獨(dú)行菜LaBBX基因低溫表達(dá)響應(yīng)與密碼子偏性分析

周 茜 陳 蕓 王玉州 王繼蓮 凱迪日耶·玉蘇普 趙惠新

(1 喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院/葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 喀什 844006；2 新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室/干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054)

鋅指蛋白(zinc finger protein，ZFP)類轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物中，有含鋅離子構(gòu)成的鋅指結(jié)構(gòu)域，在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育及逆境響應(yīng)等方面發(fā)揮重要的作用[1]。其中，BBX是一類含B-box結(jié)構(gòu)域的鋅指轉(zhuǎn)錄因子蛋白，通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，參與植物生長(zhǎng)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境響應(yīng)；如蘋果(Malusdomestica)BBX類轉(zhuǎn)錄因子MdBBX10基因，在擬南芥中過表達(dá)該基因使轉(zhuǎn)基因擬南芥具有抗干旱和耐鹽等特性[2-3]。水稻(Oryzasativa)BBX類轉(zhuǎn)錄因子OsCOIN，使過表達(dá)的水稻株系具有抗寒、耐鹽和抗干旱等特性[4]。菊花(Dendranthemamorifolium)CmBBX24和CmBBX22基因，能夠響應(yīng)低溫、干旱等脅迫過程[5-6]。另外，高鹽和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)處理能夠誘導(dǎo)馬鈴薯(SolanumtubersumL.)中SsBBX24基因的表達(dá)和蛋白積累，且日照時(shí)間長(zhǎng)短還能調(diào)控SsBBX24對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)[7]。雖然目前BBX類的轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆境脅迫等方面有了一定研究，但該類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)理復(fù)雜，不同植物的不同BBX類轉(zhuǎn)錄因子功能不同，還需要更加深入研究。

密碼子是遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)準(zhǔn)確傳遞的樞紐[8-9]。密碼子偏性是物種進(jìn)化過程中，受環(huán)境等因素影響，使原本隨機(jī)選用的密碼子，形成了選擇偏性，特定地選用某一密碼子。密碼子偏性的存在，導(dǎo)致基因的堿基組成和基因表達(dá)水平受影響[10]。優(yōu)先被使用的密碼子數(shù)量越多，越有利于基因表達(dá)[11]。評(píng)價(jià)密碼子使用偏好性的參數(shù)主要有有效密碼子數(shù)(effective number of codons，ENc)、同義密碼子相對(duì)使用度(relative synonymous codon usage，RSCU)、密碼子適應(yīng)指數(shù)(codon adaptation index，CAI)和不同位置GC含量等[10]。密碼子偏好性分析能為特定基因的功能預(yù)測(cè)[12]、進(jìn)化水平[13]和表達(dá)調(diào)控機(jī)制[14]等提供重要參考。近年密碼子使用偏性在許多植物中均有報(bào)道，但鮮見獨(dú)行菜(Lepidiumapetalum)BBX類轉(zhuǎn)錄因子密碼子偏性的相關(guān)研究。

早春短命植物獨(dú)行菜分布廣泛，能夠在早春低溫環(huán)境中萌發(fā)生長(zhǎng)，有較強(qiáng)的低溫耐受性[15]。獨(dú)行菜的種子又名北葶藶子，是具有止咳、強(qiáng)心、消腫等藥效的重要中藥材。目前獨(dú)行菜的研究多集中于藥用開發(fā)等方面[16]，在其種子低溫萌發(fā)特性[17]、幼苗生長(zhǎng)耐受低溫機(jī)制[18]等有一些相關(guān)研究，但其調(diào)控機(jī)制仍不清楚。本研究前期已經(jīng)完成了獨(dú)行菜種子低溫萌發(fā)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作，獲得了大量關(guān)于BBX類轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄組序列信息[19]。本研究對(duì)獨(dú)行菜低溫萌發(fā)前后的轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行比對(duì)，選擇克隆與植物低溫耐受性相關(guān)的LaBBX基因，探討?yīng)毿胁擞酌缰性摶虮磉_(dá)對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)，并通過其密碼子偏性分析，以期為研究BBX類轉(zhuǎn)錄因子在獨(dú)行菜種子低溫萌發(fā)生長(zhǎng)的分子調(diào)控機(jī)制和LaBBX基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

獨(dú)行菜種子采自烏魯木齊鯉魚山，由新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院趙惠新教授鑒定為獨(dú)行菜(Lepidiumapetalum)。以其種子萌發(fā)的幼苗作為材料，干種子置于4℃干燥保存。

1.2 獨(dú)行菜LaBBX基因cDNA的全長(zhǎng)克隆

獨(dú)行菜種子4℃低溫處理10 d，于25℃放置1 h后，液氮研磨使用Trizol試劑提取總RNA。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，選取BBX類轉(zhuǎn)錄因子中上調(diào)表達(dá)較高的轉(zhuǎn)錄本序列c16697_g1。根據(jù)BBX基因同源性較高的cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物(BBX-P1:5′-A T G A A G A T W C A A T G T G A T G T G TG-3′和B-box-P2:5′-T A G T T T A G C C T A G G T C Y G G G AC-3′)。以2 μL cDNA為模板，25 μL Taq PCR Master Mix(北京天根公司)，正反引物各2 μL，ddH2O補(bǔ)足總體積為50 μL進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；94℃變性45 s，54.5℃退火50 s，72℃延伸50 s，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；置于4℃保存。

1.3 LaBBX基因的生物信息學(xué)分析

將測(cè)出的cDNA序列拼接后，經(jīng)BLAST比對(duì)分析；利用ProtParam在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)基本信息；使用SOPMA和SWISS-MODEL進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和三維建模；利用WoLFPSORT和TMHMM進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和推測(cè)是否跨膜[20]。

1.4 LaBBX基因的表達(dá)分析

取獨(dú)行菜種子在25℃下培養(yǎng)10 d，于4℃低溫下分別處理0、6、12和24 h后，提取幼苗的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以獨(dú)行菜Actin作為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量(real-time quantitative，qRT-PCR)引物(qActin-F：5′-C C A A A G G C C A A C A G A G A G A A G AT-3′和qActin-R：5′-T G A G A C A C A C C A T C A C C A G A AT-3′)。根據(jù)克隆獲得的LaBBX基因cDNA序列，設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(BBX-GSP-F：5′-A T G T T G T G C C G A T G A A G C TG-3′和BBX-GSP-R：5′-A T G T C G C A G G G A G G G A A T TT-3′)。采用qRT-PCR技術(shù)，測(cè)定不同處理?xiàng)l件下LaBBX基因表達(dá)量。

1.5 LaBBX基因的密碼子偏性分析

從GenBank中獲取擬南芥等25種BBX基因的序列信息(表1)。

大腸桿菌(Escherichiacoli)、酵母菌(Sacharomycescerevisiae)、擬南芥和煙草等模式生物的基因組密碼子使用偏性數(shù)據(jù)，下載自Codon Usage Database網(wǎng)站。使用相關(guān)軟件對(duì)26種植物BBX基因的密碼子使用頻率等相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算[21-22]。將所得的數(shù)據(jù)采用Excel及SPSS軟件處理，對(duì)BBX基因的密碼子成分相關(guān)性、ENc、PR2(PR2-bias plot analysis)和中性進(jìn)行運(yùn)算分析。采用SPSS 19.0軟件分析26種BBX基因相應(yīng)密碼子的RSCU值，采用Ward算法按照使用偏性對(duì)物種進(jìn)行聚類，用歐氏平方距離表示基因間的進(jìn)化距離[23]。將26個(gè)基因構(gòu)建編碼序列(coding sequence, CDS)，采用鄰接法利用MEGA 5.0構(gòu)建不同物種BBX基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 獨(dú)行菜LaBBX基因cDNA全長(zhǎng)克隆

提取獨(dú)行菜總RNA后，經(jīng)瓊脂糖檢測(cè)，RNA條帶清晰質(zhì)量較好(圖1-A)。反轉(zhuǎn)錄后，通過PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度約為750 bp的條帶(圖1-B)。對(duì)目的條帶片段進(jìn)行回收，連接到載體pMD19-T上進(jìn)行測(cè)序，得到734 bp序列片段，序列開放閱讀框(open reading frame, ORF)長(zhǎng)度729 bp，編碼242個(gè)氨基酸(圖2)。測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，將其CDS序列與25個(gè)物種的BBX基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖3，在進(jìn)化樹上該基因與擬南芥BBX基因的親緣關(guān)系最近，功能上可能也類似。因此，命名為L(zhǎng)aBBX，獲得GenBank登錄號(hào)為：MT886449。

2.2 LaBBX基因的生物信息學(xué)分析

獨(dú)行菜LaBBX基因的序列信息如圖2，LaBBX蛋白質(zhì)分子量為61.66 kDa，理論等電點(diǎn)pI為5.09；總原子數(shù)3 724個(gè)，蛋白質(zhì)分子式為C1173H1832N330O374S15；不穩(wěn)定系數(shù)為43.71，屬于不穩(wěn)定蛋白；含酸性氨基酸38個(gè)，堿性氨基酸25個(gè)；半衰期為30 h；脂溶指數(shù)73.84，總平均親水性的數(shù)值為-0.479，屬于酸性親水的不穩(wěn)定蛋白。

表1 BBX基因編碼區(qū)序列

注：A：獨(dú)行菜總RNA電泳圖，M為Maker Trans 2K Plus，1～4為獨(dú)行菜種子總RNA；B：LaBBX基因PCR擴(kuò)增電泳圖，M為DNA Marker 2 000，1～2為L(zhǎng)aBBX PCR產(chǎn)物。

圖2 LaBBX基因的cDNA序列和推定的氨基酸序列

圖3 BBX基因CDS序列系統(tǒng)聚類分析

LaBBX蛋白預(yù)測(cè)無信號(hào)肽，對(duì)獨(dú)行菜LaBBX結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析(圖4)，其含2個(gè)B-box鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，分別存在于4～47和52～99氨基酸殘基之間。對(duì)LaBBX蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(圖5)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)由23.55%的α-螺旋、16.12%的延伸鏈、1.65%的β-轉(zhuǎn)角和58.68%的無規(guī)卷曲組成。LaBBX蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖6，并對(duì)其構(gòu)建了三維蛋白模型。獨(dú)行菜LaBBX蛋白質(zhì)不具有跨膜區(qū)，不是膜結(jié)合蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)中LaBBX蛋白可能主要存在于細(xì)胞核中。推測(cè)LaBBX蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子蛋白可能主要在細(xì)胞核發(fā)揮功能，這為后續(xù)蛋白質(zhì)的功能分析提供了參考依據(jù)，但要明確該蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位仍需后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

圖4 LaBBX結(jié)構(gòu)域分析

注：藍(lán)色: α-螺旋; 紫色: 無規(guī)則卷曲; 綠色: β-折疊; 紅色: 伸展鏈；圖中數(shù)字代表蛋白質(zhì)氨基酸序列的不同位點(diǎn)。

圖6 LaBBX蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3 獨(dú)行菜幼苗LaBBX基因表達(dá)對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)

利用qRT-PCR分析LaBBX基因在獨(dú)行菜幼苗期低溫處理下的表達(dá)量。結(jié)果表明，4℃低溫脅迫處理后獨(dú)行菜幼苗中LaBBX基因的表達(dá)量迅速升高。低溫處理6 h后，上調(diào)表達(dá)量約為未處理的21倍，且在24 h內(nèi)一直維持在較高的水平(圖7)。這表明LaBBX基因上調(diào)表達(dá)可以迅速響應(yīng)低溫脅迫。其可能作為上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，對(duì)低溫迅速響應(yīng)，使得下游的相關(guān)基因及時(shí)表達(dá)，使植物體能夠迅速啟動(dòng)耐低溫機(jī)制，防止低溫脅迫對(duì)植物幼苗造成的傷害。

注：不同小寫字母表示不同處理間表達(dá)差異顯著(P<0.05)。

2.4 獨(dú)行菜LaBBX基因密碼子偏好性分析

2.4.1 獨(dú)行菜LaBBX基因密碼子相關(guān)分析 ENc是有效密碼子數(shù)，取值在20～61之間，越接近20，表明氨基酸選取密碼子越偏向少數(shù)特定密碼子，則偏好程度越高；其值越大，表明編碼氨基酸時(shí)越多的密碼子被選用，甚至某些不常用的密碼子也會(huì)被選用，偏好程度較低[24]。由表2可知，獨(dú)行菜LaBBX基因的ENc值為55.453，表明其翻譯中密碼子選用偏好性弱。密碼子的GC1、GC2、GC3、GC含量分別為58.02%、40.33%、41.98%和46.78%，表明大多密碼子偏好使用AT并選用AT結(jié)尾。密碼子適用指數(shù)CAI值的范圍在0～1之間，越小表明偏好性越弱。LaBBX基因的CAI值為0.244，也體現(xiàn)出密碼子的選用偏好性弱。

表2 LaBBX基因密碼子使用偏性相關(guān)參數(shù)

RSCU值為某一密碼子選用頻率與同義密碼子無選用偏性的比值，能夠體現(xiàn)某一密碼子偏性的強(qiáng)弱。當(dāng)RSCU值為1，編碼特定氨基酸選用的密碼子是隨機(jī)的；RSCU值>1時(shí)，編碼氨基酸偏向于選用特定的密碼子；RSCU值<1時(shí)，不偏向于特定密碼子[25]。采用CodonW對(duì)獨(dú)行菜LaBBX基因的RSCU值進(jìn)行計(jì)算(圖8)，RSCU值>1.5的有8個(gè)，RSCU值>1的有25個(gè)。編碼亮氨酸的密碼子中，CTA、CTC、CTG、TTG和TTA的RSCU值分別為1.30、0.78、0.00、0.52和0.26，而CTT的RSCU值為3.13，其偏好性最強(qiáng)。密碼子GCT、ACT和GTT的RSCU值均大于2，體現(xiàn)出較高的使用偏性。CGG和CTG的RSCU值為0，表明其在基因編碼時(shí)不被選用。其余RSCU值小于1的密碼子，被選擇使用的頻率低。由于CTT、GCT、ACT和GTT在同義密碼子中選用頻率較高，導(dǎo)致ENc值小于61。

注：圖中數(shù)字表示同義密碼子相對(duì)使用度(RSCU)；下劃線表示獨(dú)行菜LaBBX基因?qū)υ撁艽a子使用頻率較高。

2.4.2 不同物種BBX基因的聚類分析 RSCU聚類分析發(fā)現(xiàn)(圖9)26個(gè)物種聚為兩大類。第一大類由8種十字花科植物，3種茄科植物，2種豆科植物等組成；其中，7種十字花科植物，3種茄科植物，2種豆科植物，各歸為一小類。第二大類由5種單子葉禾本科植物聚類而成；其中，十字花科的甘藍(lán)與蘋果和大豆聚為一小支，而蘋果未與同屬薔薇科的珠美海棠聚為小支，同屬豆科的紫花苜蓿也未與大豆聚為小支。禾本科的單子葉植物玉米與麻雀花聚為一小支；同屬薔薇科的草莓和蘋果并沒有聚在一支。可見RSCU系統(tǒng)聚類中，密碼子使用頻率相近的物種其親緣可能較近，也可能較遠(yuǎn)。因此物種親緣關(guān)系與密碼子使用偏性有時(shí)不存在相關(guān)性，體現(xiàn)出BBX基因密碼子選用偏好的豐富性。

圖9 BBX基因密碼子使用偏性聚類分析

與26個(gè)物種BBX基因的CDS序列聚類結(jié)果相比(圖3)，RSCU聚類結(jié)果有所不同。十字花科的獨(dú)行菜和親緣關(guān)系最近的擬南芥先聚成一小支，又與其他十字花科植物聚為一小類。綜合分析聚類結(jié)果，CDS序列聚類分析結(jié)果更接近傳統(tǒng)的物種親緣關(guān)系分類，而RSCU聚類分析僅能在密碼子使用偏性上體現(xiàn)物種的特殊進(jìn)化規(guī)律。

2.4.3 不同BBX基因的中性分析 對(duì)26個(gè)BBX基因的各GC含量和ENc進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)GC、GC1、CG2和CG3互為極顯著正相關(guān)性(P<0.01)，表明不同物種BBX基因堿基組成相似(表3)。如圖10的中性分析，GC3值在0.323 7～0.938 2之間，GC12的范圍為0.465 8～0.587 6，多數(shù)BBX基因于回歸線左右分布，波動(dòng)范圍較小。GC3和GC12的極顯著相關(guān)系數(shù)為0.957(P<0.01)，線性回歸系數(shù)為0.916 25，表明不同BBX基因的密碼子存在選擇偏好性，受突變壓力的影響[26-29]。獨(dú)行菜LaBBX基因位于回歸線上，與雙子葉植物分布的位點(diǎn)相近，與聚類分析結(jié)果相一致。

表3 BBX基因密碼子成分相關(guān)性分析

圖10 BBX相關(guān)基因密碼子使用偏好中性繪圖

2.4.4 不同物種BBX基因ENc和PR2分析 ENc值與GC3s值繪制的期望曲線，基因位點(diǎn)分布越近，基因選擇偏性受堿基突變影響大，反之，受自然選擇等其他因素影響較大[30-31]。不同物種BBX基因分析結(jié)果顯示(圖11)，小麥、花毛竹、甘藍(lán)、蘿卜和馬蹄筍的基因位點(diǎn)在曲線上，表明基因突變是其密碼子具有選用偏好性的主要因素[32]。獨(dú)行菜、擬南芥、蘋果和馬鈴薯等11個(gè)物種分布在曲線上面，其余10個(gè)物種分布在曲線下面，表明這些BBX基因密碼子偏性選擇，除受堿基突變影響以外，主要受自然選擇表達(dá)量和基因長(zhǎng)度等因素的影響。

圖11 BBX相關(guān)基因的ENc-plot分布

如果PR2分析中基因位點(diǎn)均勻分布在坐標(biāo)軸中心，說明4種堿基使用的頻率一致，其密碼子偏好性主要受堿基突變影響，若偏離中心位置說明受其他因素影響[33]。由圖12可知，G3/(G3+C3)或A3/(A3+T3)值不位于0.5左右。橫坐標(biāo)的值顯示，大多數(shù)位點(diǎn)小于0.5，表明BBX基因密碼子在選用G與C時(shí)，偏向于堿基C結(jié)尾?？v坐標(biāo)上的值均小于0.5，說明BBX基因在堿基A和T選擇上，偏向于T結(jié)尾。當(dāng)PR2分析的值都偏于0.5時(shí)，表明密碼子在堿基選擇時(shí)，會(huì)受自然選擇等其他壓力因素的影響[33]。

注：A3、T3、G3、C3分別表示密碼子第三位上堿基的含量。

2.4.5 獨(dú)行菜LaBBX基因受體系統(tǒng)的選擇 獨(dú)行菜遺傳轉(zhuǎn)化體系尚未完善，還需借助遺傳轉(zhuǎn)化體系完善的物種作為基因的表達(dá)受體系統(tǒng)。將獨(dú)行菜LaBBX基因與大腸桿菌、酵母菌和擬南芥等6個(gè)物種的基因組密碼子選用頻率比值進(jìn)行計(jì)算(表4)。物種間同一密碼子使用頻率比的范圍如在0.5～2.0之間，表明物種間在使用該密碼子時(shí)偏好程度差異小[34]；如≤0.5或≥2.0時(shí)，表明物種間密碼子選用該密碼子時(shí)偏好程度差異大[26]。獨(dú)行菜LaBBX基因與大腸桿菌密碼子頻率比值差異明顯的有25個(gè)，酵母菌有24個(gè)，表明酵母菌更適合獨(dú)行菜LaBBX基因的異源表達(dá)。獨(dú)行菜LaBBX基因與擬南芥、煙草、番茄和玉米密碼子使用頻率差異較大的個(gè)數(shù)，分別為20、20、24和22，表明煙草和擬南芥均能作為獨(dú)行菜LaBBX基因功能驗(yàn)證的異源受體，且擬南芥與獨(dú)行菜物種親緣較近，也可能是其瞬時(shí)表達(dá)最佳的受體。

表4 獨(dú)行菜LaBBX基因與部分模式生物基因組密碼子使用偏性比較

3 討論

鋅指蛋白除了能夠與DNA和RNA結(jié)合外，還能夠與自身或者其他鋅指蛋白結(jié)合，并能夠識(shí)別DNA-RNA雙鏈分子，不僅在轉(zhuǎn)錄水平上起重要的調(diào)控作用，在翻譯水平上也起著調(diào)控基因表達(dá)的作用。BBX類轉(zhuǎn)錄因子在克隆和組織表達(dá)特異性等有較多報(bào)道，但在抗逆境脅迫方面研究甚少[35]。獨(dú)行菜作為典型的早春短命植物，具有較強(qiáng)的耐受低溫能力，究其原因，是因?yàn)槭艿蜏孛{迫后顯著上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子可能在其低溫萌發(fā)生長(zhǎng)過程中起重要的調(diào)控作用[36-37]。

本研究克隆獲得在獨(dú)行菜受低溫脅迫后顯著上調(diào)的BBX類轉(zhuǎn)錄因子基因LaBBX，編碼序列全長(zhǎng)729 bp，含242個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，其含2個(gè)轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控相關(guān)的重要功能結(jié)構(gòu)域：B-box鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，且LaBBX蛋白可能主要在細(xì)胞核發(fā)揮功能，這與LaBBX蛋白為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)果相符。前期研究表明，獨(dú)行菜幼苗在經(jīng)過低溫脅迫后，與抗低溫脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子會(huì)啟動(dòng)表達(dá)，調(diào)控與抗低溫相關(guān)的基因表達(dá)[19]。獨(dú)行菜LaBBX基因在4℃低溫脅迫處理后表達(dá)量迅速升高，且表達(dá)量都保持在較高水平。表明LaBBX基因表達(dá)量能夠響應(yīng)低溫迅速升高，及時(shí)調(diào)控與抗低溫脅迫相關(guān)的基因表達(dá)，防止低溫脅迫對(duì)幼苗造成傷害。因此推測(cè)，LaBBX基因表達(dá)量保持在較高水平可能有助于調(diào)控下游相關(guān)耐低溫基因的表達(dá)，以提高獨(dú)行菜的低溫生長(zhǎng)耐受性，抵御早春的低溫生長(zhǎng)環(huán)境。

探究獨(dú)行菜LaBBX基因密碼子偏好性，可以揭示其基因的密碼子組成特性，探索其在進(jìn)化過程中的規(guī)律及選擇其適宜的外源遺傳轉(zhuǎn)化受體，為深入研究獨(dú)行菜LaBBX基因的功能提供依據(jù)。研究分析發(fā)現(xiàn)高頻密碼子的使用，使得獨(dú)行菜LaBBX基因存在密碼子偏性，且LaBBX基因密碼子選用偏好性弱，密碼子偏好使用AT并選用AT結(jié)尾，這符合大部分雙子葉植物的密碼子組成規(guī)律[38]。在RSCU和CDS序列聚類分析中，親緣關(guān)系與密碼子使用偏性有時(shí)不存在相關(guān)性，然而CDS序列聚類分析結(jié)果更接近傳統(tǒng)的物種親緣關(guān)系分類，表明RSCU聚類分析僅能在密碼子使用偏性上體現(xiàn)物種的特殊進(jìn)化規(guī)律。密碼子使用偏好性主要受突變壓力和自然選擇的影響，綜合BBX基因的PR2偏好性分析、中性繪圖和ENc繪圖分析，表明不同BBX基因在密碼子選用偏好性，除受堿基突變影響以外，還主要受自然選擇表達(dá)量和基因長(zhǎng)度等因素的影響。

物種間密碼子使用頻率的比值差異小，表明物種間密碼子使用偏性差異不大，差異越小越有利于基因的異源表達(dá)[39]。酵母菌與獨(dú)行菜LaBBX基因密碼子選用頻率比值差異最小，因此較適合異源表達(dá)，同樣煙草和擬南芥也能作為其功能驗(yàn)證的異源受體。但實(shí)際應(yīng)用中需要對(duì)部分密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并綜合LaBBX基因的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控和轉(zhuǎn)化效率等因素，來決定其能否較高表達(dá)，所以使獨(dú)行菜LaBBX基因在異源植株高效遺傳表達(dá)仍需深入研究。

4 結(jié)論

本研究對(duì)獨(dú)行菜LaBBX基因進(jìn)行克隆，初步探究了其在幼苗低溫生長(zhǎng)的響應(yīng)特征和基因密碼子偏好性。qRT-PCR分析LaBBX基因顯示其在獨(dú)行菜幼苗受低溫脅迫時(shí)可能起調(diào)控作用?；蚱眯苑治霭l(fā)現(xiàn)其密碼子使用偏性弱，偏好使用AT，其偏好性的形成與突變和自然選擇等諸多因素相關(guān)。此外，酵母菌和擬南芥是獨(dú)行菜LaBBX基因遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體。本研究為進(jìn)一步探討?yīng)毿胁说蜏孛劝l(fā)生長(zhǎng)的相關(guān)調(diào)控機(jī)理和獨(dú)行菜LaBBX基因的異源表達(dá)及基因功能提供了一定參考。