融合、對(duì)比度調(diào)制融合法可以對(duì)牛肉硬度及咀嚼性進(jìn)行預(yù)測(cè)，此外，生物散斑技術(shù)還可用于牛肉摻腐檢測(cè)[31]，也可用于豬肉、雞肉的品質(zhì)評(píng)價(jià)。

3.2.2 果蔬成熟度的檢測(cè) 將生物散斑激光技術(shù)與THSP圖像、慣性矩相結(jié)合，可用于獼猴桃、梨、蘋果、番茄、檸檬、甘蔗、芒果等果蔬的成熟度檢測(cè)。生物散斑活性分析結(jié)果表明，獼猴桃過熟果實(shí)和優(yōu)質(zhì)果實(shí)間存在顯著差異[34]，梨比蘋果、番茄具有更高的生物散斑活性，隨著農(nóng)產(chǎn)品成熟，生物散斑作用減弱[35]，檸檬的動(dòng)態(tài)散斑測(cè)量值隨著果實(shí)品質(zhì)的下降而變化[36]。此外，芒果、番茄、甘蔗的成熟度也被研究。

3.3 微生物污染檢測(cè)

生物散斑激光技術(shù)可以檢測(cè)微生物的生長進(jìn)程，是快速確定食品中病原體感染的有效方法，因此可用于污染檢測(cè)。目前，生物散斑激光技術(shù)已被用于分析銅綠假單胞菌[41]、大腸桿菌[42]、念珠菌病[43]、黃曲霉[44]、尖孢鐮刀菌[45]等真菌感染情況。

3.4 生化過程

生物散斑活性可以反映生鮮農(nóng)產(chǎn)品的生物活性。在果實(shí)成熟的過程中，細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)、細(xì)胞生長和分裂等過程以及細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的生化反應(yīng)是引起生物散斑活性變化的主要原因。生物散斑活性測(cè)定可作為確定水果組織細(xì)胞內(nèi)新陳代謝和生化變化的方法。生物散斑活性隨著溫度下降而降低的特征可用Q10系數(shù)來衡量[46]。在蘋果采前階段，生物散斑活性增強(qiáng)，可溶性固形物含量增加，有機(jī)酸、淀粉含量略有下降[47]，蘋果中葉綠素含量與生物散斑活性呈線性相關(guān)，葉綠素含量的增加會(huì)導(dǎo)致生物散斑活性呈線性下降。

將激光散斑對(duì)比分析法（LASCA）、廣義差分法（GD）、Fujii法、時(shí)間對(duì)比法（TC）、轉(zhuǎn)動(dòng)慣量法（IM）與生物散斑激光技術(shù)相結(jié)合，可用于檢測(cè)種子的活性、含水量等參量，是一種在農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域能發(fā)揮重要作用的新型檢測(cè)手段[48]。門森利用紅外熱成像技術(shù)和激光散斑技術(shù)，提出基于多參數(shù)信息融合的豌豆種子和栓皮櫟種子活力檢測(cè)方法，準(zhǔn)確率分別可達(dá)95.33%和94.67%[49]。Sutton等研究發(fā)現(xiàn)，利用生物散斑激光分析技術(shù)可以有效地識(shí)別發(fā)芽受損核，可用于控制小麥種子萌發(fā)和休眠過程[50]。此外，生物散斑激光技術(shù)也被應(yīng)用在馬鈴薯、玉米種子活力檢測(cè)中。

4 生物散斑激光技術(shù)的挑戰(zhàn)

目前，生物散斑激光技術(shù)的推廣應(yīng)用障礙主要包括2個(gè)方面：一是缺乏相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。用于生物散斑圖像分析的計(jì)算公式、方法較多，但相關(guān)方法的比較和優(yōu)劣性大多尚未被研究清楚，計(jì)算方法不同，輸出的圖形或數(shù)值也不同。為了收集和標(biāo)準(zhǔn)化這些方法，Braga開發(fā)了1個(gè)開放數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫可免費(fèi)訪問生物散斑激光技術(shù)的大量原始數(shù)據(jù)[56]，但標(biāo)準(zhǔn)方法的制訂仍然大大限制了生物激光散斑技術(shù)在生鮮農(nóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用。二是缺乏用于測(cè)量生鮮農(nóng)產(chǎn)品散斑活性的儀器設(shè)備。例如，氦氖激光最大的局限性在于難以從光學(xué)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移到其他地方。生物散斑激光設(shè)備只有克服機(jī)械噪聲和外部光源的干擾，才能夠在室外使用。生物脈沖激光（波長為632.8 nm）對(duì)生物樣品的穿透較淺也限制了其應(yīng)用。例如，蘋果皮穿透深度僅為2 mm左右，僅可從皮下組織獲得生物脈沖信息，很難獲得果實(shí)中心的生物脈沖活性[57]。

5 結(jié)論

生物散斑活性是基于生鮮農(nóng)產(chǎn)品內(nèi)部生物物質(zhì)及其細(xì)胞內(nèi)生化變化過程（如細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)、細(xì)胞生長和分裂）中生物散斑活性進(jìn)行分析的，獲得有意義的結(jié)果并對(duì)其進(jìn)行解釋。在定量分析中，常采用絕對(duì)值差（AVD）、互相關(guān)和慣性矩（IM）等方法。定性方法常采用Fujii法、時(shí)差法（TD）、激光散斑對(duì)比分析法（LASCA）、激光散斑時(shí)間對(duì)比分析法（LASTCA）和廣義差分法（GD），生物脈沖方法具有非破壞、簡(jiǎn)單、低成本等特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，包括監(jiān)測(cè)新鮮農(nóng)產(chǎn)品的成熟度和成熟過程及檢測(cè)病害和缺陷等。

目前，生物散斑激光技術(shù)因一些技術(shù)難題尚未完全解決而無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用，如噪聲干擾、制訂標(biāo)準(zhǔn)化程序等，這些都需要進(jìn)一步研究。另外，生物散斑激光技術(shù)在水果可食性涂膜厚度測(cè)量、農(nóng)產(chǎn)品表面微生物種群鑒定及水果褐變、果實(shí)成熟度和種子活力測(cè)定等方面的應(yīng)用仍有待進(jìn)一步研究。

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