小麥幼苗根系相關(guān)性狀QTL定位與分析

劉洋，王克森，劉秀坤，王利彬，王燦國，郭軍，程敦公，穆平，劉建軍，李豪圣，趙振東，曹新有，張玉梅

（1.青島農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山東 青島 266109；2.山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所/小麥玉米國家工程實驗室/農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，山東 濟南 250100）

小麥種植范圍遍布全球，提供了全球約40%人口的糧食需求［1］。近年來由于全球氣候的改變，小麥產(chǎn)量較難滿足人民的需求，因此，提高小麥產(chǎn)量是解決糧食危機的重要途徑之一［2］。小麥產(chǎn)量受許多因素影響，其中根系從土壤中吸收其生長所需營養(yǎng)成分，對產(chǎn)量的影響尤為重要［3］。根系優(yōu)先吸收距離較近的養(yǎng)分，其形態(tài)特征、次生根的數(shù)量、根群的活力與分布均影響根系對養(yǎng)分的吸收、傳送［4-6］。

近年來，對小麥根系相關(guān)性狀定位的研究越來越多，白彩虹［7］以Avalon×Cadenza構(gòu)建的DH群體為材料，定位到9個與根長相關(guān)的QTLs，分別位于3A、3B、4D、5B、6A染色體上，可解釋6.03%～16.03%的表型變異，同時發(fā)現(xiàn)控制多個性狀的QTL位于同一區(qū)間。劉秀林等［8］利用構(gòu)建的小麥DH群體在4A染色體上定位到1個控制最大根長的QTL，在3B染色體上定位到1個控制總根長和1個控制根直徑的QTL，在2D染色體上定位到1個控制根直徑的QTL。張瑤堯［9］利用F2∶3群體定位到了38個與根系相關(guān)的QTLs，分別位于1A、2A、2D、3A、3B、3D、4A、5B、5D、6B、6D、7A、7B和7D染色體上。李卓坤［10］利用構(gòu)建的DH群體，檢測到1個與根表面積相關(guān)的QTL，1個與根體積相關(guān)的QTL，1個控制根長的QTL。周曉果等［11］以構(gòu)建的DH群體為材料，檢測到3個與根數(shù)相關(guān)的QTLs，3個與最大根長相關(guān)的QTLs。在根系的各項形態(tài)指標中，根長是根系研究中重要的特征參數(shù)［12］，根長增加，根系的表面積隨之增大，可以促進根系對有機物營養(yǎng)元素的吸收［13］。目前關(guān)于小麥總根長和最大根長的定位結(jié)果見表1。但根系生長在地下，想要對其檢測，相對于其他性狀而言較難，且受環(huán)境影響很大，具有較大的遺傳變異性［14］。

為了進一步挖掘影響小麥根系形態(tài)的基因，本研究以菏麥13與臨麥2號為親本構(gòu)建的F8代重組自交系（RIL）群體為材料，擬通過SNP芯片分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，定位根系相關(guān)的QTLs，以期為小麥根系性狀研究提供理論支撐。

表1 已定位到的小麥根長性狀QTL位點

表1（續(xù)）

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以菏麥13為母本、臨麥2號為父本進行雜交，通過單粒傳法得到包含200個株系的F8代RIL群體。其中，菏麥13是菏澤市農(nóng)業(yè)科學院以沛304-1×魯麥4號組合培育而成的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病、弱冬性小麥，適合種植于黃淮冬麥區(qū)，于2000年4月通過山東省審定［30］；臨麥2號是由臨沂市農(nóng)業(yè)科學院以魯麥23號×臨90-15選育出的優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)產(chǎn)、抗逆、半冬性小麥，抗旱性1級，于2004年8月通過山東省審定［31］。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥幼苗根系的培養(yǎng) 試驗材料的準備：收獲后，從每株系中挑選15粒飽滿、形態(tài)相似的種子，用10%的H2O2處理15～20 min，純凈水沖洗5次，保證處理時間相同。

具體試驗步驟如下：

（1）準備一次性培養(yǎng)皿，鋪上兩層濾紙，適當距離擺放種子，置于暗處36 h；

（2）每個材料挑選9粒萌發(fā)形態(tài)較為一致的種子擺放在有紗網(wǎng)的培養(yǎng)盤中，每盤種60個材料，室外用純凈水培養(yǎng)一周后，將培養(yǎng)盤移到室內(nèi)再培養(yǎng)5 d（幼苗長到一心一葉），期間換1次純凈水；

（3）培養(yǎng)液配制：配制Hoagland營養(yǎng)液母液，量取15 mL母液逐步加入去離子水中，配制成15 L培養(yǎng)液，將pH值調(diào)到6.2；

（4）幼苗移栽：每個材料選取3株長勢一致的幼苗，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)盒中用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，每盒種202個材料，3次重復，室溫培養(yǎng)9 d，每4 d換一次培養(yǎng)液；

（5）試驗材料保存：待幼苗長到四葉一心期，剪下根放入自封袋，-20℃冰箱保存。

1.2.2 小麥幼苗根系性狀測定 利用EPSON公司的EU-88型根系掃描儀掃描RIL群體幼苗根系形態(tài)，通過WinRHIZO軟件分析總根長、根體積、根表面積、根平均直徑、根尖數(shù)等性狀表型值，取三次重復平均值進行分析。

1.2.3 RIL群體全基因組SNP芯片分析 利用北京中玉金標記公司研發(fā)的15k育種芯片對RIL群體200個株系及其親本的基因組進行高通量基因分型，并對樣品及分析結(jié)果進行質(zhì)控：（1）計算樣品的DQC（Dish QC）和CR（call rate）值，判斷樣品數(shù)據(jù)是否適合進行后續(xù)基因分型分析；（2）SNP位點質(zhì)控，標記質(zhì)量分類，選擇群體最優(yōu)標記分型類型；（3）基因分型分析，根據(jù)Affymetrix（Thermo Fisher）的篩選標準［32］過濾標記，篩選后得到8 558個多態(tài)性位點用于遺傳圖譜構(gòu)建。

1.2.4 遺傳圖譜構(gòu)建 以菏麥13和臨麥2號為親本構(gòu)建的RIL群體為作圖群體，對8 558個多態(tài)性位點進行篩選：舍去雜合率高的標記（＞10%）和缺失率高的標記（＞10%）；應用Tassel v5.0過濾偏分離標記（0.3∶0.7）。

通過QTL IciMapping v4.2對標記初步分組。應用QTL IciMapping v4.2 Bin功能整合同一位點的所有共分離標記，僅保留一個用于后續(xù)做圖；QTL IciMapping v4.2 Map過程識別基因型數(shù)據(jù)，根據(jù)連鎖關(guān)系將標記分到小麥21條染色體上。

應用Join Map v4構(gòu)建全基因組遺傳連鎖圖譜。對QTL IciMapping初步分組結(jié)果進行檢驗，Regression mapping過程確定標記位置并計算遺傳距離。

1.2.5 QTL定位方法 利用Windows QTL Cartographer 2.5軟件復合區(qū)間作圖法（CIM）進行QTL分析，置換檢測（permutation test）參數(shù)設置為P=0.05水平下1 000次重復排列。QTL命名方法［33］按照q+目標性狀+染色體+QTL個數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳圖譜構(gòu)建

本研究利用篩選得到的8 558個多態(tài)性位點進行遺傳圖譜構(gòu)建，所得遺傳連鎖圖譜包含1 003個SNP標記，覆蓋21條染色體，全長2 358.54 cM，標記間平均間距2.35 cM（表2）。

表2 遺傳圖譜標記分布及密度

2.2 小麥幼苗根系性狀表型分析

根系掃描儀掃描分析RIL群體及其親本的根系形態(tài)，利用SPSS 23.0軟件進行基本統(tǒng)計和相關(guān)性分析。結(jié)果（表3）顯示，親本菏麥13的總根長、根體積、根表面積均小于親本臨麥2號；根平均直徑和根尖數(shù)均大于臨麥2號。從分離群體的分布（圖1）可以看出，RIL群體幼苗根系性狀均表現(xiàn)為雙向超親分離，樣本分布呈正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，符合多個基因控制的數(shù)量遺傳性狀特征，可以進行QTL定位。

表3 RIL群體及其親本幼苗根系性狀的表型分析

2.3 根系各性狀間相關(guān)性分析

分析結(jié)果（表4）表明，根表面積與總根長、根體積、根尖數(shù)呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.570～0.830；總根長與根體積、根尖數(shù)呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.600～0.676，與平均直徑呈顯著負相關(guān)（P＜0.01）；根體積與根尖數(shù)、根平均直徑呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.152～0.521；根尖數(shù)與根平均直徑呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.163。

表4 根系各性狀間相關(guān)性分析

2.4 小麥幼苗根系QTL定位分析

共檢測到13個QTLs，分布于小麥的1D、3A、3B、4B、5A、5B、6B和7B染色體上（表5和圖2），可解釋5.11%～20.12%的表型變異。

圖1 RIL群體幼苗根系性狀的樣本分布

檢測到5個與根表面積相關(guān)的QTLs，分布于1D、3A、3B、4B、5B。1D染色體上的qRSA-1D可解釋19.32%的表型變異，LOD值為4.83，加性效應為-11.91；3A染色體上的qRSA-3A可解釋20.12%的表型變異，LOD值為6.70，加性效應為-11.48；3B染色體上的qRSA-3B可解釋9.89%的表型變異，LOD值為4.47，加性效應為2.03；4B染色體上的qRSA-4B可解釋20.00%的表型變異，LOD值為6.57，加性效應為-11.70；5B染色體上的qRSA-5B可解釋16.37%的表型變異，LOD值為5.68，加性效應為12.82。

檢測到3個與總根長相關(guān)的QTLs，分布于3B、6B、7B。3B染色體上的qRL-3B可解釋6.50%的表型變異；位于6B染色體上的qRL-6B可解釋11.56%的表型變異，LOD值為-10.01；位于7B染色體上的qRL-7B可解釋5.11%的表型變異，LOD值為2.42。

檢測到4個與根體積相關(guān)的QTLs，分布于1D、3B、4B、5B。1D染色體上的qRV-1D可解釋18.31%的表型變異，LOD值為3.38；位于3B染色體上的qRV-3B可解釋8.66%的表型變異，LOD值為3.85；位于4B染色體上的qRV-4B可解釋11.58%的表型變異，LOD值為2.76；位于5B染色體上的qRV-5B可解釋13.90%的表型變異，LOD值為3.55。

檢測到1個與根平均直徑相關(guān)的QTL，5A上的qRAD-5A可解釋18.97%的表型變異。

表5 小麥幼苗根系性狀的QTL定位結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本研究共定位到13個小麥根系相關(guān)的QTLs，分別位于1D（2）、3A、3B（3）、4B（2）、5A、5B（2）、6B、7B染色體上。通過分析QTL定位結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在1D染色體標記區(qū)間AX-111632760～AX-109830556內(nèi)存在1個QTL簇，包含了1個控制根表面積的QTL qRSA-1D，1個控制根體積的QTL qRV-1D，且貢獻率都大于10%，為主效QTL。前人通過定位發(fā)現(xiàn)了多個QTL簇，王璐［34］利用泰農(nóng)18×臨麥6號的RIL群體定位了6個QTL簇，分布在1D、3A、3B（2個）、5D和6B染色體上。1D染色體上定位到控制根體積（QRv-1D）和控制根體積抗旱系數(shù)（QDCRv-1D）的2個QTL。3B染色體上定位到1個QTL簇，控制總根長的QTrl-3B和控制根平均直徑的QRad-3B.1。6B染色體上定位到了1個QTL簇，控制根體積和根表面積2個性狀的QTL（QRv-6B和QRsa-6B.2）。Yuan等［35］利用RIL群體定位到10個與苗期性狀及成株期性狀有關(guān)的QTL簇，分布在1A、1D、4B、5D、6A和6B六個染色體上，占總QTL數(shù)量的36.53%，7個相對高頻QTL（RHFQTL）在4個QTL簇中被檢測到，10個QTL簇分成兩種類型：一種是僅在苗期性狀被檢測到，另一種是在苗期和成株期性狀都可以被檢測到。王紅日［36］以125個小麥品種（系）進行關(guān)聯(lián)分析，檢測到26個QTL簇，分別位于1A、1B、1D、2A、2B、3A、3B、4A、5A、6B、7A和7B共12條染色體上。其中1D染色體上檢測到兩個QTL簇，包含3個QTL，可解釋平均表型變異的范圍為12.37% ～13.11%；另一QTL簇可解釋平均表型變異的范圍為9.56%～26.45%。

根表面積、總根長、根體積三個性狀檢測到相同的QTL位點，位于3B染色體上標記區(qū)間AX-110413790～AX-110375698內(nèi)?？刂聘砻娣e的qRSA-3B可解釋9.89%的表型變異；控制總根長的qRL-3B可解釋6.50%的表型變異；控制根體積的qRV-3B可解釋8.66%的表型變異。位于4B 染色體上AX-110430517～AX-111102215區(qū)間存在兩個QTL位點?？刂聘砻娣e的qRSA-4B，LOD值為6.57，可解釋20.00%的表型變異；控制根體積的qRV-4B，LOD值為2.76，可解釋11.58%的表型變異。5B染色體上AX-109055754～AX-111538681檢測到兩個QTL位點，控制根表面積的qRSA-5B，LOD值為5.68，可解釋16.37%的表型變異；控制根體積的qRV-5B，LOD值為3.55，可解釋13.90%的表型變異。相關(guān)性分析顯示，根表面積與根長、根體積顯著正相關(guān)，與王璐［34］、翟榮榮［37］等的結(jié)果相同，說明根表面積與根長、根體積三個性狀的關(guān)系密切，本研究檢測到的位于3B、4B和5B染色體上的QTL位點存在一因多效的作用。其中，在3B染色體上檢測到的控制根表面積、總根長、根體積的QTL簇包含qRSA-3B、qRL-3B、qRV-3B與董肖昌［21］定位到的控制莖葉干重的qSDW3Ba位置相近。

周升輝等［22］在7B染色體上檢測到1個控制小麥最大根長的QTL，QMrl.cau-7BS，貢獻率為9.41%；任永哲等［38］發(fā)現(xiàn)位于7B染色體上控制最大根長的QMrl.sqn-7B，能解釋8.00%的表型變異。楊彩鳳［39］利用DH群體在7BS染色體上檢測到1個控制主根長的QTL位點qTL-7B，LOD值為2.84，貢獻率為5.95%。姜朋［40］在7B染色體上定位到1個控制根長的QTL QRl-7B，LOD值為2.79，能解釋9.50%的表型變異。本研究在7B染色體上定位到控制總根長的qRL-7B，能解釋5.11%的表型變異。根據(jù)以上結(jié)果推測在小麥7B染色體上可能存在控制根長的重要基因。本研究檢測到的位于6B染色體上控制總根長性狀的 qRL-6B，位于標記區(qū)間 AX-109889475～AX-111468538之內(nèi)，貢獻率為11.56%，與周小鴻［41］在6B染色體上定位到控制總根長性狀的qTRL-6B位置相近。

對兩個親本菏麥13和臨麥2號的根系性狀表型數(shù)據(jù)分析顯示，臨麥2號的總根長、根體積、根表面積大于菏麥13；根平均直徑、根尖數(shù)小于菏麥13。在控制根表面積的5個QTL中，2個QTL加性效應為正值，增效基因來自菏麥13；控制根長的3個QTL中，2個QTL加性效應為正值，增效基因來自菏麥13；控制根體積的4個QTL中，2個QTL加性效應為正值，增效基因來自菏麥13?？刂聘骄睆降?個QTL，加性效應為負值，增效基因來自于臨麥2號，以上結(jié)果說明在表現(xiàn)型較差的親本中含有增加這種表型的基因，與黃清華［26］、Wang［17］、劉新元［18］等的結(jié)論一致。后續(xù)將進一步對本研究檢測到的QTL進行精細定位，以期挖掘出控制根系的重要功能基因，為分子育種提供候選基因。