豬圓環(huán)病毒1型LAMP檢測方法的建立及初步應(yīng)用

田瑤，李佳昕，楊瑩，王碩，時建立，彭喆，李琛，徐紹建，吳曉燕，劉暢，韓紅，李俊，3

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟南 250100；3.山東師范大學(xué)生命科學(xué)院，山東 濟南 250014）

豬圓環(huán)病毒（PCV）最初被認為是豬腎連續(xù)細胞系中的一種類似于微小病毒的病毒污染劑。隨后，Allan等［1］證實該病毒來源于制備PK-15細胞的豬腎組織，是一種無包膜、小（17 nm）病毒，含有單鏈環(huán)狀DNA基因組。在群體水平上，PCV1的血清流行率在10%到100%之間［2］。雖然PCV1對豬沒有明顯的致病性，但是PCV1和PCV2具有76%以上的核苷酸同源性，并且兩種病毒在豬群中臨床感染率均比較高，存在共同感染的現(xiàn)象，所以不能忽視PCV1的潛在致病性［3］。據(jù)報道，體外感染PCV1能夠?qū)ωi肺泡巨噬細胞功能產(chǎn)生短暫影響［4］。經(jīng)PCV1感染后部分仔豬的肺臟、腸道與淋巴器官等組織中能夠檢測出相應(yīng)的抗原［5］。因此，目前仍難以排除PCV1對豬免疫系統(tǒng)的潛在損害作用。

LAMP是在2000年由日本的Notomi等［6］發(fā)明的一種能夠在恒溫條件下快速擴增核酸片段的技術(shù)。特異性核苷酸延伸是通過具有鏈置換活性的DNA聚合酶和兩對內(nèi)外引物實現(xiàn)的。保持恒定溫度60～65℃在30～60 min內(nèi)即可完成反應(yīng)［7，8］。與其他方法相比，LAMP具有快速、特異、經(jīng)濟等優(yōu)點［7-11］。SYBR GreenⅠ是一種可以結(jié)合在雙鏈DNA雙螺旋小溝區(qū)域的染料，游離狀態(tài)時SYBR GreenⅠ可發(fā)出微弱熒光，肉眼觀察呈橙色；與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光增強，紫外分析儀下呈綠色［12］。因此，SYBR GreenⅠ也被用于LAMP產(chǎn)物的檢測［13］。

豬圓環(huán)病毒之間及其與豬瘟病毒、豬藍耳病病毒之間存在共感染現(xiàn)象。PCV1可在肺組織中高效復(fù)制并產(chǎn)生病理學(xué)改變，因此建立一種PCV1的快速檢測方法是必要的。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與試劑

豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）均由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室保存。103份病料組織來自山東省規(guī)?；i場。2×Lamp Master Mix購自生工生物工程（上海）股份有限公司；DL2000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；2×EasyTaq?PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。Biospin病毒DNA提取試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自Axygen。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI中GeneBank公布的PCV1基因序列（GenBank登錄號：AY193712.1），利用在線設(shè)計軟件Primer Explorer V 4.0（http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）設(shè)計LAMP引物。利用Primer 5.0設(shè)計普通PCR引物。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 DNA的提取及PCR擴增 采用Biospin病毒DNA提取試劑盒提取DNA并進行普通PCR擴增。反應(yīng)體系（20.0μL）：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，SuperMix 10.0μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 8.5μL。反應(yīng)條件：95℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，30個循環(huán)；72℃7 min。反應(yīng)結(jié)束取5μL擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3 LAMP檢測方法的建立 LAMP反應(yīng)體系（25.0μL）：2×Lamp Master Mix 12.5μL，F(xiàn)IP（10μmol/L）2.0μL，BIP（10μmol/L）2.0μL，F(xiàn)3（10μmol/L）0.5μL，B3（10μmol/L）0.5μL，DNA 模 板1.0μL，DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 6.0μL。無菌去離子水作為陰性模板。反應(yīng)結(jié)束后取5μL擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.4 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化 水浴溫度控制在60℃進行反應(yīng)時間優(yōu)化，分別于水浴鍋中反應(yīng)40、45、50、55、60、65 min，取5μL擴增產(chǎn)物置于1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，依據(jù)擴增效果確定最佳反應(yīng)時間。選取最佳反應(yīng)時間后分別將溫度控制在57、58、59、60、61、62、63、64℃條件下擴增，反應(yīng)結(jié)束取5μL擴增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，確定最佳反應(yīng)溫度。

1.2.5 LAMP特異性和敏感性試驗 分別以PPV、PRV、PCV2、PCV3為模板，同時設(shè)陰性對照。在優(yōu)化條件下進行LAMP反應(yīng)，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行特異性檢測。

將PCV1陽性質(zhì)粒10倍倍比稀釋（初始濃度為200 ng/μL）進行PCR及LAMP敏感性方法檢測。

1.2.6 臨床樣品檢測 取103份疑似患病豬組織分別進行LAMP和普通PCR檢測，比較兩種方法的檢出率，評估建立的LAMP方法在臨床檢測上的適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

本研究設(shè)計了多組LAMP引物以及PCR引物，對各組引物擴增條帶清晰度和整齊度進行比較，從而篩選出LAMP最佳引物組（表1）。PCR引物為F3、B3。PCR以及LAMP擴增條帶大小均為190 bp左右。圖1為篩選出的LAMP引物所在位置。

表1 引物序列和位置

圖1 LAMP引物位置

2.2 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中條帶的清晰度以及整齊度，確定最佳反應(yīng)時間為60 min（圖2），最佳反應(yīng)溫度為62℃（圖3）。

圖2 LAMP反應(yīng)時間優(yōu)化

圖3 LAMP反應(yīng)溫度優(yōu)化

2.3 LAMP特異性

特異性試驗（圖4）及LAMP可視化結(jié)果（圖5）顯示，只有PCV1為陽性，其他均為陰性，說明該方法有很好的特異性。

圖4 LAMP反應(yīng)特異性

圖5 LAMP可視化特異性試驗

2.4 LAMP敏感性試驗

敏感性試驗表明，LAMP檢測限為1×101copies/μL（圖6、圖7），普通PCR最低檢測限為1×103copies/μL（圖8）。

圖6 LAMP敏感性試驗

圖7 LAMP可視化敏感性試驗

圖8 普通PCR敏感性試驗

2.5 臨床樣品檢測試驗

對103份疑似患病豬組織分別進行LAMP和普通PCR檢測，LAMP陽性率為34.0%（35例），普通PCR陽性率為29.1%（30例）。兩種方法檢測結(jié)果一致的樣本數(shù)占總樣本數(shù)的比例即為兩者的符合率。結(jié)果表明，兩種檢驗方法的符合率為89.5%。

3 討論與結(jié)論

雖然PCV1對豬沒有致病性，但是豬場中常存在PCV1、PCV2和PCV3共感染現(xiàn)象，對養(yǎng)豬業(yè)存在潛在的危險。Krakowka等［14］對接種未感染的細胞裂解物或單一病毒接種物（PPV、PCV-1或PCV-2）的仔豬進行研究，結(jié)果顯示仔豬臨床均正常，并且接種PCV-1的仔豬淋巴結(jié)出現(xiàn)輕度的增生，10頭仔豬中有5頭是短暫的病毒血癥。因此，有必要建立一種快速、準(zhǔn)確、敏感的PCV1檢測方法。目前，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)已經(jīng)和常規(guī)PCR、實時熒光定量PCR等共同成為常規(guī)檢測的主要工具［15］。但是常規(guī)PCR和熒光定量PCR均需要特定的儀器設(shè)備，價格不但昂貴而且還需專業(yè)人員操作，成本高、檢測時間長，不適用于現(xiàn)場快速檢測。LAMP技術(shù)突出的優(yōu)勢在于不需要特定的儀器設(shè)備，只需要保持溫度在60～65℃，且1 h之內(nèi)就可以完成反應(yīng)，具有簡單、快速、特異性強和敏感性高等特點。在結(jié)果判定方面，已有多種肉眼可視的方法及實時熒光檢測法得到廣泛應(yīng)用，可以從源頭上控制由瓊脂糖凝膠電泳造成的氣溶膠污染問題，尤其適用于現(xiàn)場快速檢測及床旁檢測［16］。本研究建立的LAMP檢測方法紫外分析儀下陽性結(jié)果為黃綠色，陰性結(jié)果為橘色，檢測結(jié)果直觀且容易分辨。

張福良等［17］建立的PCV1型熒光定量PCR檢測方法檢測限為1.0×104copies/μL。王立嬌等［18］建立的PCV1與PCV2型雙重PCR檢測方法中PCV1的檢測限為1.7×103copies/μL。本試驗建立的PCV1 LAMP可視化快速檢測方法檢測限為1×101copies/μL。該方法為進一步研究PCV1在豬體內(nèi)的分布情況、病毒的感染機制以及PCV1在PCV2致病機制中的作用奠定了基礎(chǔ)，可用于PCV1的流行病學(xué)調(diào)查及其他PCV1相關(guān)研究。