基于PI3K/AKT/eNOS信號通路探討健脾利濕化瘀方抑制前列腺癌血管生成的實驗研究*

張瑤，許月梅，李家合，郭姍琦，李小江，賈英杰

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381；2．天津市河西區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 300201；3．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

前列腺癌（PCa）是臨床發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，2019年美國癌癥中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，前列腺癌發(fā)病率位居第一，病死率位居第二[1]。盡管大多數(shù)患者能從內(nèi)分泌治療中獲益，但同時內(nèi)分泌治療也伴隨著諸多不良反應(yīng)，且?guī)缀跛谢颊咴诮?jīng)過18～36個月的治療后，最終進展成抵抗性前列腺癌[2]。中藥健脾利濕化瘀方是天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科賈英杰教授基于經(jīng)典古籍的挖掘[3]，結(jié)合多年臨證經(jīng)驗[4-7]，臨床應(yīng)用療效確切，已申請專利，基本方由黃芪、補骨脂、刺五加、姜黃、王不留行、炙甘草組成，其中黃芪健脾以補先天、實脾利濕為君藥，刺五加、補骨脂補腎以助利水為臣藥，姜黃、王不留行化瘀消癥散積，共為佐藥，甘草補脾和胃，調(diào)和諸藥為使藥。前期研究表明，健脾利濕化瘀方能夠抑制人前列腺癌PC-3細胞裸鼠移植瘤的生長，有效改善裸鼠生存狀態(tài)，組方中化瘀散結(jié)藥物組能夠有效抑制細胞增殖、遷移侵襲[8-10]。目前，課題組圍繞著方劑抑制血管生成方面展開了新的實驗研究，方案設(shè)計根據(jù)組方不同側(cè)重作用以君臣佐使劃分，抗血管靶向藥人血管內(nèi)皮抑制素作為西藥組，用以陽性對照[11]，觀察全方組與空白對照組、西藥組之間的比較結(jié)果，以及3組拆方之間的對比結(jié)果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料

1.1 實驗細胞及動物 人源前列腺癌PC-3細胞由南開大學(xué)生命科學(xué)院分子所惠贈。SPF級6～8周齡的雄性裸鼠36只，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.2 實驗試劑及儀器 胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜、青霉素/鏈霉素、磷酸鹽緩沖液（PBS）均為美國Thermor Fisher公司產(chǎn)品；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體、血管生成素 1（ANG1）抗體、二抗、酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒均為天津安諾瑞康公司產(chǎn)品；GAPDH、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）、磷酸化的 AKT（p-AKT）、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）抗體均為美國CST。儀器設(shè)備：二氧化碳（CO2）恒溫培養(yǎng)箱、臺式離心機、倒置顯微鏡、Trans-Blot小型轉(zhuǎn)印槽轉(zhuǎn)膜儀均由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)腫瘤實驗室提供。

1.3 實驗藥品及制備 重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液：國藥準字S20050088；健脾利濕化瘀方的制備及質(zhì)控由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供。中藥濃縮液制備方法參照《中藥藥理實驗方法學(xué)》[12]，具體用藥劑量參考《藥理實驗方法學(xué)》[13]，根據(jù)成人每日需要的生藥量105 g換算為小鼠每日生藥量約16g/kg體質(zhì)量，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮為1．5g/mL。

2 方法

2.1 實驗分組及給藥 按照隨機數(shù)字表將36只裸鼠分為空白對照組、西藥組、全方組、君藥組（生黃芪、炙甘草）、臣藥組（刺五加、補骨脂）、佐藥組（姜黃、王不留行），各6只。實驗設(shè)計按照健脾利濕化瘀方君臣佐使配伍分配，由于炙甘草有補脾和胃的功效，與生黃芪歸為君藥組。模型組生理鹽水灌胃20mL；西藥組腹腔注射，每日1次，藥物濃度為8 mg/kg；中藥各給藥組給予中藥湯劑灌胃10 mL/kg，每日2次，共給藥14 d。

2.2 細胞培養(yǎng)及造模 將凍存的細胞復(fù)蘇后，以1640培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素）懸重移至培養(yǎng)瓶中，放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5～6 d進行傳代。將培養(yǎng)好的（約5×106個）PC-3細胞用250 μL含10% FBS的培養(yǎng)液重懸，注射到裸鼠前肢右側(cè)皮下1點注射以造模，并確認造模成功。

2.3 觀察健脾利濕化瘀方對荷瘤小鼠抑瘤作用 14 d后取血、脫頸處死。將瘤塊組織剝離稱質(zhì)量、測量體積，計算抑瘤率[14]=（空白組平均瘤質(zhì)量-各實驗組平均瘤質(zhì)量）/空白組平均瘤質(zhì)量×100%。

2.4 觀察健脾利濕化瘀方對荷瘤小鼠血管生成作用

2.4.1 使用ELISA法檢測小鼠血清VEGF、eNOS的含量 ELISA試劑盒檢測血清中VEGF和eNOS含量，取出樣本及試劑盒后，于室溫平衡30 min。根據(jù)待測樣本的數(shù)量和標準品數(shù)量選擇96孔板，每個標準品孔、空白孔、樣品孔都做3個復(fù)孔。經(jīng)加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌顯色、終止后，應(yīng)用酶標儀，空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的OD值。

2.4.2 免疫組化檢測VEGF、ANG1表達 經(jīng)過固定、脫水、包埋、切片、脫臘、修復(fù)、封閉等過程，將封閉好的切片去除水分，每張標本滴加30μL一抗VEGF、ANG1，放入4℃冰箱過夜；添加二抗，染色后脫水、封片，進行鏡下觀察。以棕褐色細胞核為陽性表現(xiàn)，隨機觀察5個視野（×100），每個視野計數(shù)100個細胞，根據(jù)陽性細胞染色強度進行評分：未染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項評分結(jié)果相加后進行結(jié)果判定。0～1分為陰性（-）；1～3分為弱陽性（+）；3～5分為中度陽性（++）；5～7分為強陽性（+++）[15]。

2.5 Western Blot檢測 PI3K、AKT、p-AKT、eNOS 蛋白的表達 從組織中提取蛋白后計算出樣品濃度，與緩沖液混勻，蛋白變性后冰浴5 min。電泳、轉(zhuǎn)模后封閉，將轉(zhuǎn)過膜后的PVDF膜放入濃度為5%的脫脂奶粉溶液中，置搖床上等待2 h。孵育一抗、加二抗，回收一抗，洗脫一抗10min，3次，加入二抗5mL。顯影后TBST洗脫二抗10 min，分析各條帶的亮度值，與對應(yīng)內(nèi)參（GAPDH）條帶亮度值進行比值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23．0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均值±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 瘤體積、瘤質(zhì)量與抑瘤率 各給藥組分別與空白對照組對比，瘤體積均小于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），說明西藥組、全方組及3 組拆方均具有一定抑瘤作用；各給藥組間比較，西藥組瘤體積最?。≒＜0．05），全方組次之（P＜0．05）；3 組拆方之間比較，具有化瘀消癥散結(jié)作用的佐藥組瘤體積最小，與君藥組（益氣健脾）對比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），與臣藥組（溫腎助陽）對比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。瘤質(zhì)量方面，各給藥組瘤質(zhì)量均明顯低于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；各給藥組間對比，西藥組瘤質(zhì)量最輕（P＜0．05），其次是全方組（P＜0．05），3 組拆方兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。西藥組、全方組、君藥組、臣藥組、佐藥組的抑瘤率分別為：53．95%、41．05%、19．21%、27．37%、31．32%。見表1。

表1 各組瘤質(zhì)量及抑瘤率比較Tab.1 Comparison of tumor weight and inhibitory rate of each group

3.2 ELISA檢測VEGF及eNOS結(jié)果 各給藥組VEGF含量與空白對照組比較，均呈不同程度降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；各給藥組間比較，西藥組最低（P＜0．01），全方組次之（P＜0．05）；3 組拆方間比較，具有化瘀散結(jié)作用的佐藥組VEGF含量最低，君藥組含量最高，君藥組和臣藥組比較（P＞0．05），君藥組佐藥組比較（P＜0．05），君藥組和佐藥組比較（P＞0．05）。各給藥組eNOS含量與模型組比較，均呈不同程度降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；各給藥組間比較，西藥組含量最低（P＜0．01），全方組次之（P＜0．05）；3組拆方之間比較，佐藥組eNOS含量最低，臣藥組含量最高，君臣兩組比較差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），君佐兩組、臣佐兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），見表2。

表2 各組小鼠血清VEGF及eNOS檢測結(jié)果（±s）Tab.2 Result of VEGF and eNOS of rat serum of each group（±s）

表2 各組小鼠血清VEGF及eNOS檢測結(jié)果（±s）Tab.2 Result of VEGF and eNOS of rat serum of each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0．01；與西藥組比較，#P＜0．01；與全方組比較，△P＜0．05；與佐藥組比較，▲P＜0．05。

組別 動物數(shù) V E G F（p g/m L） e N O S（p g/m L）空白對照組 6 5 7．1 5±4．8 5 3 7 2．9 6±1 2．6 1西藥組 6 1 9．3 4±4．7 3* 1 6 2．6 8± 3．1 3*全方組 6 3 3．5 7±4．7 1*# 2 2 2．2 9±1 5．2 8*#君藥組 6 4 6．9 5±3．6 1*#△▲ 3 1 6．7 4±4．7 7*#△臣藥組 6 4 5．9 1±1．3 3*#△ 3 3 1．5 1±4．7 4*#△佐藥組 6 3 9．3 1±3．3 8*#△ 2 9 0．3 1±8．8 1*#△

3.3 免疫組化法檢測VEGF、ANG1結(jié)果 各組瘤組織均不同程度的表達了VEGF、ANG1，與空白對照組相比，各給藥組VEGF中度陽性以上表達率均較弱（P＜0．05）；各給藥組間，西藥組陽性率最低（P＜0．01），全方組陽性率表達次之（P＜0．05）；3 組拆方間比較，佐藥組VEGF中度陽性以上的表達較君藥組和臣藥組兩組減弱，（P＜0．05）。ANG1 中度陽性以上表達率均不同程度減弱，但各組差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；單比較佐藥組與空白對照組、西藥組與空白對照組，ANG1中度陽性以上的表達率明顯減弱，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。見圖1、2。

圖1 各組瘤組織VEGF蛋白表達（SP，×100）Fig.1 Expression of VEGF proteinin tumor tissues of each group（SP，×100）

圖2 各組瘤組織ANG1表達（SP，×100）Fig.2 Expression of ANG1 proteinin tumor tissues of each group（SP，×100）

3.4 Western Blot檢測 PI3K、AKT、p-AKT、eNOS 蛋白的表達 與空白對照組相比，各組小鼠腫瘤組織中PI3K的蛋白表達水平均顯著降低（P＜0．01）；各給藥組間比較，西藥組表達最低、全方組次之（P＞0．05）；3組拆方組間比較，佐藥組PI3K表達有低于其他兩組趨勢，但尚無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），見圖3。

圖3 各組PI3K蛋白的表達（±s）Fig.3 Expression of PI3Kof each group（±s）

與空白對照組比較，各組AKT蛋白表達并無明顯差異（P＞0．05），其中西藥組稍有降低，然而 p-AKT表達均呈降低趨勢（P＜0．05），其中西藥組、全方組、佐藥組與模型組對比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．01）；3 組拆方間比較暫無意義。見圖4。

圖4 各組AKT、p-AKT蛋白的表達（±s）Fig.4 Expression of AKT、p-AKT of each group（±s）

與空白對照組比較，西藥組、全方組和佐藥組小鼠腫瘤組織中eNOS的蛋白表達均呈現(xiàn)降低水平（P＜0．05）；各給藥組間，西藥組、全方組下降水平顯著（P＜0．01），盡管佐藥組 eNOS 蛋白表達低于君藥組、臣藥組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。見圖5。

圖5 各組eNOS蛋白的表達（±s）Fig.5 Expression of eNOSof each group（±s）

4 討論

前列腺癌在中國的發(fā)病率呈日益增長的趨勢，逐漸成為嚴重影響中國男性健康的泌尿系惡性腫瘤之一[16]。腫瘤血管新生對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要作用，良好的血供為腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲提供了必要條件，而影響腫瘤血管生成的分子成分包括細胞因子、生長因子、趨化因子以及相關(guān)信號通路的傳導(dǎo)[17]。目前，研究表明有兩條調(diào)節(jié)途徑參與了血管生成過程，一條是VEGF及其受體（flt-1）調(diào)節(jié)通路，另一條是ANG及其受體（Tie）調(diào)節(jié)通路，這兩條途徑協(xié)同作用，共同促進機體血管形成。相關(guān)研究表明[18-22]，阻斷PI3K-AKT-eNOS信號通路能夠有效地抑制前列腺癌細胞的增殖，阻礙腫瘤血管形成。

既往文獻顯示，部分具有活血化瘀消癥作用的中藥如姜黃、丹參、川芎等，在抑制腫瘤血管生成方面具有一定作用，前期研究發(fā)現(xiàn)，健脾利濕化瘀方對腫瘤血管生成可能存在一定影響，故本實驗為進一步探討其對腫瘤血管的作用，盡管目前沒有任何一個臨床指南將抗血管生成藥物用于前列腺癌的治療，但重組人血管內(nèi)皮抑制劑作為抗血管生成藥物在臨床應(yīng)用廣泛，其作用機制很多種，主要在于直接阻斷VEGF與內(nèi)皮細胞結(jié)合，發(fā)揮抗血管生成作用，且作用是廣譜性的。大量文獻表明，人血管內(nèi)皮抑制劑在抗腫瘤細胞生成實驗中具有明確作用，實驗研究的目的在于探索，因此將其作為本課題探索性實驗的陽性對照。

同時，為進一步明確作用靶點，以中藥配伍組成作為拆方依據(jù)，分為君藥組（黃芪、甘草以健脾益氣）、臣藥組（刺五加、補骨脂以補腎助陽以利水）、佐藥組（姜黃、王不留行以化瘀消癥散結(jié)）3個拆方組。結(jié)果顯示，盡管健脾利濕化瘀方作用弱于西藥組，但全方以及各拆方組均具有一定的抑瘤作用，實驗觀察指標VEGF為血管內(nèi)皮生長因子，是判斷腫瘤血管生成的重要指標，ANG1和eNOS均為影響血管生成的重要因子，進一步證實了健脾利濕化瘀方的抗血管生成作用，這也與前期關(guān)于健脾利濕化瘀方的研究結(jié)果相一致，提示中西醫(yī)聯(lián)合治療可起到協(xié)同作用。

3組拆方間對比，具有益氣健脾作用的君藥組在抑瘤、抗血管生成方面稍弱于臣藥組、佐藥組，但實驗過程中該組小鼠生存質(zhì)量較好，這可能與各拆方扶正與攻邪作用側(cè)重不同相關(guān)。包含姜黃、王不留行的佐藥組具有化瘀消癥散結(jié)作用，在3組拆方中顯示出較好的抑瘤作用和抗血管生成作用，盡管部分數(shù)據(jù)尚不具有統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與實驗裸鼠數(shù)量偏少相關(guān)，但已呈現(xiàn)出組間差距。課題組發(fā)現(xiàn)，姜黃、王不留行藥物其化瘀消癥散結(jié)作用和能與抑制腫瘤血管生長存在某種關(guān)聯(lián)，方藥能夠下調(diào)PI3K、eNOS表達，雖然各組AKT的表達無明顯差異，但活化后的p-AKT組間存在統(tǒng)計學(xué)差異，說明佐藥組中某種作用成分能夠干擾AKT入核而抑制其磷酸化，進而影響PI3K/AKT/eNOS信號通路。

目前針對中醫(yī)藥及其拆方抑制前列腺癌腫瘤血管生成方面的研究甚少，課題組只是將剛得到的檢測結(jié)果進行公布，有陰性也有陽性，重組人血管內(nèi)皮抑制劑的作用機制與中藥湯劑抗血管生成的機制可能不會完全一致，這也是未來前列腺癌課題組需要深入展開研究的方向，在實驗設(shè)計中還應(yīng)不斷完善，將重組人血管內(nèi)皮抑制劑聯(lián)合化療作為對照，以求更為科學(xué)嚴謹。未來進一步深入研究有效拆方中具有藥物靶點，進行血管形態(tài)學(xué)方面的研究，以尋求更確切的抗腫瘤生成、抑制血管生成相關(guān)證據(jù)。