基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究黃芪桂枝五物湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

蔡鑫 唐芳 馬武開 蘭維婭 蔣總 樊梅 金澤旭

【摘 要】目的：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討黃芪桂枝五物湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的分子作用機(jī)制。方法：利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索、篩選出黃芪桂枝五物湯中藥活性成分和作用靶點(diǎn)，使用GeneCards預(yù)測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)，構(gòu)建中藥活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，將獲得的靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，對靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。結(jié)果：共篩選出黃芪桂枝五物湯中藥活性成分74種，作用于217個靶點(diǎn)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)4329個，從而獲得藥物和疾病的共同靶點(diǎn)146個。GO分析涉及對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、脂筏、膜微區(qū)、核受體活性，及類固醇激素受體活性等方面。KEGG主要富集在PI3K-Akt信號通路、AGE-RAGE信號通路、腫瘤壞死因子信號通路，及白細(xì)胞介素-17信號通路等。結(jié)論：黃芪桂枝五物湯通過多成分、多靶點(diǎn)及多途徑的方式治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕;黃芪桂枝五物湯;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);信號通路;作用機(jī)制

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性進(jìn)行性自身免疫性疾病，臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜炎癥及關(guān)節(jié)外病變，由于其具有較高的致殘率，給社會和患者家庭帶來嚴(yán)重影響[1]。RA發(fā)病率為0.5%～1%，在不同人群中存在差異，男性發(fā)病率低于女性[2]。目前，RA主要治療方式為免疫抑制劑、激素、非甾體抗炎藥和分子靶向治療等，但存在不良反應(yīng)多、價格昂貴等不足[3]。RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，運(yùn)用中醫(yī)藥治療痹證具有悠久的歷史，臨床療效確切且不良反應(yīng)小，有助于改善RA患者相關(guān)臨床癥狀和提升生活質(zhì)量[4]。黃芪桂枝五物湯首載于《金匱要略·血痹虛勞脈證并治篇》，由黃芪、桂枝、白芍、生姜、大棗組成，是治療痹證的常用方劑[5]。臨床應(yīng)用黃芪桂枝五物湯治療RA療效較好，但缺乏對相關(guān)作用機(jī)制的研究，不能從細(xì)胞和分子層面系統(tǒng)揭示其治療RA的分子途徑[6-8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有綜合性研究特點(diǎn)，將網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)、藥理學(xué)及生物信息學(xué)等多學(xué)科相互聯(lián)系，能夠較為系統(tǒng)地闡述中藥活性成分和作用機(jī)制，體現(xiàn)中藥組方多成分-多靶點(diǎn)的作用關(guān)系，與中醫(yī)學(xué)整體觀念及辨證論治理論體系有著高度相似性[9]。因此，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，探討黃芪桂枝五物湯治療RA的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在的作用機(jī)制，為今后實(shí)驗(yàn)研究提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 黃芪桂枝五物湯活性成分及靶點(diǎn)篩選 借助TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）搜集黃芪桂枝五物湯中黃芪、桂枝、白芍、生姜、大棗的活性成分，同時以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件進(jìn)行篩選，獲得符合條件的中藥活性成分和相應(yīng)靶點(diǎn)，并使用UniProt在線數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）對靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 RA相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測 以“rheumatoid arthritis”為檢索關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中收集RA的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建“中藥活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖 將中藥活性成分的作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得交集靶點(diǎn)即為黃芪桂枝五物湯治療RA的潛在靶點(diǎn)。構(gòu)建藥物活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，使用軟件Cytoscape 3.7.1中的“Network Analyzer”程序?qū)υ摼W(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，節(jié)點(diǎn)（Node）表示黃芪桂枝五物湯所含有的藥物活性成分和潛在治療靶點(diǎn)，邊（Edge）代表活性成分和相應(yīng)作用靶點(diǎn)的聯(lián)系。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將藥物活性成分-疾病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺（https：//string-db.org/）進(jìn)行PPI分析，選擇研究對象物種為“人”（Homo sapiens），獲得黃芪桂枝五物湯作用于RA的PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。利用Cytoscape 3.7.1軟件的“Network Analyzer”程序?qū)W(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，根據(jù)度值（Degree）和介數(shù)中心性（Betweenness Centrality）篩選出關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

1.5 基因本體功能（GO）與京都基因與基因組百科全書通路（KEGG）富集分析 將藥物活性成分-疾病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)分析平臺，將閾值設(shè)定為P < 0.05，選擇物種為“Homo sapiens”，并將靶點(diǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)化為官方名稱（official gene symbol），進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪桂枝五物湯活性成分篩選 使用TCMSP數(shù)據(jù)庫分別對黃芪桂枝五物湯中5味中藥的活性成分進(jìn)行收集，設(shè)定過濾條件為OB≥30%，DL≥0.18。共獲得74個活性成分，其中黃芪20個、桂枝7個、白芍13個、生姜5個、大棗29個，根據(jù)OB值進(jìn)行排序，列出OB值前20的中藥活性成分。見表1。

2.2 黃芪桂枝五物湯治療RA相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中預(yù)測獲得藥物活性成分靶點(diǎn)217個，從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得RA疾病靶點(diǎn)4329個。將藥物活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)繪制韋恩圖取交集，得到146個相同靶點(diǎn)，即為黃芪桂枝五物湯治療RA的潛在靶點(diǎn)。見圖1。

2.3 藥物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用軟件Cytoscape3.7.1構(gòu)建中藥活性成分-靶基因相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，包括179個節(jié)點(diǎn)（黃芪桂枝五物湯活性成分節(jié)點(diǎn)33個，靶基因節(jié)點(diǎn)146個）和247條邊。主要活性成分有芒柄花黃素（formononetin）、異鼠李素（isorhamnetin）、毛蕊異黃酮（calycosin）、花旗松素（taxifolin）、小檗堿（berberine）、香豆雌酚（coumestrol）、兒茶素（catechin）、芍藥苷（paeoniflorin）等，這些可能是黃芪桂枝五物湯治療RA的關(guān)鍵活性成分。見圖2。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)基因篩選 為進(jìn)一步探討黃芪桂枝五物湯治療RA的分子機(jī)制，利用STRING數(shù)據(jù)庫對146個藥物和疾病的共同靶基因進(jìn)行PPI分析，利用Cytoscape 3.7.1軟件中“Network Analyzer”程序?qū)⑺媒Y(jié)果進(jìn)行可視化分析。PPI網(wǎng)絡(luò)中共144個靶點(diǎn)基因相互作用（有2個靶基因未參與蛋白互作），2659條邊表示各靶點(diǎn)蛋白間相互作用關(guān)系。根據(jù)Degree和Betweenness Centrality進(jìn)行排序，Degree越大說明該靶基因與其他蛋白相互作用頻次更多（圖中節(jié)點(diǎn)大小代表Degree值的大小），Betweenness Centrality越高則該靶點(diǎn)基因越重要。篩選出的關(guān)鍵基因主要包括AKT1、白細(xì)胞介素（IL）-6、白蛋白（ALB）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、JUN、表皮生長因子（EGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）-9、表皮生長因子受體（EGFR）、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（PTGS2）、絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、MMP-2、IL-1β等，這些靶點(diǎn)基因可能是黃芪桂枝五物湯治療RA的關(guān)鍵靶點(diǎn)。見圖3。

2.5 GO和KEGG富集分析結(jié)果 將146個藥物活性成分-疾病交集靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)平臺進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO分析結(jié)果顯示，生物過程（BP）主要涉及對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)（response to molecule of bacterial origin）、對金屬離子的響應(yīng)（response to metal ion）、對抗生素的反應(yīng)（response to antibiotic）、對活性氧的反應(yīng)（response to reactive oxygen species）、細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)（cellular response to oxidative stress），及對氧含量的反應(yīng)（response to oxygen levels）等;細(xì)胞組分（CC）主要與脂筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、突觸前膜的組成成分（integral component of presynaptic membrane），及轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物（transcription factor complex）等相關(guān);分子功能（MF）主要包括核受體活性（nuclear receptor activity）、類固醇激素受體（steroid hormone receptor activity）、兒茶酚胺結(jié)合（catecholamine binding）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding），及RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（RNA polymerase Ⅱ transcription factor binding）。見圖4。KEGG通路富集分析主要包含PI3K-Akt信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、AGE-RAGE信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、IL-17信號通路，及Toll樣受體信號通路等。見圖5。

3 討 論

中藥復(fù)方或單味中藥是具有多成分、多靶點(diǎn)以及多層次特點(diǎn)的復(fù)雜體系，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法有助于對其進(jìn)一步探索。陳慧等[10]應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，四妙丸可能通過調(diào)節(jié)TNF信號通路治療RA。GUO等[11]對烏頭湯治療RA的可能機(jī)制進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討。本研究篩選獲得黃芪桂枝五物湯治療RA的潛在藥物活性成分主要包括芒柄花黃素、異鼠李素、毛蕊異黃酮、花旗松素、小檗堿、香豆雌酚、兒茶素、芍藥苷等。芒柄花黃素具有增強(qiáng)免疫應(yīng)答功能的作用[12]，能抑制VEGF和MMPs的表達(dá)[13]，而RA滑膜過度生長所釋放的MMPs是引起骨質(zhì)破壞的重要因素。異鼠李素能夠有效抑制腎癌模型小鼠腫瘤細(xì)胞生長[14]，使用脂多糖（LPS）刺激人白血病單核細(xì)胞株（THP-1）誘導(dǎo)其釋放TNF-α、IL-6等炎癥因子，經(jīng)異鼠李素干預(yù)后炎癥因子表達(dá)明顯受抑制，并且呈濃度依賴性，表明具有一定的抗炎作用[15]。辛敏等[16]使用不同濃度毛蕊異黃酮干預(yù)膀胱癌T24、T739細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其通過拮抗PI3K-Akt信號通路，增加促凋亡基因B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）相關(guān)X蛋白（Bax）表達(dá)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡?；ㄆ焖伤啬茱@著抑制體外培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞A549增殖，可能與下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)相關(guān)[17]。MMP-2和MMP-9與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移能力關(guān)系密切。小檗堿能夠下調(diào)膀胱癌細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)，降低腫瘤侵襲能力，相關(guān)機(jī)制可能是抑制了PI3K-Akt信號通路傳導(dǎo)[18]。在對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)小檗堿可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬發(fā)揮抗腫瘤功效[19]。香豆雌酚對體外培養(yǎng)的膝骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用，有效降低了MMP-1和MMP-3的表達(dá)，減少軟骨基質(zhì)降解[20]，具有抗分解和抗氧化作用，能抑制骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠軟骨細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)[21]。兒茶素能夠有效抑制胃癌細(xì)胞的遷徙和遷移[22]。芍藥苷可顯著抑制RA動物模型大鼠滑膜成纖維細(xì)胞（FLS）增殖，延緩大鼠病理進(jìn)展[23]。將芍藥苷灌胃干預(yù)LPS誘導(dǎo)的急性腦損傷小鼠模型，發(fā)現(xiàn)HO-1蛋白水平上調(diào)，可能通過清除氧自由基、增加抗氧化能力發(fā)揮作用[24]。

黃芪桂枝五物湯治療RA的潛在靶點(diǎn)共146個，經(jīng)過PPI分析篩選獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)基因主要有AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、MMP-9、PTGS2等。AKT1作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K-Akt信號通路的重要調(diào)節(jié)因子，能夠抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，在惡性腫瘤病程轉(zhuǎn)歸中具有重要意義，通過磷酸化Caspase-9前體產(chǎn)生抗凋亡效應(yīng)[25]。IL-6與RA患者疾病活動程度有密切聯(lián)系，能夠促進(jìn)FLS中MMP-1、MMP-9等的表達(dá)，是導(dǎo)致RA骨質(zhì)破壞的主要炎性因子[26]。RA主要病理改變表現(xiàn)為血管翳形成，VEGFA是這一病理過程的重要促進(jìn)因素，VEGF通過參與炎癥反應(yīng)和提升血管新生能力，不但加速動脈粥樣硬化，同時亦是RA患者合并心血管相關(guān)疾病的重要原因[27]。PTGS2參與滑膜炎癥反應(yīng)過程，與免疫反應(yīng)、凋亡過程等相關(guān)，可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞增殖及分化[28]。

GO富集分析顯示，黃芪桂枝五物湯治療RA主要與對脂多糖的反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)、細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、核受體活性，及類固醇激素受體等相關(guān)。脂多糖能夠刺激體內(nèi)免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌炎性細(xì)胞因子，促使RA-FLS增殖和MMP-9表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致RA關(guān)節(jié)軟骨受損[29]。氧化應(yīng)激反應(yīng)會引起炎性細(xì)胞因子浸潤，增加活性氧以及活性氧簇自由基表達(dá)，進(jìn)一步破壞透明質(zhì)酸，降解關(guān)節(jié)軟骨[30]。KEGG富集結(jié)果顯示，主要涉及PI3K-Akt信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、TNF信號通路、IL-17信號通路，及Toll樣受體信號通路等。PI3K-Akt信號通路在滑膜組織中廣泛表達(dá)，在促進(jìn)RA-FLS增殖、分化，抑制其凋亡的生物學(xué)過程中起關(guān)鍵作用。但該信號通路激活時能夠上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax水平，進(jìn)一步加重了RA發(fā)展[31]。本研究篩選獲得的關(guān)鍵活性化合物如芒柄花黃素、毛蕊異黃酮及小檗堿等，均能夠通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt通路發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞增殖和促凋亡效應(yīng)。TNF信號通路及IL-17信號通路介導(dǎo)RA炎癥反應(yīng)，增加RA-FLS致炎因子表達(dá)[32]。Toll樣蛋白是免疫系統(tǒng)重要組成要素，研究發(fā)現(xiàn)，其在病情活動期RA患者的外周血單核細(xì)胞中明顯增加，與炎癥因子相關(guān)[33]。綜上所述，黃芪桂枝五物湯可能通過調(diào)節(jié)多條信號通路，影響細(xì)胞增殖與凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷等病理過程，發(fā)揮治療RA的作用。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了黃芪桂枝五物湯治療RA的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)和分子作用機(jī)制，結(jié)果顯示，黃芪桂枝五物湯具有多種活性成分，通過多靶點(diǎn)、多途徑的作用方式治療RA，初步闡述了相關(guān)的分子途徑，為今后的研究提供了部分理論支持。所篩選出的活性成分涉及抗炎、抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡等，其中可能主要通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路發(fā)揮治療RA的作用。RA的發(fā)生、發(fā)展與自身免疫系統(tǒng)失衡密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪桂枝五物湯活性成分雖與調(diào)節(jié)免疫方面關(guān)聯(lián)較少，但大部分活性成分均可通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路來抑制腫瘤細(xì)胞增殖與促進(jìn)凋亡，而該通路在RA中扮演重要角色，因此黃芪桂枝五物湯對于控制RA滑膜細(xì)胞類腫瘤樣增殖取得積極作用。但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測具有一定局限性，研究所得相關(guān)活性成分、靶點(diǎn)基因及信號通路等需要后期的實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。

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收稿日期：2020-09-25;修回日期：2020-10-18