苗藥血人參中黃酮類化學(xué)成分研究

張云封，昝妮利，朱枝祥，王文萱，劉 莉，張仕林，宋月林，霍會霞，屠鵬飛，趙云芳*，李 軍*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代研究中心，北京 100029

2.貴州漢方藥業(yè)有限公司，貴州 貴陽 550081

血人參為豆科蝶形花亞科（Papilionoideae）木藍屬植物茸毛木藍Indigofera stachyodesLindl.的干燥根，主要分布于我國湖北、廣西、貴州、云南等地，其為貴州苗族常用藥，味甘、微苦，性溫，具有滋陰補虛、調(diào)經(jīng)攝血、活血舒筋等功效，主治崩漏、體虛久痢、腸風(fēng)下血、潰瘍不斂、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、疳積等癥[1]。文獻報道，血人參主要含有黃酮類和甾醇類等成分，具有抗炎、抗菌和抗氧化等藥理活性[2-4]。課題組前期發(fā)現(xiàn)，血人參乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位能夠抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)RAW 264.7 巨噬細胞釋放一氧化氮（NO），半數(shù)抑制濃度（IC50）值為58.9 μg/mL。為闡明其藥效物質(zhì)，本研究對血人參乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位進行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，共分離鑒定了24 個黃酮類成分，分別鑒定為芒柄花素（formononetin，1）、7-羥基-3′,4′-二甲氧基異黃酮（7-hydroxy-3′,4′-dimethoxy-isoflavone，2）、染料木素（genistein，3）、毛蕊異黃酮（calycosin，4）、大豆素（daidzein，5）、farnisin（6）、3′,4′,7-三羥基黃酮（3′,4′,7-trihydroxyflavone，7）、木犀草素（luteolin，8）、漆黃素（fisetin，9）、甘草素（liquiritigenin，10）、erycibenin D（11）、3,4′,7-三羥基二氫黃酮（3,4′,7-trihydroxyflavanone，12）、二氫山柰酚（dihydrokaempferol，13）、黃顏木素（fustin，14）、6,4′-二羥基-3′-甲氧基橙酮（6,4′-dihydroxy-3′-methoxyaurone，15）、硫黃菊素（sulfuretin，16）、(–)-3,4′,7-三羥基-3′-甲氧基黃烷[(–)-3,4′,7-trihydroxy-3′-methoxyflavan，17]、兒茶素（catechin，18）、表兒茶素（epicatechin，19）、(-)-epicatechin-3-O-p-hydroxybenzoate（20）、美迪紫檀素-3-O-β-D-葡萄糖苷（medicarpin-3-O-β-D-glucoside，21）、2′,4′-二甲氧基-3′-羥基異黃烷-6-O-β-D-葡萄糖苷（2′,4′-dimethoxy-3′-hydroxy-isoflavan-6-O-β-D-glucoside，22）、7-羥基色原酮（7-hydroxychromone，23）和5,7-二羥基色原酮（5,7-dihydroxychromone，24）。其中，化合物2、5～7、11～15、17、20～24 均為首次從木藍屬植物中分離得到，化合物1、10 和16為首次從血人參中分離得到?；衔?、7、8、10、15 和16 能夠抑制LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW 264.7 釋放NO，其IC50在7.3～27.3 μmol/L。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

高效液相-離子阱-飛行時間質(zhì)譜儀（日本島津公司）；Varian Inova-500 型核磁共振儀（美國Varian公司）；島津LC-20AT 半制備型高效液相（日本島津公司）；半制備HPLC 色譜柱（YMC-Pack ODS-A，250 mm×10 mm，5 μm；SPOLAR C18S5，250 mm×10 mm，5 μm）；硅膠GF254預(yù)制薄層色譜板（青島海洋化工廠）；柱色譜硅膠（200～300 目，青島海洋化工廠）；ODS（40～63 μm，德國Merck 公司）；SephadexTMLH-20（瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB 公司）；色譜甲醇和乙腈（美國Fisher 公司）；提取分離所用石油醚、正己烷、醋酸乙酯、二氯甲烷和甲醇均為天津市致遠化學(xué)試劑有限公司的分析純試劑；吲哚美辛和脂多糖（Sigma-Aldrich 公司）；NO 檢測試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

1.2 細胞株

小鼠巨噬細胞系RAW 264.7購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心。

1.3 藥材

血人參于2017年2月采自貴州省六枝特區(qū)，經(jīng)北京大學(xué)藥學(xué)院屠鵬飛教授鑒定為茸毛木藍I.stachyodesLindl.的干燥根。藥材標(biāo)本（ZY17020807）存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥現(xiàn)代研究中心。

2 方法

2.1 提取與分離

血人參藥材（20 kg）干燥、粉碎后，依次用95%、70%、50%乙醇回流提?。看稳軇?20 L，回流2 h），提取液減壓回收溶劑，得到總浸膏（3.2 kg）?？偨嘤?0%甲醇-水分散后，依次用正己烷、醋酸乙酯萃取，得到正己烷部位（20.2 g）、醋酸乙酯部位（945.4 g）和水部位（1628.0 g）。

醋酸乙酯部位（418.4 g）經(jīng)硅膠（200～300 目）柱色譜分離，正己烷-醋酸乙酯（1∶0→0∶1）梯度洗脫得到10 個流分（Fr.A～J）。Fr.B（8.57 g）經(jīng)硅膠柱色譜，正己烷-醋酸乙酯（1∶0→0∶1）梯度洗脫得到11 個流分（Fr.B1～B11）。Fr.B9 經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫得到9 個流分（Fr.B9a～B9i）。Fr.B9d 經(jīng)半制備液相[乙腈-水（35∶65）]分離純化得到化合物1（tR＝27.0 min，4.0 mg）；Fr.B9g 經(jīng)半制備液相[乙腈-水（25∶75）]分離純化得到化合物10（tR＝23.0 min，43.2 mg）；Fr.B9h 經(jīng)半制備液相[甲醇-水（65∶35）]分離純化得到化合物3（tR＝16.0 min，1.5 mg）。Fr.B10 經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫得到9 個流分（Fr.B10a～B10i）。Fr.B10d 經(jīng)半制備液相[乙腈-水（35∶65）]分離純化得到化合物2（tR＝20.0 min，2.5 mg）；Fr.B10g 經(jīng)半制備液相[乙腈-水（5∶95→55∶45）]分離得到化合物23（tR＝15.0 min，26.5 mg）和4 個流分（Fr.B10gb～B10ge），F(xiàn)r.B10gb 經(jīng)半制備液相[甲醇-水（35∶65）]分離純化得到化合物17（tR＝17.0 min，5.2 mg）和11（tR＝25.0 min，30.1 mg）；Fr.B10gc 經(jīng)半制備液相[乙腈-水（27∶73）]分離純化得到化合物4（tR＝23.0 min，2.9 mg）；Fr.B10gd經(jīng)半制備液相[乙腈-水（35∶65）]分離純化得到化合物15（tR＝17.0 min，7.3 mg）。Fr.C（1.85 g）經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫得到3 個流分（Fr.C1～C3）。Fr.C2（1.60 g）經(jīng)ODS 分離，甲醇-水（20∶80～100∶0）梯度洗脫，TLC 檢測，合并得8 個流分（Fr.C2a～C2h）。Fr.C2e經(jīng)半制備液相[乙腈-水（38∶62）]分離純化得到化合物6（tR＝10.0 min，2.8 mg）；Fr.C2e 再經(jīng)半制備液相[甲醇-水（66∶34）]分離純化得到化合物5（tR＝9.0 min，2.8 mg）；Fr.C2c 經(jīng)半制備液相[乙腈-水（22∶78）]分離純化得到化合物12（tR＝19.0 min，9.0 mg）、24（tR＝23.0 min，1.2 mg）和13（tR＝27.0 min，2.7 mg）。Fr.G（7.25 g）經(jīng)ODS 柱色譜，甲醇-水（10∶90→100∶0）梯度洗脫得到9 個流分（Fr.G1～G9）。Fr.G6 出現(xiàn)白色沉淀，經(jīng)純化后得到化合物21（14.7 mg），母液經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫得到5 個流分（Fr.G6a～G6e）。Fr.G6c 經(jīng)半制備液相[乙腈-水（42∶58）]分離純化得到化合物7（tR＝9.0 min，4.3 mg）和16（tR＝11.0 min，64.4 mg）；Fr.G6c 再經(jīng)半制備液相[甲醇-水（50∶50）]分離純化得到化合物8（tR＝31.0 min，1.4 mg）。Fr.G7（1.1 g）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，甲醇洗脫得到5 個流分（Fr.G7a～G7e），F(xiàn)r.G7c 經(jīng)半制備液相[甲醇-水（65∶35）]分離純化得到化合物22（tR＝25.0 min，1.2 mg）。Fr.G5（1.2 g）經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，甲醇-水（80∶20）洗脫得到6 個流分（Fr.G5a～G5f）。Fr.G5b 經(jīng)半制備液相[甲醇-水（33∶67）]分離純化得到化合物14（tR＝20.0 min，48.6 mg）。Fr.G5e 經(jīng)半制備液相[乙腈-水（30∶70）]分離純化得到化合物20（tR＝15.0 min，4.2 mg）；Fr.G5e 再經(jīng)半制備液相[乙腈-水（35∶65）]分離純化得到化合物9（tR＝11.0 min，4.8 mg）。Fr.G4（1.2 g）經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，甲醇洗脫得到5 個流分（Fr.G4a～G4e），F(xiàn)r.G4d經(jīng)半制備液相[甲醇-水（22∶78）]分離純化得到化合物18（tR＝20.0 min，67.4 mg）；Fr.G4d 再經(jīng)半制備液相[乙腈-水（27∶73）]分離純化得到化合物19（tR＝22.0 min，42.5 mg）。

2.2 細胞活力實驗和抗炎活性實驗[5]

取對數(shù)期生長的RAW 264.7細胞制備細胞數(shù)量為2×105個/mL 細胞懸浮液，加入96 孔板，每孔100 μL，于37 ℃在5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸出培養(yǎng)基，加入濃度為100 μmol/L 的待測化合物或陽性對照藥（吲哚美辛），孵育24 h 后棄去培養(yǎng)基，加入0.5 mg/mL MTT，37 ℃孵育4 h，棄去MTT，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上震蕩10 min，待結(jié)晶充分溶解后測定570 nm 吸光度（A），并計算化合物對RAW 264.7 細胞生長的抑制率。

細胞生長抑制率=(A空白－A給藥)/A空白

抗炎活性采用抑制NO 生成實驗，以LPS 誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞RAW 264.7 細胞為檢測模型，利用Griess 法測定細胞培養(yǎng)上清中NO 濃度。取對數(shù)期生長的RAW 264.7 細胞以2×105個/mL的濃度接種于96 孔板，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，將待測化合物用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的工作液，每個濃度設(shè)3 個復(fù)孔。作用于RAW 264.7 細胞1 h 后，加入終質(zhì)量濃度0.5 mg/mL 的LPS刺激RAW 264.7 細胞，37 ℃孵育4 h 后，采用Griess試劑盒測定細胞上清液中的NO 濃度。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末，ESI-MSm/z:267[M－H]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:3.82(3H,s,4′-OCH3),6.58(1H,brs,H-8),6.76(1H,dd,J=8.9,2.3 Hz,H-6),6.97(2H,d,J=8.9 Hz,H-3′,5′),7.45(2H,d,J=8.9 Hz,H-2′,6′),7.91(1H,d,J=8.9 Hz,H-5),8.03(1H,s,H-2)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:55.7(4′-OCH3),104.0(C-8),114.7(C-6,3′,5′),120.5(C-10),125.1(C-3),126.2(C-1′),127.5(C-5),131.4(C-2′,6′),154.0(C-2),159.0(C-9),160.9(C-4′),161.0(C-7),178.1(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[6]，故鑒定化合物1 為芒柄花素。

化合物2：淡黃色粉末，ESI-MSm/z:297[MH]-。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:3.78(6H,s,3′,4′-OCH3),6.87(1H,d,J=1.5 Hz,H-8),6.94(1H,dd,J=9.0,1.5 Hz,H-6),6.99(1H,d,J=8.3 Hz,H-5′),7.12(1H,dd,J=8.3,2.0 Hz,H-6′),7.19(1H,brs,H-2′),7.98(1H,d,J=8.8 Hz,H-5),8.36(1H,s,H-2),10.80(1H,s,7-OH)；13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:55.5(3′,4′-OCH3),102.1(C-8),111.5(C-5′),112.8(C-2′),115.2(C-6),116.6(C-10),121.2(C-6′),123.3(C-3),124.6(C-1′),127.3(C-5),148.3(C-3′),148.6(C-4′),153.3(C-2),157.4(C-9),162.6(C-7),174.6(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[7]，故鑒定化合物2 為7-羥基-3′,4′-二甲氧基異黃酮。

化合物3：灰白色粉末，ESI-MSm/z:269[MH]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.22(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.34(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.84(2H,d,J=8.1 Hz,H-3′,5′),7.37(2H,d,J=8.1 Hz,H-2′,6′),8.06(1H,s,H-2)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:94.8(C-8),100.1(C-6),106.3(C-10),116.2(C-3′,5′),123.3(C-3),124.7(C-1′),131.0(C-2′,6′),154.8(C-2),158.8(C-4′),159.7(C-9),163.9(C-5),166.0(C-7),182.3(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[8]，故鑒定化合物3 為染料木素。

化合物4：白色粉末，ESI-MSm/z:283[M－H]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:3.89(3H,s,4′-OCH3),6.84(1H,d,J=2.2 Hz,H-8),6.85(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),6.93(1H,dd,J=8.7,2.2 Hz,H-6),6.96(1H,dd,J=8.2,1.9 Hz,H-6′),7.16(1H,d,J=1.9 Hz,H-2′),8.05(1H,d,J=8.7 Hz,H-5),8.16(1H,s,H-2)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:56.4(4′-OCH3),103.3(C-8),114.0(C-5′),116.2(C-6),116.7(C-2′),118.0(C-10),122.9(C-6′),124.8(C-3),125.9(C-1′),128.5(C-5),147.8(C-3′),148.8(C-4′),154.8(C-2),159.8(C-9),165.1(C-7),178.1(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[9]，故鑒定化合物4 為毛蕊異黃酮。

化合物5：白色粉末，ESI-MSm/z:253[M－H]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.84(1H,d,J=2.4 Hz,H-8),6.85(2H,d,J=8.6 Hz,H-3′,5′),6.93(1H,dd,J=8.8,2.4 Hz,H-6),7.37(2H,d,J=8.6 Hz,H-2′,6′),8.05(1H,d,J=8.8 Hz,H-5),8.13(1H,s,H-2)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:103.2(C-8),116.2(C-3′,5′),116.6(C-6),118.1(C-10),124.3(C-3),125.9(C-1′),128.5(C-5),131.4(C-2′,6′),154.6(C-2),158.7(C-9),159.8(C-4′),164.9(C-7),178.2(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[10]，故鑒定化合物5 為大豆素。

化合物6：黃色粉末，ESI-MSm/z:283[M－H]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:3.98(3H,s,4′-OCH3),6.71(1H,s,H-3),6.93(1H,dd,J=8.8,2.2 Hz,H-6),6.95(1H,d,J=8.3 Hz,H-5′),6.99(1H,d,J=2.2 Hz,H-8),7.51(1H,d,J=2.1 Hz,H-2′),7.54(1H,dd,J=8.3,2.1 Hz,H-6′),7.97(1H,d,J=8.8 Hz,H-5)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:56.6(4′-OCH3),103.5(C-8),105.5(C-3),110.6(C-2′),116.3(C-6),116.8(C-5′),117.2(C-10),121.6(C-6′),124.0(C-1′),127.7(C-5),149.5(C-3′),151.9(C-4′),159.7(C-9),165.1(C-7),165.9(C-2),180.3(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[11]，故鑒定化合物6 為farnisin。

化合物7：黃色粉末，ESI-MSm/z:269[M－H]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.63(1H,s,H-3),6.91～6.97(3H,m,H-6,8,5′),7.39～7.42(2H,m,H-2′,6′),7.96(1H,d,J=8.6 Hz,H-5)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:103.4(C-8),105.1(C-3),114.1(C-2′),116.2(C-6),116.8(C-5′),117.2(C-10),120.2(C-6′),124.0(C-1′),127.7(C-5),147.0(C-3′),150.8(C-4′),159.6(C-9),164.9(C-7),166.0(C-2),180.3(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[12]，故鑒定化合物7 為3′,4′,7-三羥基黃酮。

化合物8：黃色粉末，ESI-MSm/z:285[M－H]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.21(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.44(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.55(1H,s,H-3),6.90(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),7.37～7.40(2H,m,H-2′,6′)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:95.0(C-8),100.1(C-6),103.8(C-3),105.3(C-10),114.1(C-2′),116.8(C-5′),120.3(C-1′),123.7(C-6′),147.1(C-3′),151.0(C-4′),159.4(C-9),163.2(C-5),166.1(C-2),166.3(C-7),183.9(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[12]，故鑒定化合物8 為木犀草素。

化合物9：黃色粉末，ESI-MSm/z:285[M－H]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.89(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.90(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.91(1H,dd,J=9.5,2.0 Hz,H-6),7.67(1H,dd,J=8.0,1.5 Hz,H-6′),7.77(1H,d,J=1.5 Hz,H-2′),7.98(1H,d,J=9.5 Hz,H-5)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:103.0(C-8),115.4(C-10),115.9(C-2′),116.0(C-6),116.2(C-5′),121.6(C-6′),124.4(C-1′),127.5(C-5),138.7(C-3),146.2(C-2),147.5(C-3′),148.6(C-4′),158.5(C-9),164.4(C-7),174.5(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[13]，故鑒定化合物9 為漆黃素。

化合物10：白色粉末，ESI-MSm/z:255[MH]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:2.64(1H,dd,J=16.9,2.9 Hz,H-3b),2.99(1H,dd,J=16.9,13.2 Hz,H-3a),5.30(1H,dd,J=13.2,2.9 Hz,H-2),6.33(1H,d,J=2.3 Hz,H-8),6.47(1H,dd,J=8.7,2.3 Hz,H-6),6.81(2H,d,J=8.6 Hz,H-3′,5′),7.28(2H,d,J=8.6 Hz,H-2′,6′),7.70(1H,d,J=8.7 Hz,H-5)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:44.8(C-3),80.9(C-2),103.8(C-8),111.8(C-6),114.8(C-10),116.3(C-3′,5′),129.0(C-2′,6′),129.8(C-5),131.2(C-1′),158.8(C-4′),165.5(C-9),166.8(C-7),193.5(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[14]，故鑒定化合物10為甘草素。

化合物11：黃色粉末，ESI-MSm/z:301[MH]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:3.87(3H,s,3′-OCH3),4.54(1H,d,J=11.9 Hz,H-3),4.98(1H,d,J=11.9 Hz,H-2),6.33(1H,d,J=2.2 Hz,H-8),6.52(1H,dd,J=8.7,2.2 Hz,H-6),6.84(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),6.98(1H,dd,J=8.2,1.9 Hz,H-6′),7.12(1H,d,J=1.9 Hz,H-2′),7.71(1H,d,J=8.7 Hz,H-5)；13CNMR(125 MHz,CD3OD)δ:56.4(3′-OCH3),74.5(C-3),85.6(C-2),103.7(C-8),112.1(C-6),112.4(C-2′),113.4(C-10),115.9(C-5′),122.2(C-6′),130.0(C-5),130.1(C-1′),148.2(C-4′),148.8(C-3′),165.0(C-9),166.9(C-7),194.4(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[15]，故鑒定化合物11 為erycibenin D。

化合物12：白色粉末，ESI-MSm/z:273[M＋H]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:4.52(1H,d,J=12.0 Hz,H-3),5.00(1H,d,J=12.0 Hz,H-2),6.33(1H,d,J=2.2 Hz,H-8),6.53(1H,dd,J=8.7,2.2 Hz,H-6),6.84(2H,d,J=8.2 Hz,H-3′,5′),7.37(2H,d,J=8.2 Hz,H-2′,6′),7.73(1H,d,J=8.7 Hz,H-5)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:74.5(C-3),85.5(C-2),103.7(C-8),112.1(C-6),113.4(C-10),116.1(C-3′,5′),129.5(C-1′),130.1(C-5),130.4(C-2′,6′),159.2(C-4′),165.1(C-9),166.8(C-7),194.5(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[16]，故鑒定化合物12為3,4′,7-三羥基二氫黃酮。

化合物13：黃色粉末，ESI-MSm/z:287[MH]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:4.55(1H,d,J=11.6 Hz,H-3),4.98(1H,d,J=11.6 Hz,H-2),5.88(1H,brs,H-6),5.93(1H,d,J=1.8 Hz,H-8),6.83(2H,d,J=8.2 Hz,H-3′,5′),7.35(2H,d,J=8.2 Hz,H-2′,6′)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:73.6(C-3),85.0(C-2),96.3(C-8),97.3(C-6),101.8(C-10),116.1(C-3′,5′),129.3(C-1′),130.4(C-2′,6′),159.2(C-4′),164.5(C-9),165.3(C-7),168.7(C-5),198.5(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[17]，故鑒定化合物13為二氫山柰酚。

化合物14：黃色粉末，ESI-MSm/z:287[MH]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:4.49(1H,d,J=11.5 Hz,H-3),4.93(1H,d,J=11.5 Hz,H-2),6.32(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.52(1H,dd,J=8.7,2.0 Hz,H-6),6.81(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),6.86(1H,dd,J=8.2,1.5 Hz,H-6′),7.00(1H,brs,H-2′),7.70(1H,d,J=8.7 Hz,H-5)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:74.5(C-3),85.5(C-2),103.6(C-8),112.1(C-6),113.3(C-10),115.8(C-2′),116.0(C-5′),120.9(C-6′),130.0(C-5),130.1(C-1′),146.1(C-4′),147.0(C-3′),165.0(C-9),166.7(C-7),194.5(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[18]，故鑒定化合物14 為黃顏木素。

化合物15：黃色粉末，ESI-MSm/z:283[MH]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:3.94(3H,s,3′-OCH3),6.70(1H,dd,J=8.4,2.0 Hz,H-5),6.71(1H,d,J=2.0 Hz,H-7),6.74(1H,s,H-10),6.88(1H,d,J=8.3 Hz,H-5′),7.42(1H,dd,J=8.3,1.5 Hz,H-6′),7.52(1H,d,J=1.5 Hz,H-2′),7.60(1H,d,J=8.4 Hz,H-4)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:56.4(3′-OCH3),99.4(C-7),114.1(C-9),114.5(C-5′),114.8(C-10),115.5(C-2′),116.7(C-5),125.5(C-1′),126.8(C-6′),127.4(C-4),147.8(C-2),149.2(C-3′),150.4(C-4′),168.3(C-8),169.8(C-6),184.4(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[19]，故鑒定化合物15為6,4′-二羥基-3′-甲氧基橙酮。

化合物16：橙色粉末，ESI-MSm/z:269[MH]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.65～6.69(3H,m,H-5,7,10),6.82(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-5′),7.20(1H,d,J=8.2 Hz,H-6′),7.50(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.57(1H,d,J=8.4 Hz,H-4)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:99.3(C-7),114.1(C-2′),114.7(C-9),114.8(C-10),116.6(C-5),118.9(C-5′),125.5(C-1′),126.4(C-6′),126.8(C-4),146.6(C-3′),147.6(C-2),149.3(C-4′),168.3(C-8),169.7(C-6),184.4(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[20]，故鑒定化合物16 為硫黃菊素。

化合物17：白色粉末，ESI-MSm/z:287[MH]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:2.72(1H,dd,J=15.6,5.5 Hz,H-4b),2.90(1H,dd,J=15.6,8.5 Hz,H-4a),3.84(3H,s,3′-OCH3),4.03(1H,m,H-3),4.66(1H,d,J=7.5 Hz,H-2),6.29(1H,d,J=2.4 Hz,H-8),6.35(1H,dd,J=8.2,2.4 Hz,H-6),6.80(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),6.85(1H,dd,J=8.2,2.0,Hz,H-6′),6.87(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),6.96(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:33.6(C-4),56.4(3′-OCH3),68.8(C-3),83.2(C-2),103.6(C-8),109.6(C-6),111.8(C-2′),112.7(C-10),116.0(C-5′),121.2(C-6′),131.3(C-1′),132.1(C-5),147.5(C-4′),148.9(C-3′),156.2(C-9),157.9(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[21]，故鑒定化合物17 為(–)-3,4′,7-三羥基-3′-甲氧基黃烷。

化合物18：白色粉末，ESI-MSm/z:289[MH]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:2.53(1H,dd,J=16.2,8.1 Hz,H-4b),2.86(1H,dd,J=16.2,5.4 Hz,H-4a),4.01(1H,m,H-3),4.59(1H,d,J=7.5 Hz,H-2),5.88(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),5.95(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.72(1H,dd,J=8.1,1.6 Hz,H-6′),6.78(1H,d,J=8.1 Hz,H-5′),6.85(1H,d,J=1.6 Hz,H-2′)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:28.3(C-4),68.6(C-3),82.6(C-2),95.4(C-8),96.2(C-6),100.7(C-10),115.1(C-2′),116.1(C-5′),120.0(C-6′),132.0(C-1′),146.0(C-3′),146.1(C-4′),156.7(C-9),157.4(C-7),157.6(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[22]，故鑒定化合物18 為兒茶素。

化合物19：白色粉末，ESI-MSm/z:289[MH]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:2.75(1H,dd,J=16.8,1.5 Hz,H-4b),2.87(1H,dd,J=16.8,4.3 Hz,H-4a),4.16(1H,m,H-3),4.80(1H,s,H-2),5.94(1H,d,J=1.5 Hz,H-6),5.97(1H,d,J=1.5 Hz,H-8),6.77(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),6.80(1H,dd,J=8.2,1.0 Hz,H-6′),6.99(1H,brs,H-2′)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:29.2(C-4),67.3(C-3),79.7(C-2),95.8(C-6),96.3(C-8),100.0(C-10),115.2(C-2′),115.9(C-5′),119.4(C-6′),132.1(C-1′),145.6(C-4′),145.7(C-3′),157.2(C-9),157.4(C-7),157.8(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[23]，故鑒定化合物19為表兒茶素。

化合物20：白色粉末，ESI-MSm/z:409[MH]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:2.87(1H,dd,J=17.4,2.6 Hz,H-4b),3.01(1H,dd,J=17.4,4.6 Hz,H-4a),5.05(1H,s,H-2),5.52(1H,m,H-3),5.96(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),5.98(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),6.68(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),6.75(2H,d,J=8.7 Hz,H-3?,5?),6.78(1H,dd,J=8.2,1.7 Hz,H-6′),6.95(1H,d,J=1.7 Hz,H-2′),7.74(2H,d,J=8.7 Hz,H-2?,6?)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:26.7(C-4),70.2(C-3),78.6(C-2),95.9(C-6),96.6(C-8),99.4(C-10),115.1(C-2′),116.0(C-5′),116.1(C-3?,5?),119.2(C-6′),122.3(C-1?),131.5(C-1′),132.9(C-2?,6?),146.0(C-3′,4′),157.9(C-5,7,9),163.4(C-4?),167.4(-COO-)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[24]，故鑒定化合物20 為(-)-epicatechin-3-O-phydroxybenzoate。

化合物21：白色粉末，ESI-MSm/z:477[M＋HCOO]–。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:3.12～3.32(4H,m,H-2′～5′),3.44(1H,m,H-6′α),3.64-3.66(3H,m,H-6β,6a,6′β),3.69(3H,s,9-OCH3),4.28(1H,m,H-6α),4.84(1H,d,J=7.5 Hz,H-1′),5.60(1H,d,J=6.5 Hz,H-11a),6.42(1H,d,J=2.2 Hz,H-4),6.46(1H,dd,J=8.2,2.6 Hz,H-8),6.55(1H,d,J=2.6 Hz,H-10),6.71(1H,dd,J=8.5,2.2 Hz,H-2),7.25(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.39(1H,d,J=8.5 Hz,H-1)；13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:38.9(C-6a),55.3(9-OCH3),60.7(C-6′),66.0(C-6),69.7(C-4′),73.2(C-2′),76.5(C-3′),77.1(C-5′),77.8(C-11a),96.4(C-4),100.3(C-1′),104.0(C-10),106.1(C-8),110.4(C-2),114.2(C-11b),119.2(C-6b),125.3(C-7),132.0(C-1),156.2(C-4a),158.5(C-10a),160.3(C-9),160.6(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[25]，故鑒定化合物21 為美迪紫檀素-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物22：白色粉末，ESI-MSm/z:463[MH]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:2.86(1H,dd,J=15.6,4.4 Hz,H-4b),2.97(1H,dd,J=15.6,10.8 Hz,H-4a),3.73(3H,s,2′-OCH3),3.76(1H,d,J=4.5 Hz,H-3),3.82(3H,s,4′-OCH3),4.01(1H,t,J=10.0 Hz,H-2b),4.27(1H,m,H-2a),4.65(1H,d,J=7.5 Hz,H-1′′),6.34(1H,d,J=2.5 Hz,H-5),6.44(1H,dd,J=8.5,2.5 Hz,H-7),6.52(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),6.87(1H,d,J=8.5 Hz,H-6′),6.96(1H,d,J=8.5 Hz,H-8)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:31.3(C-4),33.4(C-3),55.6(4′-OCH3),56.6(2′-OCH3),62.0(C-6′′),70.8(C-2),70.9(C-4′′),75.3(C-2′′),77.7(C-5′′),78.3(C-3′′),102.3(C-1′′),104.5(C-5′),107.2(C-5),107.9(C-7),115.7(C-10),122.8(C-1′),124.2(C-6′),131.2(C-8),135.3(C-3′),150.0(C-2′),152.8(C-4′),156.5(C-9),160.5(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[26]，故鑒定化合物22 為2′,4′-二甲氧基-3′-羥基異黃烷-6-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物23：黃色粉末，ESI-MSm/z:161[MH]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.18(1H,d,J=6.0 Hz,H-3),6.75(1H,d,J=2.3 Hz,H-8),6.85(1H,dd,J=8.9,2.3 Hz,H-6),7.89(1H,d,J=8.9 Hz,H-5),7.96(1H,d,J=6.0 Hz,H-2)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:103.5(C-8),112.7(C-3),116.6(C-6),118.2(C-10),127.9(C-5),157.7(C-2),160.1(C-9),165.2(C-7),179.5(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[27]，故鑒定化合物23 為7-羥基色原酮。

化合物24：灰白色粉末，ESI-MSm/z:177[MH]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.19(1H,d,J=5.9 Hz,H-3),6.21(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.34(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),7.97(1H,d,J=5.9 Hz,H-2)；13CNMR(125 MHz,CD3OD)δ:95.1(C-8),100.2(C-6),106.6(C-10),111.6(C-3),158.1(C-2),159.9(C-9),163.5(C-5),166.2(C-7),183.4(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[28]，故鑒定化合物24 為5,7-二羥基色原酮。

3.2 體外抗炎活性結(jié)果

利用LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 巨噬細胞活化模型，對分離得到的24 個化合物進行了體外抗炎活性篩選，使用Griess 法測定NO 的含量，并計算IC50。結(jié)果顯示化合物3、7、8、10、15、16 能夠抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7 巨噬細胞釋放NO，其IC50值分別為（27.3±0.1）、（18.1±0.3）、（9.5±2.3）、（22.1±3.6）、（22.8±2.3）、（7.3±1.6）μmol/L[陽性對照藥吲哚美辛IC50值（41.2±1.4）μmol/L]。這些結(jié)果表明，血人參治療炎癥性疾病可能與其中所含黃酮類化合物有關(guān)，其抗炎作用機制有待進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突