輔助生殖技術(shù)對(duì)胎盤形態(tài)和功能的影響及其相關(guān)機(jī)制

王明，金妮，蘆潔，陳書強(qiáng)，李博

輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology, ART)是指以治療不孕不育癥為目的而采取的一切在體外操作配子及胚胎的治療手段或方法[1]。自1978年第1例“試管嬰兒”誕生，全世界已有600多萬(wàn)試管嬰兒出生，試管嬰兒群體已成為新生人口的重要組成部分[2]。雖然ART的各項(xiàng)技術(shù)不斷優(yōu)化完善，但由于體外環(huán)境與體內(nèi)生理環(huán)境存在極大的差異，ART作為一種醫(yī)源性非生理操作是否會(huì)對(duì)配子及胚胎造成環(huán)境應(yīng)激，進(jìn)而誘發(fā)不良妊娠結(jié)局并增加子代出生后健康風(fēng)險(xiǎn)，一直是生殖學(xué)家們探究的焦點(diǎn)[2-3]。流行病學(xué)研究表明，與自然妊娠相比，ART導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、低出生體重、小于胎齡兒等不良妊娠結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，ART出生的子代發(fā)生出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)增高30%[4-5]。利用小鼠作為動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，ART導(dǎo)致子代出生體重顯著下降，并影響子代心血管系統(tǒng)的發(fā)育，導(dǎo)致血管功能異常[6]。

胎盤是胎兒在宮內(nèi)發(fā)育期間聯(lián)系母體和胎兒的樞紐，負(fù)責(zé)母胎之間物質(zhì)交換，可將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣等從母體轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒，在胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育中扮演著至關(guān)重要的角色[7]。胎盤結(jié)構(gòu)及功能異常對(duì)母體和胎兒都會(huì)造成損害，比如胎盤發(fā)育不全、體積縮小會(huì)導(dǎo)致胎兒發(fā)育不全或胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限[7-8]。此外，胎盤功能異常還會(huì)通過(guò)影響胎兒器官的發(fā)育造成子代成年后代謝性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加[9]。鑒于胎盤在妊娠過(guò)程中的重要作用，本文將對(duì)ART誘發(fā)的胎盤形態(tài)和功能異常，及其相關(guān)的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)綜述。

1 輔助生殖技術(shù)致胎盤的發(fā)育及功能異常是一種普遍現(xiàn)象

由于ART操作中體外環(huán)境與母體生理環(huán)境存在極大的差異，使用促排卵藥物會(huì)對(duì)配子和胚胎的發(fā)育潛能、子宮內(nèi)膜容受性及母體健康產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致妊娠期胎盤發(fā)育異常。在輔助生殖臨床中，大量研究證實(shí)ART會(huì)影響胎盤的正常發(fā)育與功能[10]。流行病學(xué)調(diào)查表明，ART致妊娠后期胎盤重量顯著增加，胎兒低出生體重的發(fā)生率顯著升高，且胎盤重量與胎兒重量的比值顯著增加[5,11]。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，ART致胎盤的厚度增加，且胎盤血腫的發(fā)生概率顯著升高[12]。鏡檢顯示，ART受孕的胎盤絨毛水腫及微鈣化的發(fā)生概率顯著升高[13]。通過(guò)胎盤超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，ART導(dǎo)致胎盤屏障厚度顯著增加，絨毛血管密度下降、血管形態(tài)明顯異常，限制了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的跨胎盤運(yùn)輸[14]。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，ART受孕胎盤中可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體可溶性fms樣酪氨酸激酶受體-1(soluble fms-like tyrosine kianse-1,sFlt-1)表達(dá)上升，而胎盤血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和胎盤生長(zhǎng)因子(placental growth factor，PLGF)表達(dá)下調(diào)，且ART受孕胎盤的蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化組與自然妊娠的胎盤均存在顯著差異[15-18]。小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，ART導(dǎo)致小鼠妊娠末期胎盤過(guò)度生長(zhǎng)、海綿滋養(yǎng)層與迷路滋養(yǎng)層分離異常，胎兒重量顯著降低，且胎盤葡萄糖和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降[19-20]。ART還導(dǎo)致小鼠胎盤的類固醇代謝異常，影響類固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)[21]。利用山羊作為動(dòng)物模型也發(fā)現(xiàn)，ART影響胎盤DNA甲基化酶的活性，并導(dǎo)致胎盤中血管數(shù)量減少且管腔狹窄，血管生成嚴(yán)重受損[22-23]。上述結(jié)果表明，無(wú)論是人類還是動(dòng)物模型，ART致胎盤發(fā)育及功能異常，并進(jìn)一步導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加是一種普遍現(xiàn)象。由于胎盤發(fā)育及功能異常不但影響圍產(chǎn)期新生兒健康，還會(huì)導(dǎo)致子代長(zhǎng)時(shí)程的健康風(fēng)險(xiǎn)增加，因而揭示ART導(dǎo)致胎盤形態(tài)與功能異常的相關(guān)發(fā)生機(jī)制，則顯得尤為重要。

2 印記基因在胎盤生長(zhǎng)發(fā)育中的重要作用

印記基因是指僅有一方親本來(lái)源的同源基因表達(dá)，而來(lái)自另一親本被表觀遺傳學(xué)修飾后沉默的一類特殊基因群體[24]。隨著越來(lái)越多的印記基因在胎盤中被發(fā)現(xiàn)，其在胎盤生長(zhǎng)發(fā)育中的顯著調(diào)控作用被逐漸證實(shí)。研究表明，印記基因不僅通過(guò)調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和分化，參與胎盤的形態(tài)構(gòu)建，還參與調(diào)控胎盤葡萄糖與氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，脂質(zhì)類代謝物的合成，從而影響胎兒的宮內(nèi)生長(zhǎng)和出生體重[24-26]。印記基因在胎盤中的表達(dá)具有時(shí)間調(diào)控性，隨著妊娠過(guò)程的持續(xù)，其表達(dá)狀態(tài)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)改變，一旦表達(dá)失調(diào)就會(huì)導(dǎo)致胎盤發(fā)育缺陷。有研究表明，印記基因Sfmbt2缺失，會(huì)導(dǎo)致胎盤滋養(yǎng)層的發(fā)育嚴(yán)重缺失，繼而造成胚胎發(fā)育停止[24]。通過(guò)基因敲除的方法也已經(jīng)證實(shí)印記基因(Ascl2、Phlda2和Peg10等)在小鼠胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、分化及胎盤血管生成、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等方面的重要作用[24,27]。印記基因的“兩性斗爭(zhēng)假說(shuō)”認(rèn)為父源印記基因可促進(jìn)胎兒和胎盤的生長(zhǎng)，讓攜帶自身基因組的胎兒受益，而母源印記基因則傾向于限制性地向胎兒提供營(yíng)養(yǎng)，以孕育更多的子代[28]。相關(guān)研究也顯示，敲除參與胎盤發(fā)生的父源印記基因Igf2和Peg3后會(huì)導(dǎo)致胎盤體積縮小，胎兒出生體重降低，而敲除母源印記基因H9和Grb10可造成胎盤過(guò)度生長(zhǎng)、胎盤迷路層形態(tài)異常等現(xiàn)象[24-25，27]。說(shuō)明印記基因在胎盤發(fā)育過(guò)程中扮演著不可或缺的重要角色。

3 輔助生殖技術(shù)致印記基因紊亂是導(dǎo)致胎盤發(fā)育及功能異常的重要原因

胎盤印記基因的印記和表達(dá)極易受外界環(huán)境的干擾。ART作為一種醫(yī)源性環(huán)境應(yīng)激，卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)與受精、胚胎轉(zhuǎn)移、胚胎冷凍、體外高氧濃度培養(yǎng)環(huán)境等均可影響配子及植入前胚胎印記基因的印記表達(dá)[29]。在胚胎植入后，大量卵母細(xì)胞來(lái)源的DNA甲基化在胎兒組織中被擦除，而在胎盤組織中繼續(xù)保留，這些特殊的卵母細(xì)胞DNA甲基化位點(diǎn)被稱為 “胎盤特異性母源甲基化”[30]?？刂菩猿倥怕咽茿RT操作中的關(guān)鍵技術(shù)步驟之一，會(huì)造成體內(nèi)雌激素水平遠(yuǎn)超生理狀態(tài)。臨床樣本及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，促排卵的高雌激素水平會(huì)導(dǎo)致卵子中Snrpn、Peg3、Kcnqlot1等基因甲基化水平顯著降低，進(jìn)而導(dǎo)致胎盤母源基因甲基化水平降低，胎盤海綿滋養(yǎng)層與迷路滋養(yǎng)層的界限扭曲、胎盤效率顯著降低[31]。小鼠研究還發(fā)現(xiàn)，胚胎體外培養(yǎng)會(huì)增加胎盤組織中印記基因的隨機(jī)表觀遺傳錯(cuò)誤的頻率，玻璃化冷凍操作會(huì)導(dǎo)致受孕后胎盤組織印記基因H19表達(dá)紊亂[32-33]。利用小鼠模型對(duì)植入后胚胎進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，ART導(dǎo)致的印記紊亂選擇性地存在于胚胎外組織(胎盤和卵黃囊)，而胎兒組織并不存在印記紊亂[20, 32, 34]，說(shuō)明相對(duì)于胎兒組織，胎盤組織的印記基因更易受到ART操作的影響。本課題組前期研究也證實(shí)，ART不影響胎鼠組織中印記基因的表達(dá)水平，但會(huì)導(dǎo)致胎盤組織中印記基因H19、Snrpn、KvDMR1、Peg3、Kcnqlot1及Plagl1甲基化水平顯著降低以及重復(fù)序列缺失[20, 34]。印記基因的正確表達(dá)是保證胎盤正常發(fā)育的基本要素，ART操作會(huì)影響胎盤印記基因的印記狀態(tài)(DNA甲基化、組蛋白修飾及染色質(zhì)重塑)，引起印記基因表達(dá)紊亂，這可能是誘發(fā)胎盤發(fā)育及功能異常的重要原因，揭示ART致胎盤發(fā)育與功能異常的印記基因，并闡明其作用機(jī)制，是當(dāng)前輔助生殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

4 Akt信號(hào)通路過(guò)度激活可能是輔助生殖技術(shù)干擾胎盤生長(zhǎng)發(fā)育的重要途徑

Akt信號(hào)通路在細(xì)胞中廣泛存在，主要通過(guò)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成來(lái)調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化及凋亡等生理過(guò)程[35]。Akt信號(hào)通路作為控制細(xì)胞增殖的核心，與胎盤生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控具有不可忽視的聯(lián)系。有研究報(bào)道，ART操作會(huì)導(dǎo)致小鼠胎盤中Akt蛋白磷酸化水平顯著升高[21,36]。葡萄糖和氨基酸作為重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其缺乏會(huì)對(duì)胎盤和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重影響。研究發(fā)現(xiàn)，抑制胎盤Akt信號(hào)會(huì)顯著降低胎盤中葡萄糖和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)豐度及活性，導(dǎo)致新生兒出生體重顯著降低[37]。本課題組前期檢測(cè)小鼠妊娠末期胎盤脂質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，ART胎盤中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰膽堿、線粒體心磷脂水平均顯著升高；胎盤中Akt磷酸化水平和調(diào)節(jié)脂類生物合成的蛋白酶SREBP1含量也顯著升高[21]。提示ART可能通過(guò)激活A(yù)kt信號(hào)通路觸發(fā)下游的SREBP1激活，進(jìn)一步誘導(dǎo)脂質(zhì)生物合成相關(guān)酶類的表達(dá)，造成胎盤中脂質(zhì)異常積累。此外，研究報(bào)道Akt信號(hào)通路可參與糖類和脂質(zhì)的代謝調(diào)控，通過(guò)負(fù)調(diào)控GSK3β促進(jìn)糖原的合成和積累，并通過(guò)調(diào)控FoxO1促進(jìn)葡萄糖和脂質(zhì)的合成[35]。我們推測(cè)，ART助孕導(dǎo)致的胎盤中Akt信號(hào)通路過(guò)度激活，進(jìn)而誘使胎盤細(xì)胞異常增殖、糖原和脂質(zhì)異常積累，是干擾胎盤發(fā)育的重要途徑。

5 輔助生殖技術(shù)通過(guò)影響印記基因H19表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控胎盤生長(zhǎng)發(fā)育的可能機(jī)制

H19是最早被鑒定的調(diào)控胎盤生長(zhǎng)和胚胎早期生長(zhǎng)發(fā)育的母源印記基因，在胎盤中含量豐富，H19表達(dá)缺乏會(huì)導(dǎo)致胎盤各層組織異常增生，迷路層體積以及糖原細(xì)胞數(shù)目增加，胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)效率降低[20]。小鼠研究發(fā)現(xiàn)，妊娠中期ART胎盤中H19表達(dá)水平與自然妊娠胎盤相比顯著上調(diào)，胎盤重量降低；而妊娠末期ART胎盤中H19表達(dá)卻顯著下調(diào)，胎盤重量顯著增加，說(shuō)明H19在孕期胎盤中表達(dá)呈波動(dòng)性，ART可能通過(guò)干擾印記基因H19的表達(dá)來(lái)調(diào)控胎盤的生長(zhǎng)發(fā)育[34]。H19基因下游存在H19/Igf2共用的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，兩者存在表達(dá)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，當(dāng)H19表達(dá)受到抑制時(shí)，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子與Igf2啟動(dòng)子相互作用啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，Igf2表達(dá)上調(diào)[38]。Igf2作為一種多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，在細(xì)胞分化和增殖中具有重要的促進(jìn)作用[38]。本課題組前期利用小鼠模型發(fā)現(xiàn)，ART導(dǎo)致妊娠末期胎盤中H19表達(dá)下調(diào)，Igf2及其受體結(jié)合蛋白表達(dá)均上調(diào)，進(jìn)而激活了下游的Akt信號(hào)通路，造成胎盤過(guò)度生長(zhǎng)[36]。關(guān)于其調(diào)控機(jī)制有研究報(bào)道，ART可導(dǎo)致胎盤中甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmt3b的表達(dá)水平上調(diào)，使H19印記控制區(qū)發(fā)生過(guò)甲基化，引起H19表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而誘發(fā)下游相關(guān)調(diào)控反應(yīng)[20,36]。

6 輔助生殖技術(shù)通過(guò)影響印記基因Phlda2表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控胎盤生長(zhǎng)發(fā)育的可能機(jī)制

Phlda2也是母源印記基因，在調(diào)控胎盤發(fā)育和胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)等方面具有重要作用。對(duì)小鼠不同妊娠階段胎盤中Phlda2表達(dá)模式進(jìn)行系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，在妊娠中期，ART致小鼠胎盤重量顯著降低，Phlda2的表達(dá)水平顯著升高；但在妊娠末期，胎盤重量顯著增加，糖原異常積累，Phlda2的表達(dá)水平顯著降低，顯示Phlda2的表達(dá)水平與胎盤生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)[20, 34]。在人類臨床研究中發(fā)現(xiàn)，與自然妊娠相比，ART助孕胎盤中印記基因Phlda2 mRNA表達(dá)水平和蛋白水平均顯著降低，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT1和GLUT3表達(dá)水平卻顯著升高[39]。與野生型小鼠相比，Phlda2功能缺失型小鼠的胎盤重量和胎盤糖原量都顯著增加，胎鼠體重卻明顯降低，表明胎盤中過(guò)多的糖原積累都是以胎兒生長(zhǎng)為代價(jià)的[40]。那么ART是如何通過(guò)影響Phlda2表達(dá)而調(diào)控Akt信號(hào)通路的？已知Akt蛋白具有一個(gè)PH結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域是一個(gè)脂結(jié)合原件，可與細(xì)胞內(nèi)重要的脂質(zhì)信號(hào)分子3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)相結(jié)合而被激活[41]。而Phlda2蛋白同樣具有PH結(jié)構(gòu)域，可通過(guò)與PIP3結(jié)合固定在質(zhì)膜上[42]。研究表明，Phlda2可與Akt競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PIP3，Phlda2過(guò)表達(dá)會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制Akt信號(hào)通路的磷酸化激活；而Phlda2低表達(dá)會(huì)過(guò)度激活A(yù)kt信號(hào)通路[41]。因而，胎盤中Phlda2的表達(dá)變化可能是對(duì)ART操作產(chǎn)生的應(yīng)激響應(yīng)，低表達(dá)的Phlda2對(duì)Akt的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用下降，Akt信號(hào)通路過(guò)度激活，細(xì)胞增殖異常，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)度積累，最終造成胎盤形態(tài)和功能異常。

7 利用小分子藥物挽救輔助生殖技術(shù)胎盤功能，改善試管嬰兒妊娠結(jié)局

利用小分子藥物，干擾胎盤相關(guān)信號(hào)通路以挽救胎盤功能，進(jìn)而為妊娠過(guò)程中胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育提供良好的保障，是一種新型治療方法。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于宮內(nèi)生長(zhǎng)受限的胎兒可以通過(guò)添加香豆雌酚激活胎盤中Akt信號(hào)通路，提高胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)功能，改善胎兒發(fā)育狀況[43]。而孕婦肥胖會(huì)導(dǎo)致胎盤Akt信號(hào)通路過(guò)度激活，致使胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸能力增強(qiáng)，胎兒出現(xiàn)過(guò)度生長(zhǎng)[44]。在小鼠模型中，利用Akt信號(hào)通路抑制劑脂聯(lián)素可有效干預(yù)肥胖孕鼠胎盤的功能，恢復(fù)正常的胎盤胰島素信號(hào)和營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)，有效挽救胎兒過(guò)度生長(zhǎng)的表型[44]。小分子MK-2206和SC79是基礎(chǔ)研究中常用到的活體動(dòng)物Akt信號(hào)通路抑制劑和激活劑，其安全性和有效性已經(jīng)過(guò)大量研究的證實(shí)，可安全有效地抑制或者激活胎盤Akt信號(hào)通路[45-46]。因此，利用Akt抑制劑和激活劑干擾胎盤Akt信號(hào)通路，探索通過(guò)母體補(bǔ)充小分子藥物來(lái)逆轉(zhuǎn)ART胎盤功能異常，將會(huì)為臨床干預(yù)和防治ART導(dǎo)致的妊娠并發(fā)癥及胚胎源性疾病提供理論及實(shí)踐支持。

綜上所述，ART雖然解決了很多家庭不孕不育的難題，但是該技術(shù)仍存在諸多不足。ART操作導(dǎo)致胎盤的生長(zhǎng)發(fā)育與功能異常，為子代健康帶來(lái)極大的風(fēng)險(xiǎn)隱患。在動(dòng)物模型和人類中均已證實(shí)，胎盤中Akt蛋白的活性與胎盤的生長(zhǎng)呈正相關(guān)。ART胎盤中印記基因表達(dá)紊亂可能是過(guò)度激活A(yù)kt信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖、糖原和脂質(zhì)異常積累，胎盤過(guò)度生長(zhǎng)功能異常的重要原因。盡管有研究表明ART操作會(huì)影響印記基因的表達(dá)，但其具體表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制尚未明確，還需要更深入的探究。如果我們能夠找到明確的調(diào)控機(jī)制，用于改善ART對(duì)胎盤生長(zhǎng)發(fā)育的影響，保障試管嬰兒的健康，這才是探究ART安全性的最終目標(biāo)。