CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在作物中的應(yīng)用

林萌萌 李春娟 閆彩霞 孫全喜 趙小波 王 娟 苑翠玲 單世華

(山東省花生研究所，山東 青島 266100)

隨著基因組測序技術(shù)的不斷發(fā)展，不同生物攜帶的遺傳信息已經(jīng)觸手可及，利用基因編輯技術(shù)，人類實(shí)現(xiàn)了對生物遺傳信息的定向操控?；蚓庉嫾夹g(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了漫長的過程，由最初的大范圍核酸酶、鋅指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription-like activator effector nucleases, TALENs)到CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9, Cas9)，基因編輯技術(shù)的編輯效率和操作性不斷提高，引起了科學(xué)界的關(guān)注[1]。與以往的技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)操作更簡單，應(yīng)用潛能巨大，被《科學(xué)》雜志評為2013年十大科學(xué)突破之一。目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)、人類疾病治療、作物基因功能及遺傳育種等領(lǐng)域的研究中。

基因編輯技術(shù)的本質(zhì)是在基因組特定部位造成DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks, DSBs)，斷裂的DNA在修復(fù)時(shí)容易產(chǎn)生錯(cuò)誤，造成堿基的插入或刪除，從而影響基因的功能。本文就CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的產(chǎn)生、發(fā)展和應(yīng)用情況進(jìn)行了系統(tǒng)闡述，旨在為利用該技術(shù)進(jìn)行農(nóng)作物種質(zhì)創(chuàng)新、基因挖掘和育種提供指導(dǎo)與幫助。

1 CRISPR/Cas9技術(shù)的產(chǎn)生

1.1 基因編輯技術(shù)的產(chǎn)生

真核生物的基因組中擁有數(shù)量龐大的遺傳信息，實(shí)現(xiàn)對基因序列的操控對于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究都具有十分重要的意義。20世紀(jì)70年代研究人員首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌利用限制性核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)抵御病毒，這給DNA重組技術(shù)提供了思路[2-4]，據(jù)此科學(xué)家實(shí)現(xiàn)了生物體外的DNA操控。1983年Rothstein[5]首先對酵母細(xì)胞特定基因進(jìn)行敲除，實(shí)現(xiàn)了真核生物活細(xì)胞的基因編輯。兩年后Capecchi[6]和Smithies等[7]在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中通過同源重組的方式實(shí)現(xiàn)了外源基因的定點(diǎn)插入。外源基因敲入是研究模式生物基因功能的有效方式，然而基因整合效率低[6]、特異性差[8]等問題影響了其應(yīng)用。

研究者發(fā)現(xiàn)通過在靶位點(diǎn)處引起DNA雙鏈斷裂可以大大增加基因整合的特異性[9]。在早期的研究中，研究者利用切割位點(diǎn)少的大范圍核酸酶，如識別序列為18 bp的核酸酶Ⅰ-SceⅠ，在老鼠的基因組內(nèi)引入DNA雙鏈斷裂[9]。盡管這種大范圍核酸酶增加了基因編輯的效率，但是其識別序列較長，靶向基因內(nèi)存在識別位點(diǎn)的概率極低。

1987年Klug等[10]發(fā)現(xiàn)了鋅指蛋白，這為基因靶向編輯開辟了新紀(jì)元。鋅指結(jié)構(gòu)是鋅離子控制的可自我折疊成“手指”形狀的多肽空間構(gòu)型，可以結(jié)合在DNA的特定位置，每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)可以識別3個(gè)堿基序列。因此，多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)可以裝配成復(fù)合體來實(shí)現(xiàn)DNA的特異結(jié)合。通過融合鋅指蛋白和FokⅠ的DNA切割結(jié)構(gòu)域，研究人員裝配出鋅指核酸酶[11]。實(shí)踐證明，鋅指核酸酶系統(tǒng)不僅可以在模式生物中大大提高同源重組效率，在人類細(xì)胞中也有同樣效果[12-13]。隨著基因編輯研究的逐漸深入，2009年Boch等[14]和Moscou等[15]發(fā)現(xiàn)了來自黃單胞菌屬(Xanthomonas)的一種類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(transcription activator-like effector, TALE)可以特異性地識別單個(gè)堿基。同鋅指核酸酶類似，研究人員將TALE模塊與FokⅠ的DNA切割結(jié)構(gòu)域融合，產(chǎn)生了類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶[16-18]。

1.2 CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)現(xiàn)

盡管大范圍核酸酶、鋅指核酸酶以及后來的類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶提高了基因編輯的效率，但是在應(yīng)用上仍存在困難。鋅指核酸酶和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶在靶向不同的位點(diǎn)時(shí)，需要重新設(shè)計(jì)一系列的蛋白來匹配不同的靶點(diǎn)序列，實(shí)際操作復(fù)雜繁瑣，應(yīng)用門檻較高。而CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)以簡便的操作和極高的效率在技術(shù)上實(shí)現(xiàn)了革新(圖1)。

注：大范圍核酸酶是經(jīng)過改造的限制酶，可以識別一段長DNA序列；每個(gè)鋅指核酸酶單元識別3個(gè)DNA堿基；每個(gè)TALE單元識別單個(gè)堿基；CRISPR根據(jù)sgRNA(small guide RNA)和PAM序列的位置決定靶點(diǎn)。這4種技術(shù)都可以引起DNA雙鏈斷裂，進(jìn)而引發(fā)不同的DNA修復(fù)方式。

CRISPR的全稱是成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列[20]，它是由小導(dǎo)向RNA(small guide, sgRNA)介導(dǎo)的基因組定向編輯技術(shù)。1987年，日本科學(xué)家首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了CRISPR序列[21]，其重復(fù)序列(repeats)被多個(gè)不同的間隔序列(spacers)隔開。計(jì)算機(jī)分析發(fā)現(xiàn)CRISPR序列存在于40%的細(xì)菌與90%的古生菌中[22]，這些序列臨近多個(gè)保守的CRISPR關(guān)聯(lián)蛋白(CRISPR-associated，Cas)基因[20]，而且間隔序列均來自于病毒或者外源質(zhì)粒[22-24]。研究者認(rèn)為該系統(tǒng)與細(xì)菌抵抗外來質(zhì)?；蛘呤删w有關(guān)[22-23,25]。2007年，Rodolphe等[26]首先通過試驗(yàn)證明了CRISPR系統(tǒng)的工作機(jī)制：經(jīng)過病毒侵染后，細(xì)菌的基因組內(nèi)整合了一段從病毒基因組中獲得的DNA間隔序列，且這段CRISPR位點(diǎn)內(nèi)的DNA間隔序列可以指引Cas酶抵抗這種病毒。一年后，Brouns等[27]揭示了由間隔序列轉(zhuǎn)錄出的crRNA(CRISPR RNAs)可以對Cas酶進(jìn)行操控。2008年，Deveau等[28]發(fā)現(xiàn)不同間隔序列的臨近序列非常相似，這段稱為PAM(protospacer adjacent motifs)的序列對CRISPR系統(tǒng)的工作非常重要。 Garneau等[29]發(fā)現(xiàn)在眾多Cas蛋白中，只有Cas9在嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)中有DNA催化活性。這些發(fā)現(xiàn)都為CRISPR系統(tǒng)成為一種生物技術(shù)工具奠定了基礎(chǔ)。2011年，Deltcheva等[30]揭示了Cas9酶的催化受兩條短的RNA控制。此后，CRISPR系統(tǒng)被證明可以作為基因編輯的工具靶向細(xì)菌中特定的DNA序列[31-32]。Jinek等[31]對CRISPR系統(tǒng)進(jìn)行了簡化，使用一條短的sgRNA來替代原來的crRNA和tracrRNA(trans-activation crRNA)。多項(xiàng)研究證明，CRISPR系統(tǒng)可以用于哺乳動(dòng)物活細(xì)胞的基因編輯，展開了基因編輯的新篇章[33-35]。此后，科學(xué)家可以通過設(shè)計(jì)sgRNA序列來特異靶向不同基因，CRISPR作為一項(xiàng)前所未有的基因編輯技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。本文統(tǒng)計(jì)了2005—2019年關(guān)于CRISPR的論文，發(fā)現(xiàn)相關(guān)CRISPR的研究論文數(shù)目逐年增加，合計(jì)超過15 700篇(圖2)。

在細(xì)菌和病毒數(shù)億年的斗爭中，細(xì)菌進(jìn)化出了多種CRISPR免疫響應(yīng)系統(tǒng)。不同CRISPR系統(tǒng)主要依據(jù)Cas基因的結(jié)構(gòu)來劃分[36-37]，目前CRISPR系統(tǒng)主要被分為兩大類，每一類又包括多種不同的CRISPR類型。第一類包括Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR系統(tǒng)，第二類包括Ⅱ型、Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅵ型CRISPR系統(tǒng)[38]。盡管CRISPR/Cas系統(tǒng)類型眾多，目前廣泛應(yīng)用類型是來自于釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)，該型系統(tǒng)的PAM序列為簡單的5′-NGG-3′，應(yīng)用較方便。

注：2005-2019年P(guān)ubMed數(shù)據(jù)庫收錄的標(biāo)題或摘要中含有“CRISPR”或“Cas9”的文獻(xiàn)數(shù)目。

2 CRISPR/Cas9技術(shù)基因編輯特點(diǎn)

2.1 DNA斷裂的修復(fù)方式

CRISPR/Cas9系統(tǒng)包含sgRNA和Cas9核酸酶兩部分：sgRNA 5’端1～20 bp的序列為靶點(diǎn)識別序列，通過互補(bǔ)配對決定DNA的切割位置，Cas9核酸酶切割DNA雙鏈[31]。該技術(shù)造成的DNA雙鏈斷裂(DSBs)主要通過非同源末端連接(nonhomologous end-joining, NHEJ)或同源重組(homology-directed repair, HDR)兩種方式進(jìn)行修復(fù)[39-40]。

NHEJ修復(fù)途徑不依賴DNA同源性，直接將斷裂的DNA連接，由此產(chǎn)生的DNA修復(fù)錯(cuò)誤可能導(dǎo)致基因功能喪失(圖3-a)。該修復(fù)途徑易在DNA斷裂處引入或丟失一個(gè)至多個(gè)堿基，造成基因突變[41]。在提供外源基因作為Donor的情況下，NHEJ修復(fù)途徑也可以實(shí)現(xiàn)基因插入(圖3-b)或基因替換(圖3-c)[42]。當(dāng)基因存在兩個(gè)靶點(diǎn)時(shí)，DNA的斷裂可能導(dǎo)致兩靶點(diǎn)間DNA大片段刪除(圖3-d)[42]。

HDR修復(fù)是以含有同源序列的DNA作為模板進(jìn)行的精確修復(fù)方式[43]。姐妹染色單體、同源染色體，或者經(jīng)過人工修改后具有同源序列的外源DNA都可以作為HDR修復(fù)的模板[43]。因此，研究人員可以通過提供含有同源序列的Donor實(shí)現(xiàn)基因替換或基因插入(圖3-e)[44]。

注：DNA斷裂雙鏈通過NHEJ和HDR兩種方式進(jìn)行修復(fù)。NHEJ修復(fù)方式可能會造成DNA斷裂處的堿基插入或缺失(紅色)，產(chǎn)生基因突變(a)，外源的DNA供體可能被錯(cuò)誤連入基因，造成基因插入(b)。兩個(gè)靶點(diǎn)造成的斷裂可能造成基因替換(c)或者大片段 丟失(d)[43]。以同源片段作為模板的HDR修復(fù)方式是精確的，可以通過提供Donor實(shí)現(xiàn)基因替換或基因插入(e)。

2.2 基因的編輯效率

研究表明，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻基因進(jìn)行編輯，不同靶點(diǎn)的編輯效率不同，編輯效率為21%～67%，其中53.9%的基因編輯類型為單堿基插入，插入的堿基絕大多數(shù)為A或T[45]。研究人員對水稻不同基因上的46個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行了編輯，克隆測序結(jié)果表明，328條測序結(jié)果中280條含有不同類型的突變，177條為雙等位基因突變，81條為純合突變，19條為雜合突變，主要的突變方式是A或T單堿基的插入(54.1%)，不同靶點(diǎn)的編輯效率與靶點(diǎn)的GC含量息息相關(guān)[46]。在Shan等[47]的研究中，轉(zhuǎn)基因水稻中的基因編輯效率為4.0%～9.4%。由此可見，不同靶點(diǎn)的基因編輯效率也是不同的，與靶點(diǎn)序列及其所處位置的染色質(zhì)狀態(tài)、靶點(diǎn)序列、外源載體在染色質(zhì)上的整合位置等有密切關(guān)系。

2.3 CRISPR/Cas9技術(shù)脫靶問題

在自然界中，細(xì)菌的CRISPR系統(tǒng)主要用于抵御病毒的侵染。由于病毒的變異速度較快，所以特異性較低的CRISPR系統(tǒng)可能對細(xì)菌更加有利。早期的一些研究證實(shí)了這種現(xiàn)象的存在，也說明CRISPR系統(tǒng)作為一種基因編輯工具存在著脫靶的風(fēng)險(xiǎn)[48-52]。 Kuscu等[53]和Wu等[54]通過染色質(zhì)免疫沉淀和高通量測序(chromatin immunoprecipitation and sequencing, ChIP-seq)的方法對脫靶現(xiàn)象進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，Cas9的結(jié)合位點(diǎn)主要位于染色體的開放區(qū)域，PAM序列遠(yuǎn)端的堿基容許一定程度的錯(cuò)配，但并不是所有的Cas9蛋白的結(jié)合位點(diǎn)都會進(jìn)行DNA切割，DNA切割對序列的特異性要求更加嚴(yán)格。靶位點(diǎn)序列的特異性決定了脫靶情況發(fā)生的可能性，靶點(diǎn)序列與其同源序列在PAM鄰近處有大于2 bp的差異，在整個(gè)靶序列中有5 bp的差異可有效避免脫靶問題[31, 50]。對于CRISPR/Cas系統(tǒng)來說，PAM序列對于靶位點(diǎn)的識別至關(guān)重要，SpCas9的變體SpCas9-NG可將5′-NGG-3′ PAM擴(kuò)展為5′-NG-3′PAM，有效緩解PAM序列的限制問題[55]。而近期的研究表明，SpCas9-NG可能導(dǎo)致自體靶向編輯，自編輯產(chǎn)生突變的sgRNA仍具有靶向能力，會導(dǎo)致意外的脫靶事件[56]。

基因轉(zhuǎn)化后的CRISPR/Cas9載體可能會整合到基因組中，使sgRNA和Cas9持續(xù)表達(dá)，增加了脫靶風(fēng)險(xiǎn)[43]。目前，可以通過轉(zhuǎn)化核糖核蛋白(ribonucleoproteins, RNPs)復(fù)合體的方法來避免這個(gè)問題，同時(shí)也避免了轉(zhuǎn)基因的問題[57-59]。通過全基因組測序的方法可以檢測脫靶的情況，Zhang等[45]對基因編輯的水稻進(jìn)行了全基因組測序以檢測脫靶問題，結(jié)果所有靶點(diǎn)均未出現(xiàn)嚴(yán)重的脫靶問題。除了基因組水平的深度測序，BLESS[60]、GUIDE-Seq[61]和Digenome-Seq[62]等多種測序方式也能有效地找到基因組突變位點(diǎn)，檢測基因編輯的情況和脫靶問題。

在植物的基因編輯中，通過設(shè)計(jì)特異性較高的靶位點(diǎn)可以降低或避免脫靶情況的發(fā)生[63]，也可以通過回交或雜交方式將非目標(biāo)突變分離出去。2020年，Manghwar等[64]對基因編輯脫靶現(xiàn)象的機(jī)理和存在的問題進(jìn)行了闡述，總結(jié)了脫靶效應(yīng)的評估方法等，為降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)提供了一定的指導(dǎo)。

3 CRISPR/Cas9技術(shù)在作物中的應(yīng)用

3.1 利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因突變

隨著CRISPR/Cas9技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因編輯的應(yīng)用，經(jīng)過改造的CRISPR/Cas9載體也很快用于擬南芥[65-67]、煙草[68-69]、水稻[70-72]、小麥[73]和玉米[74]等植物基因組的定向編輯研究。

Mao等[75]首先對CRISPR/Cas9表達(dá)盒進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建了可以在擬南芥和水稻中表達(dá)的植物適應(yīng)性表達(dá)盒，并成功對擬南芥和水稻中的基因進(jìn)行了編輯。2013年，F(xiàn)eng等[76]再次使用由CaMV 35S啟動(dòng)子引導(dǎo)的Cas9和AtU6-26啟動(dòng)子或OsU6-2啟動(dòng)子連接的sgRNA對擬南芥和水稻進(jìn)行基因編輯，產(chǎn)生了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因編輯植株，9個(gè)靶位點(diǎn)的基因編輯效率介于5%～84%之間。2014年，F(xiàn)eng等[77]對擬南芥的7個(gè)基因進(jìn)行編輯，并且對基因編輯植株的遺傳情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)T1、T2和T3植物攜帶突變的比例分別為71.2%、58.3%和79.4%，T1的突變雜合體在T2產(chǎn)生了22%的突變純合體，所有純合突變均能穩(wěn)定地傳遞至下一代。

CRISPR/Cas9載體和轉(zhuǎn)化方式的優(yōu)化也在逐步進(jìn)行。Miao等[71]對CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，基因的靶點(diǎn)序列首先被克隆到sgRNA的表達(dá)載體中，然后再克隆到含有Cas9基因的終載體中。研究人員對水稻葉綠素合成基因CAO1和分蘗夾角基因LAZY1進(jìn)行定點(diǎn)突變，基因編輯效率分別為83.3%和91.6%。2015年Ma等[46]對Cas9基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并采用Golden Gate Cloning方法構(gòu)建了適用于單子葉植物和雙子葉植物的高效CRISPR/Cas9載體，成功對水稻和擬南芥的基因進(jìn)行編輯，大多數(shù)突變?yōu)殡p等位基因突變和純合突變。Xie等[78]將tRNA和gRNA嵌合到一起，開發(fā)了從一個(gè)多順反子基因生產(chǎn)大量sgRNA的通用策略，成功實(shí)現(xiàn)同時(shí)對水稻基因組中多個(gè)位點(diǎn)的編輯。Gil-Humanes等[79]使用小麥矮病毒復(fù)制子作為CRISPR轉(zhuǎn)化工具，使小麥基因靶向效率提高了10倍以上。

CRISPR/Cas9技術(shù)的轉(zhuǎn)基因安全問題和脫靶問題一直是人們關(guān)注重點(diǎn)。2016年，Zhang等[80]通過小麥中瞬時(shí)表達(dá)CRISPR/Cas9的DNA或RNA，有效地減少了外源基因的整合。2017年，Liang等[57]另辟蹊徑，通過直接向小麥幼胚轟擊CRISPR/Cas9的核糖核蛋白(RNPs)復(fù)合體的方法來避免轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方式可以對靶基因進(jìn)行編輯并且有效減少了脫靶效應(yīng)。

在花生突變體研究中，通常使用化學(xué)誘變的方式誘導(dǎo)產(chǎn)生突變體[81]。2019年，Yuan等[82]率先通過CRISPR/Cas9技術(shù)對花生的脂肪酸去飽和酶ahFAD2基因進(jìn)行了突變，該研究利用花生的原生質(zhì)體和發(fā)根作為轉(zhuǎn)化材料，實(shí)現(xiàn)了對花生的基因編輯。

3.2 利用CRISPR/Cas9進(jìn)行精確基因編輯

利用CRISPR/Cas9技術(shù)對基因進(jìn)行突變操作簡便，然而實(shí)現(xiàn)精確的單堿基編輯、基因替換或者基因插入則相對復(fù)雜。為此，科學(xué)家嘗試了不同的策略，早期主要通過提供外源的DNA作為修復(fù)模板或者基因替換的模板進(jìn)行精確編輯，后期逐漸形成的第二代CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)更容易實(shí)現(xiàn)單堿基編輯。2013年，Li等[44]將煙草NbPDS基因編輯載體和雙鏈DNA Donor共轉(zhuǎn)化，利用Donor作為修復(fù)模板，通過同源重組途徑實(shí)現(xiàn)基因替換。為了防止DNA斷裂處的修復(fù)錯(cuò)誤，2016年，Li等[42]在內(nèi)含子區(qū)域選擇靶位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化的同時(shí)提供基因編輯載體和外源DNA Donor，通過非同源末端連接途徑實(shí)現(xiàn)了水稻OsEPSPS基因的替換，獲得了抗除草劑的植株；另一方面，也通過提供Donor實(shí)現(xiàn)了1.6 kb的基因插入。2020年，Dong等[83]通過CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在水稻基因組中的安全位置插入5.2 kb類胡蘿卜素生物合成元件。研究表明，該水稻種子中的類胡蘿卜素含量高，并且形態(tài)及產(chǎn)量特性與野生型相似，為作物精確的基因敲入提供了思路[83]。除了DNA雙鏈或者環(huán)形質(zhì)粒可以作為Donor以外，單鏈DNA片段也可以作為DNA修復(fù)模板[47]。

野生型的Cas9酶可以造成DNA雙鏈斷裂，而第二代基因編輯工具以Cas9切口酶為基礎(chǔ)，可以在不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的情況下實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)的堿基替換，使單堿基編輯更易實(shí)現(xiàn)。這種單堿基編輯工具可以實(shí)現(xiàn)胞嘧啶(cytosine, C)到胸腺嘧啶(thymine, T)和腺嘌呤(adenine， A)到鳥嘌呤(guanine, G)的堿基替換[84-86]。2016年，Komor等[86]發(fā)現(xiàn)將Cas9切口酶與APOBEC1脫氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制劑(uricall glycosylase inhibitor, UGI)蛋白融合，可以有效地在靶位點(diǎn)處將C轉(zhuǎn)化為T。2018年，Gaudelli等[84]將RNA腺苷酸脫氨酶融合Cas9切口酶，可以實(shí)現(xiàn)靶點(diǎn)堿基A到G的轉(zhuǎn)換。這些新型的單堿基編輯策略極大地?cái)U(kuò)展了基因編輯技術(shù)的應(yīng)用范圍。Kuscu等[87]和Billon等[88]實(shí)現(xiàn)了將氨基酸編碼的密碼子轉(zhuǎn)換為終止密碼子，可以提前終止基因的翻譯。此外，將活性誘導(dǎo)的腺嘌呤脫氨酶與dCas9(dead Cas9)融合成dCas9-AID復(fù)合體，由其引發(fā)的基因突變可以作為基因功能篩選的重要手段[89-91]。

3.3 基因突變的檢測方式

CRISPR/Cas9基因編輯植株的鑒定是基因編輯過程的重要步驟[43]。目前，基于PCR和酶切的檢測方法主要有兩種。第一種方式是基于PCR擴(kuò)增及限制性酶切的PCR/RE(restriction enzyme)，Cas9酶切位點(diǎn)(5′-NGG-3′上游3 bp)含限制性酶識別序列時(shí)可以使用該方法。完成基因編輯后，通過PCR擴(kuò)增和限制性酶切反應(yīng)可以檢測靶點(diǎn)處是否發(fā)生突變[42-43,92-93]。第二種方式是T7EI(T7 endonuclease Ⅰ)酶切檢測，此方法不需要考慮靶位點(diǎn)是否含有限制性酶識別序列[92,94]。以上兩種方法雖能檢測出突變植株，但是要了解基因編輯情況還需通過測序。利用疊峰分析軟件，可以分析突變植株的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果[95]。

通過PCR和酶切方式檢測突變體相對耗時(shí)耗力，Peng等[96]開發(fā)了基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)的檢測方式，無需酶切就能從樣品中找出突變體。利用該方法，研究人員成功將水稻、擬南芥、高粱和玉米的突變體從野生型中分離出來。隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，高通量測序的費(fèi)用已經(jīng)大幅度降低，準(zhǔn)確性提高[43]。通過第二代測序的方法可以大批量檢測CRISPR/Cas9引起的突變，是一個(gè)簡便、高效的選擇[97-98]。

4 CRISPR技術(shù)的其他應(yīng)用

4.1 基因表達(dá)調(diào)控

研究發(fā)現(xiàn)，沒有切割活性的dCas9仍可以緊密結(jié)合DNA，這種緊密的結(jié)合可干擾轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶Ⅱ與DNA結(jié)合[99]，由此開發(fā)的CRISPR干擾技術(shù)可以干擾轉(zhuǎn)錄過程，從而抑制基因表達(dá)[99]。在此基礎(chǔ)上，將dCas9與有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的轉(zhuǎn)錄激活因子或轉(zhuǎn)錄抑制因子融合，可以有效激活或抑制基因表達(dá)[100-101]。

4.2 表觀遺傳學(xué)、基因座定位、染色體結(jié)構(gòu)研究

在表觀基因組學(xué)研究中，將dCas9與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶融合可以調(diào)控特定基因區(qū)域的甲基化情況，進(jìn)行表觀遺傳學(xué)研究[102-105]。

熒光雜交技術(shù)(fluorescent in-situ hybridization, FISH)是常用的基因座定位方式[106-107]，但由于該技術(shù)需要對細(xì)胞固定加熱，所以很難在活細(xì)胞中應(yīng)用。通過將dCas9連接熒光標(biāo)簽，可以在活細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)特定基因座的定位[108]。

在染色質(zhì)拓樸結(jié)構(gòu)的研究中，CRISPR用于指引染色質(zhì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，為探索染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對基因表達(dá)調(diào)控的影響提供思路[109]。

4.3 基因功能篩選

除了上述應(yīng)用之外，CRISPR技術(shù)還應(yīng)用于大規(guī)?；蚬δ芎Y選。該策略需建立包含數(shù)千種sgRNA的Cas9/sgRNA池，不同sgRNA靶向基因組的不同位點(diǎn)。通過降低豐度使每個(gè)細(xì)胞只接收到一種sgRNA。高通量測序可以篩選出突變基因，將突變的基因與表型關(guān)聯(lián)，獲得基因功能的信息[110]。

5 結(jié)論與展望

隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展，其應(yīng)用層面也越來越廣泛，在作物遺傳育種的研究中有廣闊的應(yīng)用前景。該技術(shù)操作簡便，效率較高，為作物種質(zhì)創(chuàng)新、基因功能研究提供了有效工具。在多倍體作物的基因編輯中，CRISPR/Cas9技術(shù)可以同時(shí)敲除多個(gè)同源基因，極大地提高了基因突變的特異性和有效性[93]，為多倍體作物基因編輯提供了技術(shù)手段。在作物種質(zhì)創(chuàng)新上，目前通過精確的基因編輯已經(jīng)創(chuàng)造出了抗除草劑水稻[111]和高類胡蘿卜素含量的水稻[83]。在未來的研究中，利用CRISPR技術(shù)進(jìn)行精確編輯，研究有價(jià)值的生物性狀，提高作物中功能成分含量將是一個(gè)新的研究方向。

目前，人們對CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的原理、操作過程和基因編輯特點(diǎn)都有了基本的了解，但是對于基因編輯過程中的編輯效率、脫靶現(xiàn)象和遺傳性問題仍需要更加深地的研究。此外，雖然CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用廣泛，但是該技術(shù)的轉(zhuǎn)基因安全性問題和脫靶問題仍存在爭議。該技術(shù)目前已實(shí)現(xiàn)在不引入外源基因的情況下進(jìn)行基因編輯[57]，檢測不到轉(zhuǎn)基因痕跡，但是如何進(jìn)行監(jiān)管仍是政府需要面對的一個(gè)問題。將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于臨床治療不僅存在安全隱患[112]，還存在著一系列的倫理爭議，這是我們在發(fā)展技術(shù)的同時(shí)需要深思的問題。