乙?；揎椩谟绊懠?xì)菌對(duì)核糖體靶向抗生素敏感性中的作用

來(lái)亞男，姚玉峰，郭曉奎，倪進(jìn)婧

1.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院-國(guó)家熱帶病研究中心全球健康學(xué)院，上海200025

核糖體是蛋白質(zhì)的合成機(jī)器，部分臨床上常用的抗生素通過(guò)阻斷細(xì)菌核糖體的蛋白質(zhì)合成來(lái)發(fā)揮抗菌作用［1］。細(xì)菌核糖體由30S小亞基和50S大亞基組成，包含3 種核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）和54 種核糖體蛋白［2］。很多已知的抗生素作用于核糖體翻譯的延伸階段，如氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、氯霉素類(lèi)、夫西地酸類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)等［3］。細(xì)菌為了避免其被藥物清除，可通過(guò)一系列限制性行為減少藥物對(duì)自身的作用。例如，某些革蘭陰性菌通過(guò)外膜來(lái)阻止抗生素進(jìn)入細(xì)胞［4］。除此之外，細(xì)菌還可對(duì)核糖體成分修飾或使其發(fā)生突變，來(lái)減弱抗生素與核糖體的結(jié)合能力。例如細(xì)菌通常會(huì)利用甲基轉(zhuǎn)移酶來(lái)甲基化修飾50S 亞基23S rRNA 或30S 亞基16S rRNA，獲得耐藥性［5-6］；30S 亞基核糖體蛋白S12的突變也被證明可誘導(dǎo)細(xì)菌對(duì)引起蛋白質(zhì)錯(cuò)誤合成的抗生素如鏈霉素產(chǎn)生耐藥性［7-8］。

乙?；揎検羌?xì)菌體內(nèi)主要的蛋白翻譯后修飾類(lèi)型，對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞代謝具有多個(gè)方面的影響。例如，乙?；揎椨绊懠?xì)菌的致病性［9］、對(duì)外界環(huán)境的應(yīng)答［10］和代謝過(guò)程等［11］。在細(xì)菌中，蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶（protein acetyltransferase，Pat）是目前研究較充分的乙酰轉(zhuǎn)移酶［12］。乙酰磷酸（acetyl-phosphate，AcP）可直接將其自身的乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移到賴(lài)氨酸殘基ε-氨基上；相比Pat，AcP 的底物范圍更廣，但特異性較低［13-14］。AcP 的水平取決于磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（phosphotransacetylase，Pta）催化生成乙酰輔酶A 的速率，以及被乙酸激酶（acetate kinase，AckA）降解為乙酸的速率。敲除編碼AckA 的基因ackA 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)AcP 含量升高。乙?；揎椧材鼙粺燉０废汆堰识塑账嵋蕾?lài)性去乙酰化酶（NAD+-dependent protein deacylase，CobB）進(jìn)行去乙?；揎?，它可以去除Pat 和AcP 2 種修飾途徑來(lái)源的乙?；鶊F(tuán)［15］。細(xì)菌核糖體是臨床常用抗生素的主要靶標(biāo)。研究［7-8］證實(shí)核糖體蛋白的突變會(huì)影響細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性。課題組前期通過(guò)乙?；|(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門(mén)菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，S. Typhimurium）的核糖體蛋白存在廣泛的乙?；揎?，然而這種普遍的修飾狀態(tài)是否影響抗生素與細(xì)菌的結(jié)合還未知。故本研究以3 種乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株（pat 基因敲除株Δpat、cobB基因敲除株ΔcobB和ackA基因敲除株ΔackA）為研究對(duì)象，探究細(xì)菌乙酰化修飾對(duì)抗生素與細(xì)菌結(jié)合關(guān)系有無(wú)影響，從而為尋找解決細(xì)菌耐藥問(wèn)題提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 S.Typhimurium 14028S 菌株購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。 Δpat、 ΔcobB、 ΔackA 是 在S. Typhimurium 14028S 的遺傳背景下分別敲除pat 基因、cobB 基因、ackA基因獲得的菌株，均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑與儀器 嘌呤霉素（貨號(hào)A610593）、四環(huán)素（貨號(hào)A100422）、壯觀霉素（貨號(hào)A600901）、巴龍霉素（貨號(hào)A614181）均購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司。Easyspiral dilute細(xì)菌涂布儀購(gòu)于上海書(shū)俊儀器設(shè)備有限公司，Synergy 2酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 挑取單克隆菌落于無(wú)菌LB培養(yǎng)基（Luria-Bertani medium）中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；用新鮮LB 培養(yǎng)基調(diào)整菌液在波長(zhǎng)600 nm 處的吸光度值D（600 nm），待D（600 nm）=1 后，將菌液按照1∶10 的比例轉(zhuǎn)接，使起始D（600 nm）=0.1，之后每1 h 測(cè)量1 次D（600 nm）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，D（600 nm）為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 抗生素梯度稀釋液制備 根據(jù)Wiegand等［16］的方法制備抗生素梯度稀釋液。首先配置成濃度為1 280 mg/L的抗生素母液。計(jì)算公式為W=（C×V）/P，其中W=需溶解的抗生素質(zhì)量（mg），V=實(shí)驗(yàn)需要的體積（mL），C=最終儲(chǔ)存濃度（μg/mL），P=說(shuō)明書(shū)中顯示的抗生素有效含量（μg/mg）。按照表1 在無(wú)菌試管中用無(wú)菌LB 培養(yǎng)基制備抗生素稀釋液。

1.2.3 菌落形成單位計(jì)算 挑取單克隆菌落于新鮮的LB培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，測(cè)定過(guò)夜培養(yǎng)菌液的D（600 nm）。用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）按照1∶10的比例倍比稀釋菌液直至稀釋度達(dá)到10?7；分別取100 μL 10?4～10?7稀釋度的菌液涂布平板，37 ℃培養(yǎng)，隔日計(jì)數(shù)每個(gè)平板中的單克隆菌落數(shù)。菌落形成單位（colony forming unit，CFU）根據(jù)公式N=C×101+D計(jì)算，其中N=每毫升菌液的CFU數(shù)，C=每個(gè)平板中的單克隆菌落數(shù)（100～400 個(gè)），D=按照1∶10 進(jìn)行稀釋的次數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。確定D（600 nm）與CFU的關(guān)系系數(shù)。

表1 抗生素稀釋液的配制Tab 1 Preparation of antibiotic dilution

1.2.4 肉湯稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度 根據(jù)D（600 nm）和CFU 的關(guān)系系數(shù)，調(diào)整過(guò)夜培養(yǎng)菌液的起始接種量為1×108CFU/mL。取96 孔板，無(wú)菌對(duì)照孔加入100 μL 無(wú)菌LB培養(yǎng)基，生長(zhǎng)對(duì)照孔加入50 μL無(wú)菌LB培養(yǎng)基，其他孔加入各稀釋度抗生素50 μL。將1×108CFU/mL細(xì)菌懸浮液按照1︰100稀釋?zhuān)谏L(zhǎng)對(duì)照孔和加入各稀釋度抗生素的孔中加入50 μL細(xì)菌懸液，充分混勻。37 ℃孵育16～20 h，酶標(biāo)儀測(cè)量D（600 nm），同時(shí)可通過(guò)涂布法確保96孔板中細(xì)菌數(shù)量約為5×105CFU/mL。當(dāng)某稀釋度抗生素對(duì)應(yīng)的孔中與無(wú)菌對(duì)照孔中菌液的D（600 nm）相同，則該稀釋度下的抗生素濃度即為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.2.5 稀釋點(diǎn)板實(shí)驗(yàn) 將過(guò)夜培養(yǎng)菌液按照1∶100 轉(zhuǎn)接至新鮮的LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至D（600 nm）=1。取1 mL菌液3 000×g離心8 min，無(wú)菌PBS洗滌，調(diào)整D（600 nm）至0.1。按照1∶10的比例倍比稀釋至10?4稀釋度。取各稀釋度（100、10?1、10?2、10?3、10?4）菌液2 μL 依次點(diǎn)板，37 ℃培養(yǎng)16 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 乙酰化修飾對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

為了排除乙?；揎棇?duì)細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，首先測(cè)量了S.Typhimurium 14028S及3種乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株Δpat、ΔcobB和ΔackA的生長(zhǎng)曲線。由于點(diǎn)板稀釋實(shí)驗(yàn)設(shè)置的初始D（600 nm）=0.1，故以D（600 nm）=0.1作為起始D（600 nm）連續(xù)監(jiān)測(cè)。圖1 顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，S.Typhimurium 14028S 和3 種乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株的生長(zhǎng)曲線較為吻合，表明乙?；腿ヒ阴；揎棽挥绊懠?xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)。此外，在D（600 nm）都為0.1 的情況下，通過(guò)稀釋涂布法確定的3 種乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株和S.Typhimurium 14028S 活菌數(shù)量也沒(méi)有明顯差異。

2.2 S.Typhimurium 14028S的MIC測(cè)定

為了探究乙酰化修飾是否影響細(xì)菌對(duì)核糖體靶向抗生素的敏感性，我們選擇4種核糖體靶向抗生素——嘌呤霉素、巴龍霉素、四環(huán)素和壯觀霉素，通過(guò)肉湯稀釋法檢測(cè)其對(duì)S. Typhimurium 14028S 的MIC。結(jié)果顯示：嘌呤霉素的MIC 為256 mg/L，巴龍霉素的MIC 為32 mg/L，四環(huán)素的MIC為4 mg/L，壯觀霉素的MIC為128 mg/L。

圖1 S.Typhimurium 14028S和各乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株的生長(zhǎng)曲線Fig 1 Growth curves of S. Typhimurium 14028S and acetylation related gene mutants

2.3 乙酰化修飾相關(guān)基因敲除株對(duì)核糖體靶向抗生素的敏感性

根據(jù)上述MIC 測(cè)定結(jié)果，制備濃度低于相關(guān)抗生素MIC 的含抗生素平板培養(yǎng)基。培養(yǎng)S. Typhimurium 14028S 和3 種乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株單克隆，調(diào)整D（600 nm）=0.1；將菌液按照1∶10 的比例倍比稀釋至10?4稀釋度，取10?4～100稀釋度的菌液分別點(diǎn)板。

2.3.1 乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株對(duì)嘌呤霉素的敏感性 在無(wú)抗生素的平板培養(yǎng)基上，4種菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)相似且生長(zhǎng)狀態(tài)均正常（圖2）。在含128 mg/L 嘌呤霉素的平板培養(yǎng)基上，S. Typhimurium 14028S、Δpat 和ΔcobB的生長(zhǎng)狀態(tài)正常，ΔackA（胞內(nèi)AcP 含量增加，乙?；潭壬撸╋@示生長(zhǎng)缺陷，表明在AcP 的調(diào)控下，細(xì)菌對(duì)結(jié)合在50S 亞基上的嘌呤霉素的敏感性提高。cobB 基因敲除后（ΔcobB），雖然整體乙?；潭壬?，但ΔcobB 在點(diǎn)板稀釋實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有明顯表型，表明去乙?；窩obB 不參于調(diào)控S. Typhimurium 對(duì)嘌呤霉素的敏感性。

2.3.2 乙酰化修飾相關(guān)基因敲除株對(duì)巴龍霉素的敏感性 在含8 mg/L 巴龍霉素的平板培養(yǎng)基上，S.Typhimurium 14028S、ΔcobB 和ΔackA 的生長(zhǎng)狀態(tài)較為正常，但Δpat已經(jīng)出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)缺陷；在含16 mg/L巴龍霉素的平板培養(yǎng)基上，10?4～100稀釋度的ΔackA仍然可以生 長(zhǎng)，而10?3和10?4稀 釋 度 的S. Typhimurium 14028S 和ΔcobB的生長(zhǎng)受到明顯抑制（圖3）。這一結(jié)果表明乙?；潭冉档停éat），S.Typhimurium對(duì)巴龍霉素的敏感性增加；而乙?；潭壬撸éckA），S.Typhimurium 對(duì)巴龍霉素的敏感性降低。巴龍霉素可引起細(xì)菌翻譯錯(cuò)誤率升高。相比S. Typhimurium 14028S，Δpat 呈現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)缺陷表型，表明乙?；揎棇?duì)于細(xì)菌維持正常的翻譯保真度至關(guān)重要。

圖2 嘌呤霉素的點(diǎn)板稀釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 2 Spot dilution assay of puromycin

圖3 巴龍霉素的點(diǎn)板稀釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 3 Spot dilution assay of paromomycin

2.3.3 乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株對(duì)四環(huán)素和壯觀霉素的敏感性 3種乙酰化修飾相關(guān)基因敲除株在同一四環(huán)素和壯觀霉素濃度下，生長(zhǎng)狀態(tài)和生長(zhǎng)受到抑制的程度與S.Typhimurium 14028S 相同（圖4、5），表明乙酰化程度增高（ΔcobB、ΔackA）或降低（Δpat），S.Typhimurium對(duì)四環(huán)素和壯觀霉素的敏感性沒(méi)有受到影響。

圖4 四環(huán)素點(diǎn)板稀釋實(shí)驗(yàn)Fig 4 Spot dilution assay of tetracycline

圖5 壯觀霉素點(diǎn)板稀釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 5 Spot dilution assay of spectinomycin

3 討論

蛋白質(zhì)是所有生物體生存的物質(zhì)基礎(chǔ)。真核生物和原核生物的蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程存在明顯差異，一些抗生素的開(kāi)發(fā)正是利用了這一差異［17］。本實(shí)驗(yàn)室前期的乙?；|(zhì)譜分析顯示S.Typhimurium 的核糖體蛋白存在廣泛的乙?；揎?，并且受AcP 和Pat共同調(diào)控。核糖體蛋白的氨基酸突變會(huì)影響細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性［18］，但核糖體蛋白翻譯后修飾在其中的作用尚不清楚。本研究以3種乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株為研究對(duì)象，并選擇4種核糖體靶向抗生素，來(lái)探究細(xì)菌核糖體蛋白的乙酰化修飾在應(yīng)對(duì)抗生素的作用時(shí)所扮演的角色。

嘌呤霉素因?yàn)槠浞肿咏Y(jié)構(gòu)類(lèi)似于氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（aminoacyl transfer RNA，aa-tRNA）而被摻入肽鏈的合成，從而導(dǎo)致肽鏈合成提前終止，其作用位點(diǎn)位于肽酰轉(zhuǎn)移酶活性中心［19］。我們發(fā)現(xiàn)ackA 基因敲除后，即乙?；潭壬撸琒.Typhimurium 對(duì)嘌呤霉素的敏感性增加。通常嘌呤霉素?fù)饺雽?dǎo)致細(xì)菌蛋白質(zhì)翻譯終止的原因是肽酰轉(zhuǎn)移酶對(duì)其的識(shí)別和催化，但在乙?；潭壬叩那闆r下，S.Typhimurium 對(duì)嘌呤霉素的敏感性增加，我們猜測(cè)乙?；揎椏赡軙?huì)增加肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性從而導(dǎo)致更多嘌呤霉素的摻入。

巴龍霉素結(jié)合在細(xì)菌核糖體30S亞基的解碼中心，引起其構(gòu)象變化，從而影響A 位點(diǎn)上mRNA 和aa-tRNA 密碼子反密碼子螺旋的形成［20］。我們發(fā)現(xiàn)ΔackA 菌株對(duì)巴龍霉素的敏感性降低，這一結(jié)果提示乙?；揎椏赡軙?huì)影響30S亞基解碼中心結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象，從而影響巴龍霉素的結(jié)合。細(xì)菌核糖體蛋白的氨基酸突變，造成核糖體蛋白側(cè)鏈結(jié)構(gòu)改變，影響抗生素結(jié)合位點(diǎn)的空間構(gòu)型，從而影響細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性［18］。我們猜測(cè)乙?；揎椊档蚐.Typhimurium 對(duì)巴龍霉素的敏感性，可能是核糖體蛋白的乙?；揎椝隆：颂求w蛋白的賴(lài)氨酸發(fā)生乙?；揎?，會(huì)中和生理?xiàng)l件下核糖體蛋白賴(lài)氨酸所帶的正電荷；同時(shí)乙酰基團(tuán)的摻入會(huì)使蛋白質(zhì)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；這2 種改變都可能會(huì)削弱核糖體蛋白與rRNA 的結(jié)合，影響核糖體結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致巴龍霉素在核糖體上結(jié)合位點(diǎn)的空間構(gòu)型發(fā)生改變。但乙酰化修飾影響S.Typhimurium 對(duì)巴龍霉素敏感性的具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

四環(huán)素阻止aa-tRNA 結(jié)合到30S 亞基A 位點(diǎn)［21］，使其被16S rRNA 完全包圍，與核糖體蛋白沒(méi)有任何接觸。壯觀霉素抑制tRNA-mRNA 的易位過(guò)程，除了與16S rRNA 的螺旋34（helix 34）相互作用外，與核糖體蛋白S5的第25位賴(lài)氨酸也存在相互作用［21］。我們發(fā)現(xiàn)乙?；揎棾潭雀淖儾挥绊慡.Typhimurium 對(duì)這2 種抗生素的敏感性，表明乙?；揎棽挥绊懣股亟Y(jié)合位點(diǎn)的空間構(gòu)型。但不能認(rèn)為核糖體蛋白的乙酰化修飾在其中沒(méi)有發(fā)揮作用，因?yàn)橐阴；揎検菍?duì)核糖體蛋白整體的功能調(diào)控，并非對(duì)某一核糖體蛋白的單一調(diào)控。一個(gè)比較經(jīng)典的例子是核糖體蛋白S12和S4之間的關(guān)系。有研究［22］發(fā)現(xiàn)S12 突變后會(huì)減弱S.Typhimurium 的毒力，但在S12 突變株中會(huì)出現(xiàn)高頻率的S4 突變株來(lái)回補(bǔ)毒力。同理，乙?；揎椧彩且环N全局性調(diào)控，影響核糖體蛋白與rRNA、tRNA 等組分之間的相互作用，從而保證細(xì)菌在應(yīng)對(duì)各種脅迫環(huán)境下依然能夠生存。

本研究發(fā)現(xiàn)乙?；揎棔?huì)影響細(xì)菌對(duì)核糖體靶向抗生素的敏感性，這種影響可能是通過(guò)核糖體蛋白的乙酰化修飾來(lái)調(diào)控的。探究乙酰化修飾與細(xì)菌對(duì)抗生素敏感性的關(guān)系對(duì)于解決臨床上日益嚴(yán)重的耐藥問(wèn)題以及新藥的研制具有重要的意義。