外源24-表油菜素內(nèi)酯對NaCl脅迫下桑樹幼苗的緩解效應(yīng)

董亞茹 張艷波 趙東曉 耿 兵 婁齊年 李云芝 王照紅 郭 光

(山東省蠶業(yè)研究所，山東 煙臺 264002)

土壤鹽漬化是自然界中主要的非生物脅迫之一，不僅制約植物的生長發(fā)育，還嚴(yán)重影響土地利用率。一方面可以通過改良鹽漬土壤以減少鹽堿地面積，但該項(xiàng)任務(wù)實(shí)施過程中困難重重；另一方面則可以通過提高植物耐鹽性來應(yīng)對鹽漬脅迫，如抗鹽鍛煉、培育耐鹽品種、加入生長調(diào)節(jié)劑等[1-2]。因此，關(guān)于植物對鹽脅迫適應(yīng)能力的研究也已成為時(shí)下熱點(diǎn)。桑樹(MorusL.)是一種寶貴的植物資源，不僅能為養(yǎng)蠶業(yè)提供原料，也可廣泛用于防風(fēng)固沙，園林綠化，同時(shí)還是重要的食、藥用資源。此外，桑樹耐干旱瘠薄、適應(yīng)性強(qiáng)并具有一定的耐鹽能力，在改善和利用鹽堿地方向也具有廣闊的應(yīng)用前景。

油菜素內(nèi)酯(brassinolide，BR)是甾醇類植物激素，廣泛存在于植物的花粉、種子、莖、葉、果實(shí)等植物器官中，并參與植物細(xì)胞分裂和伸長、光形態(tài)建成、開花及產(chǎn)量和品質(zhì)的形成等生長發(fā)育過程[3-5]。近年來，人們對BR做了大量的研究，發(fā)現(xiàn)24-表油菜素內(nèi)酯(24-epibrassinolide，EBR)和28-高油菜素的活性最強(qiáng)[6]。眾多研究結(jié)果表明，外施一定濃度的油菜素內(nèi)酯能有效提高植物對多種非生物脅迫的抗性，緩解溫度脅迫[7-8]、鹽脅迫[9]、干旱脅迫[10]及重金屬(銅[3]、鎘[11]、砷[12]、汞[13]等)脅迫對植株造成的傷害。目前有關(guān)BR抗逆性研究大部分基于農(nóng)作物、草本植物，而對木本植物的研究相對較少，劉良松等[14]研究表明，低溫脅迫下噴施外源EBR能減輕低溫引起的氧化損傷，從而增加華山松的抗寒能力。Yue等[15]研究表明，外源EBR能夠明顯緩解鹽脅迫對刺槐幼苗生長的抑制作用，其中蘸根處理效果最佳。樊玉花[16]研究結(jié)果表明，施加外源BR能夠提高杜鵑的光合能力，降低活性氧積累和膜質(zhì)過氧化水平，增強(qiáng)其抗旱能力。Zhou等[17]研究表明，外源BR可降低葡萄扦插的氧化損傷，提高其對銅脅迫的耐受性。但有關(guān)外源EBR對提高桑樹耐鹽性影響的研究尚鮮見。

因此，本研究通過分析外施EBR后鹽脅迫下桑樹幼苗的生長、根系形態(tài)、光合色素含量、活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)含量、相對電導(dǎo)率、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和葉片染色等的變化，以揭示外源EBR對桑樹幼苗脅迫的影響，及其在輔助植物修復(fù)鹽脅迫中的潛在生理作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為雜交桑桂桑優(yōu)12，其母本為沙2，父本為7722，購自廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站。試驗(yàn)所用24-表油菜素內(nèi)酯(EBR)購自北京Coolaber公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年4月，在山東省蠶業(yè)研究所溫室大棚進(jìn)行。培養(yǎng)條件為：光周期14 h/8 h、溫度25℃，相對濕度60%～70%。挑選健康、飽滿的桂桑優(yōu)12種子，播種于10 cm×10 cm×9 cm育苗盆中，草炭土和蛭石比例為2∶1，四葉一心期間苗，每盆留苗4棵，期間澆灌1/2 Hoagland營養(yǎng)液以補(bǔ)充營養(yǎng)。

培養(yǎng)兩個(gè)月后，挑選長勢一致的桑樹幼苗，分別用200 mmol·L-1NaCl和不同濃度EBR進(jìn)行澆灌處理。試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)處理，分別為：1)CK：蒸餾水；2)S：200 mmol·L-1NaCl；3)S1∶200 mmol·L-1NaCl+0.01 μmol·L-1EBR；4)S2∶200 mmol·L-1NaCl+0.10 μmol·L-1EBR；5)S3∶200 mmol·L-1NaCl+1.00 μmol·L-1EBR，每個(gè)處理3次重復(fù)，每重復(fù)15盆，每重復(fù)灌溉處理液總體積均為6 L，于處理第7天取材測定相關(guān)生理指標(biāo)。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 植株質(zhì)量測定及根系掃描 每個(gè)重復(fù)取6株植株，用去離子水清洗干凈，然后用吸水紙吸干表面水分，將地上和地下部分開，用FA1004型萬分之一天平(上海菁海)稱取鮮質(zhì)量，然后于105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重，稱干質(zhì)量。將另一份清洗好的根系放入盛水托盤內(nèi)，利用V850 Pro掃描儀(日本愛普生)和Win-RHIZO根系分析系統(tǒng)對根系進(jìn)行掃描并分析總根長、表面積、平均直徑、總體積等指標(biāo)，主根長用直尺測定，每個(gè)重復(fù)6株植株。

1.3.2 葉片化學(xué)染色 每處理取大小一致的6片葉分別進(jìn)行氮藍(lán)四唑(nitrotetrazolium blue chloride，NBT)染色、3,3-二氨基聯(lián)苯胺(3,3-Diaminobenzidine，DAB)染色和伊文斯蘭(Evans blue)染色。NBT染色：將葉片置于100 mL燒杯中，加入80 mL NBT染色液，于室溫染色過夜后，棄去染色液，加入96%乙醇沸水浴10 min脫色。DAB染色：將葉片置于100 mL燒杯中，加入80 mL DAB染色液，于室溫染色過夜后，棄去染色液，加入96%乙醇沸水浴10 min脫色。Evans blue染色：將葉片置于100 mL燒杯中，加入80 mL Evans blue染色液，將燒杯置于真空干燥器中，抽真空15 min，并保持真空6 h，棄去染色液，用10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH值7.8)清洗葉片3～5次去其浮色，加入96%乙醇沸水浴10 min脫色。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。采用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析(ANOVA)，LSD檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性(P<0.05)，采用GraphPad Prism 8.0.2統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源EBR對NaCl脅迫下對桑樹幼苗生長的影響

由表1可知，與CK相比，200 mmol·L-1NaCl(S)脅迫顯著抑制了桑樹幼苗的生長，地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、地下部干質(zhì)量，分別為CK的0.60、0.53、0.64、0.50倍。而外源添加EBR后，隨著EBR濃度的增加，地上部和地下部鮮質(zhì)量及干質(zhì)量均呈先升高后降低的趨勢，S1(200 mmol·L-1NaCl+0.01 μmol·L-1EBR)、S2(200 mmol·L-1NaCl+0.10 μmol·L-1EBR)、S3(200 mmol·L-1NaCl+1.00 μmol·L-1EBR)地下部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均與S差異顯著，S1、S2的地上部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均與S差異顯著，且均以S2最高，其地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、地下部干質(zhì)量分別是S的1.47、1.56、1.36、1.43倍。

由表2可知，單一NaCl脅迫處理(S)對桑樹幼苗根系形態(tài)發(fā)育產(chǎn)生了抑制作用，其主根長、總根長、根表面積、根體積和平均直徑分別為CK的0.84、0.65、0.59、0.55、0.85倍。NaCl脅迫下外源添加EBR后桑樹幼苗根系各項(xiàng)指標(biāo)出現(xiàn)不同幅度增加，且隨著EBR濃度的增加表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢，在S2達(dá)到最高值，其主根長、總根長、根表面積、根體積和平均直徑分別是S處理的1.33、1.14、1.35、1.56和1.28倍，且均與S差異顯著。

表2 外源EBR對NaCl脅迫下桑樹幼苗根系特征的影響

2.2 外源EBR對NaCl脅迫下桑樹幼苗葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

由表3可知，與CK相比，單一NaCl脅迫(S)顯著降低了桑樹幼苗葉片光合色素含量，其葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量分別為CK的0.61、0.63、0.62、0.62倍。NaCl脅迫下外源添加EBR緩解了桑樹幼苗葉片光合色素含量的降低，且隨著添加EBR濃度的增加，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均呈先升高后降低的趨勢，且在S2達(dá)到最大值，分別是S的1.48、1.48、1.48和1.41倍，并與S差異顯著。

2.3 外源EBR對NaCl脅迫下桑樹幼苗ROS含量的影響

2.4 外源EBR對NaCl脅迫下桑樹幼苗丙二醛含量及相對電導(dǎo)率的影響

由圖2可知，與CK比較，單一NaCl脅迫(S)顯著提高了桑樹幼苗葉片及根系的MDA含量和相對電導(dǎo)率，分別為CK的1.82、1.52(葉片、根)和2.42、1.83倍。隨著添加EBR濃度的增加，葉片及根系中的MDA含量和相對電導(dǎo)率均呈先降低后升高的趨勢。其中S2葉片和根系的MDA含量顯著低于S，分別為S的0.70和0.77倍。同樣，S2葉片和根系的相對電導(dǎo)率顯著低于S，分別為S的0.65和0.69倍。

表3 外源EBR對NaCl脅迫下桑樹幼苗葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

圖2 外源ERB對NaCl脅迫下桑樹幼苗葉片及根系中MDA含量及相對電導(dǎo)率的影響

2.5 外源EBR對NaCl脅迫下桑樹幼苗葉片染色的影響

圖3 外源EBR對NaCl脅迫下桑樹幼苗葉片染色的影響

2.6 外源EBR對NaCl脅迫下桑樹幼苗抗氧化酶系統(tǒng)的影響

由圖4可知，單一NaCl脅迫(S)下桑樹幼苗葉片和根系的抗氧化酶活性均較CK顯著提高，其中SOD、POD、CAT活性，在葉片中分別為CK的1.45、1.48、1.48倍，在根系分別為CK的1.38、1.35、1.30倍。隨著添加ERB濃度的增加，抗氧化酶活性呈先升高后降低的趨勢，其中S2的抗氧化酶活性最高，且其葉片和根系中抗氧化酶活性均顯著高于S，葉片中SOD、POD、CAT活性分別是S的1.37、1.33、1.57倍，根系中為S的1.47、1.36、1.43倍。

2.7 外源ERB對NaCl脅迫下桑樹幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

如圖5所示，與CK相比，單一NaCl脅迫總體顯著增加了桑樹幼苗葉片和根系滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Pro、可溶性糖和可溶性蛋白含量，分別為CK的1.53和1.56倍、1.40和1.26倍、1.66和1.15倍。隨著外源EBR濃度的增加，3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均呈先增加后降低的趨勢，均于S2達(dá)到最大值，且與S存在顯著差異。S2葉片和根系產(chǎn)生Pro含量為S的1.40和1.42倍，可溶性糖含量為S的1.68和1.43倍，可溶性蛋白含量是S的1.40和1.42倍。

3 討論

3.1 外源ERB對NaCl脅迫下桑樹幼苗生長的影響

鹽脅迫嚴(yán)重影響植物生長發(fā)育，并可顯著降低植物生物量的積累[20]。本研究結(jié)果表明，200 mmol·L-1NaCl脅迫顯著降低了桑樹幼苗地上和地下部的鮮質(zhì)量及干質(zhì)量，并顯著降低了主根長、總根長、根表面積、根體積和平均直徑等根系形態(tài)特征，說明200 mmol·L-1NaCl脅迫抑制了桑樹幼苗的生長。這可能是因?yàn)辂}脅迫使土壤中可溶性鹽濃度升高，導(dǎo)致植物根系細(xì)胞產(chǎn)生脫水和滲透脅迫，從而損害植物的正常代謝，使根系吸水困難，導(dǎo)致植物生長緩慢，最終使生物量積累下降[21-22]。

圖4 外源ERB對NaCl脅迫下桑樹幼苗葉片和根部SOD、POD和CAT活性的影響

圖5 外源EBR對NaCl脅迫下桑樹幼苗葉片和根部Pro(A)、可溶性糖(B)和可溶性蛋白(C)含量的影響

外源生長調(diào)節(jié)劑EBR可誘導(dǎo)和增強(qiáng)鹽脅迫下植物的耐受性[23]。本研究表明，濃度為0.10 μmol·L-1EBR(S2)顯著提高了NaCl脅迫下桑樹幼苗主根長、總根長、根表面積、根體積和平均直徑以及地上和地下部的鮮質(zhì)量及干質(zhì)量，這與Yuan等[24]的研究一致。表明外源添加EBR可減緩鹽脅迫對植物的毒害作用，這可能是由于EBR可以通過激活細(xì)胞壁松弛酶來調(diào)節(jié)細(xì)胞的伸長和分裂[25]。

3.2 外源EBR對NaCl脅迫下桑樹幼苗葉片光合色素的影響

鹽脅迫對色素系統(tǒng)和光合作用機(jī)制具有負(fù)面影響，表現(xiàn)為植物葉綠素含量降低并導(dǎo)致光合作用效率下降，主要是由于鹽可以加速葉綠素分子的分解并導(dǎo)致葉綠素生物合成受阻[26]。本研究結(jié)果表明，200 mmol·L-1NaCl脅迫顯著降低了光合色素含量，而在鹽脅迫的同時(shí)外源添加0.10 μmol·L-1EBR時(shí)，光合色素含量降低得到了最佳的緩解。這可能是由于EBR在植物體內(nèi)可充當(dāng)信號分子，誘導(dǎo)鹽脅迫下葉綠體形態(tài)的恢復(fù)，并促進(jìn)葉綠體顆粒的形成[27]。此外，施加EBR后葉綠素含量的恢復(fù)也可能是由于mRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)了葉綠素的生物合成，同時(shí)EBR可使葉綠素酶編碼基因下調(diào)，減少葉綠素分子的降解[28]。

3.3 外源ERB對NaCl脅迫下桑樹幼苗ROS水平、脂質(zhì)過氧化程度和細(xì)胞質(zhì)膜完整性的影響

鹽脅迫可以顯著影響植物細(xì)胞質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化，從而改變質(zhì)膜滲透性，進(jìn)而調(diào)節(jié)離子的滲透模式[34]。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物，其積累反映了ROS引起的細(xì)胞膜損傷程度[35]。在本研究中，單一NaCl脅迫下桑樹幼苗的根系和葉片中MDA和相對電導(dǎo)率均較CK顯著增加，表明鹽脅迫引起了桑樹幼苗的氧化脅迫反應(yīng)。這與在薄荷[36]、草莓[37]、水稻[38]中的結(jié)果相似。Evans blue葉片化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)一步說明NaCl脅迫加劇了桑樹幼苗葉片的脂質(zhì)過氧化程度，破壞了細(xì)胞質(zhì)膜的完整性。外源添加EBR后降低了桑樹幼苗MDA的產(chǎn)生，促進(jìn)了電解質(zhì)滲透率的下降，表明EBR可以在鹽脅迫下增加膜的穩(wěn)定性。這可能與EBR可以穩(wěn)定膜蛋白并能清除產(chǎn)生的ROS有關(guān)[39]。

3.4 外源ERB對NaCl脅迫下桑樹幼苗抗氧化酶的影響

在自然界中，ROS的生成速度非常緩慢，并且在生成和淬滅之間保持了適當(dāng)?shù)钠胶?。但?dāng)鹽脅迫打破這種平衡時(shí)，會引起細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間ROS水平的快速升高，從而對植物造成氧化損傷[40-41]。為了避免這種損害，植物自身會提高抗氧化酶和非酶物質(zhì)來清除ROS。本研究中，單一NaCl脅迫下桑樹幼苗葉片和根系的SOD、CAT、POD活性均較CK顯著增加，表明植物為了清除鹽脅迫下產(chǎn)生的過量ROS，啟動了抗氧化系統(tǒng)，提高了抗氧化酶活性。然而在NaCl脅迫下外源添加EBR后，桑樹幼苗葉片和根系的抗氧化酶活性隨EBR濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，但整體活性仍高于單一Nacl脅迫處理。這可能是因?yàn)锽R通?？梢宰鳛槭荏w/配體復(fù)合物，與細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)結(jié)合，調(diào)節(jié)特定應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)抗氧化酶活性[42-43]。

3.5 外源ERB對NaCl脅迫下桑樹幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

Pro作為一種滲透保護(hù)劑，被認(rèn)為是一種膜穩(wěn)定劑和ROS清除劑，作為信號分子，Pro是植物從環(huán)境脅迫恢復(fù)過程中必不可少的分子[44]?？扇苄蕴窃谥参矬w內(nèi)具有滲透保護(hù)、碳儲存和清除自由基的作用[45]?？扇苄缘鞍鬃鳛榧?xì)胞的重要組成部分，可以響應(yīng)外界脅迫，參與滲透調(diào)節(jié)。在本研究中，單一NaCl脅迫引發(fā)了Pro、可溶性糖、可溶性蛋白含量的增加，而外源添加EBR后Pro、可溶性糖、可溶性蛋白含量呈先增加后降低的趨勢，在S2(EBR濃度為0.10 μmol·L-1)積累量達(dá)到最高，這表明EBR增強(qiáng)了桑樹幼苗葉片和根系的滲透調(diào)節(jié)能力，從而減輕了氧化應(yīng)激。

4 結(jié)論

綜上所述，將桑樹幼苗經(jīng)200 mmol·L-1NaCl脅迫處理會引起氧化應(yīng)激，從而抑制桑樹幼苗葉片和根系的生長，降低了鮮/干質(zhì)量和光合色素含量，提高了活性氧積累量、抗氧化酶活性、MDA含量、電解質(zhì)滲透率和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量。外源添加濃度為0.10 μmol·L-1EBR，可有效緩解NaCl脅迫對桑樹幼苗葉片和根系生長抑制作用，使得桑樹葉片和根系鮮/干重、光合色素含量、抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量顯著增加，并顯著降低了ROS積累量、膜脂過氧化水平和相對電導(dǎo)率，緩解了NaCl對桑樹幼苗葉片和根系的氧化損傷，增強(qiáng)了桑樹幼苗的耐鹽性。