白藜蘆醇通過抑制系膜區(qū)細胞增殖下調PDGF-B、TGF-β1表達減緩大鼠IgAN進展

冀 賀，王艷紅，于 洋，常思佳，黃太平，王娟娟，楊 佳，田繼華

(1.山西醫(yī)科大學微生物學與免疫學教研室； 2.太原鋼鐵(集團)有限公司總醫(yī)院病理科,山西 太原 030001)

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是全球最常見的腎小球疾病[1]，由Berger J于1968年首次報道。IgAN的病理特點是IgA在腎小球系膜區(qū)沉積，沉積物主要由IgA組成，有時與IgG或補體成分如補體C3結合?；颊哐錓gA水平升高，出現(xiàn)蛋白尿、鏡下或肉眼血尿。該病患者易進展成為終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)，確診后的20年內發(fā)病率超過25%[2]。就IgAN全球的發(fā)病率來看，該病在亞洲地區(qū)的發(fā)病率最高，而且亞州IgAN患者更易進展為ESRD，這一點也已經(jīng)到得證實，因此，IgAN是亞洲人群發(fā)生ESRD最主要的原發(fā)性腎小球疾病[3]。

SirT1是存在于哺乳動物中的一種依賴NAD+的去乙?；竅4]，可以對組蛋白、相關轉錄因子、信號傳導分子中特定的賴氨酸殘基進行脫乙酰化，導致異染色質形成和基因沉默，從而參與調控多種代謝途徑及細胞過程，包括細胞增殖與分化、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂肪代謝、細胞凋亡、衰老和長壽等。白藜蘆醇是SirT1的一種常用激活劑，它存在于葡萄等天然植物中，是一種多酚化合物[5]。它的功能繁多，具有抗氧化、抗自由基、抗癌、抗突變以及心臟保護、神經(jīng)保護、預防肝臟損傷等作用。本研究主要探討SirT1激動劑白藜蘆醇對IgAN大鼠的治療效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物白藜蘆醇(貨號：V900386-5G，美國Sigma公司)，在生理鹽水中加入羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)制備0.5% CMC-Na溶液，再將白藜蘆醇加入CMC-Na溶液中，得到均勻分散的白藜蘆醇懸浮液,濃度為20 g·L-1。根據(jù)查閱文獻和前期的預實驗結果將白藜蘆醇灌胃濃度定為200 mg·kg-1·d-1。

1.2 試劑白藜蘆醇購自美國Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)購自北京索萊寶科技有限公司；蓖麻油、四氯化碳(天津市光復精細化工試劑有限公司)；麗春紅S購自上海生物工程有限公司；PAS染液、Masson染液(山西百奧生物技術有限公司)；Anti-PDGF B抗體、Anti-TGF-β1抗體、兔抗大鼠IgG H&L(HRP)、FITC標記兔抗鼠IgA抗體、兔抗大鼠IgA和FITC標記羊抗兔IgG均購自美國Abcam公司；抗熒光衰減封片劑(武漢博士德生物)。

1.3 動物健康清潔級Wistar大鼠24只, 雄性，6周齡，體質量(150±10)g，由山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供(合格證號為SCXK(晉)2019-0004)。大鼠適應性喂養(yǎng)1周，狀態(tài)良好，反應靈敏、毛發(fā)整齊有光澤，兩次尿蛋白定性試驗均為陰性。

1.4 方法

1.4.1IgAN大鼠動物模型的建立 脂多糖+四氯化碳+牛血清白蛋白的方法建立IgAN模型是國內IgAN最常應用的造模技術,我們采用此方法進行造模。IgAN模型建立：實驗d 1牛血清白蛋白灌胃(400 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)6周；皮下注射蓖麻油0.5 mL+四氯化碳0.1 mL，1周1次，持續(xù)9周；第6周、8周尾靜脈注射脂多糖(0.05 mg/只)，觀察至12周末。將腎皮質組織切成3 μm的冰凍切片，采用兔抗大鼠IgA和FITC標記羊抗兔IgG間接免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察腎小球系膜區(qū)IgA沉積陽性，PAS和Masson染色顯示系膜細胞增生和系膜基質產生沉積表明造模成功。

1.4.2實驗分組及藥物干預 將所有大鼠隨機分成以下4組：正常對照組、IgAN組、正常對照+Res組(200 mg·kg-1·d-1)和IgAN+Res組(200 mg·kg-1·d-1)，每組8只；IgAN組按上述造模方法給藥，正常對照組給予生理鹽水，12周末，正常對照組和IgAN組各處死2只大鼠，觀察造模情況；Res給藥組12周末開始灌胃給藥，16周末剩余大鼠股動脈取血，之后將所有大鼠處死。將大鼠腎臟取出，一部分腎組織于4%多聚甲醛中固定，用于后續(xù)免疫熒光和免疫組化等各項檢測。

1.4.3尿蛋白檢測及生化指標檢測 在實驗的第4、8、12和16周末，各組大鼠禁食、不限制飲水，代謝籠收集大鼠24 h尿液。采用麗春紅S法進行尿蛋白定量分析。16周末腹腔靜脈取血5 mL，室溫靜置30 min后，離心分離血清，用DxC800型自動生化分析儀檢測各項生化指標，包括血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、血清總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)。

1.4.4PAS和Masson染色法觀察腎臟病理改變 腎組織在10%中性福爾馬林中固定24 h以上，然后用酒精對組織進行脫水，經(jīng)二甲苯透化、浸蠟、石蠟包埋，切片，置于60 ℃烤箱2 h之后，進行PAS(過碘酸雪夫)染色及Masson染色，封片后顯微鏡下觀察結果，攝片并分析。

1.4.5免疫熒光觀測IgA沉積 取新鮮腎組織于OCT包埋液中進行快速冷凍，組織冰凍塊固定在組織卡盤中，置于冰凍切片機進行連續(xù)切片，厚度為4 μm，逐片收集；用丙酮固定10 min后放置室溫進行干燥；擦去多余的OCT，4%馬血清37 ℃封閉1 h，PBS洗3次，每次10 min，之后置于室溫下微干，滴加FITC標記的兔抗鼠IgA抗體(1 ∶100)置于暗盒中4 ℃過夜；放置室溫晾干并進行封片，之后共聚焦顯微鏡下觀察，攝片。

1.4.6免疫組化法檢測PDGF-B、TGF-β1 腎組織在10%中性福爾馬林中固定24 h以上，制備組織切片。首先對組織切片進行脫蠟復水處理：切片室溫放置1 h后浸泡二甲苯2次，每次10 min，切片放入梯度乙醇，每次處理均為5 min，孵育；微波抗原修復，之后10%羊血清進行封閉并置于室溫60 min，去除封閉液后加PDGF-B、TGF-β1的一抗(1 ∶100稀釋)，濕盒4 ℃孵育過夜；d 2滴加二抗工作液，37 ℃孵育30 min，顯色劑(DAB)顯色，脫水封片后鏡下觀察，攝片。

2 結果

2.1 白藜蘆醇明顯減少24 h尿蛋白量造模前各組大鼠蛋白尿定性陰性，IgAN組在造模第4周末開始出現(xiàn)少量的尿蛋白，后持續(xù)升高，12周末達到(19.67±4.15) mg·d-1，與對照組比較有顯著差異(P<0.01)；16周末，IgAN組蛋白尿仍繼續(xù)增長，而白藜蘆醇干預治療組，尿蛋白由(21.45±3.98)mg·d-1降低至(12.32±2.86) mg·d-1，差異具有顯著性(P<0.01)(Tab 1)。

2.2 白藜蘆醇對IgAN大鼠腎功能的影響16周末，干預組與對照組TP、ALB均未明顯改變(P>0.05)；與對照組比較IgAN組BUN、Scr略微升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；白藜蘆醇干預4周后，BUN、Scr恢復為正常值，與IgAN組比較差異有顯著性(P<0.05)(Tab 2)。

Tab 2 The biochemical indexes in different

Tab 1 The urine protein quantification in different mg·d-1,n=8)

2.3 白藜蘆醇減少腎小球IgA的沉積12周末可見IgAN組系膜區(qū)已有顯著的熒光沉積，16周末正常對照組只有很少的熒光，IgAN組可以觀察到大量熒光沉積在系膜區(qū)，而白藜蘆醇干預的IgAN組，熒光沉積明顯減少，說明白藜蘆醇可以有效抑制IgA在腎小球的沉積，見Fig 1。

2.4 白藜蘆醇抑制IgAN大鼠模型系膜區(qū)細胞增殖，減少系膜基質沉積PAS和Masson染色結果光鏡下可以觀察到，對照組大鼠腎組織結構正常，IgAN組在12、16周末主要表現(xiàn)為系膜區(qū)細胞及基質的增生，腎小球出現(xiàn)腫脹、體積增大，與臨床IgAN病理改變一致；而白藜蘆醇干預治療4周后腎小球體積顯著減小，系膜區(qū)細胞及基質增生明顯受到抑制，見Fig 2。

2.5 白藜蘆醇可抑制IgAN大鼠TGF-β1、PDGF-B的表達IgAN系膜區(qū)細胞增殖后，會釋放一系列細胞因子，其中PDGF-B、TGF-β1是重要的纖維化因子，可促進細胞外基質的釋放。結果顯示，IgAN組PDGF-B、TGF-β1表達較對照組明顯增高(P<0.01)，IgAN+Res組較IgAN組的表達顯著減少(P<0.01)，通過棕色顆粒光密度分析，可觀察到白藜蘆醇顯著下調PDGF、TGF-β1的表達，見Fig 3。

Fig 3 Expression of PDGF-B and TGF-β1 after resveratrol A:PDGF-B; B:TGF-β1. *P<0.05，**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs IgAN group

Fig 2 Changes of glomerular mesangial cells and matrix after resveratrol intervention

Fig 1 IgA fluorescence deposition in glomerular mesangial area after resveratrol intervention(confocal microscope, ×200)

3 討論

近些年，白藜蘆醇對腎臟的保護作用引起了越來越多研究者的關注[6]。在糖尿病腎病小鼠模型中，白藜蘆醇可有效緩解小鼠模型的高血糖、高血脂，改善腎臟結構與功能，同時降低氧化應激水平、減輕炎性細胞浸潤。在腎小球腎炎、腎纖維化、多囊腎病等疾病中，經(jīng)白藜蘆醇干預后的動物模型的腎功能也都得到了相應改善。另外，在臨床實驗中，白藜蘆醇給藥可以使慢性腎臟病患者的腎臟濾過率增加。以上這些均說明白藜蘆醇對人的腎臟具有潛在的保護作用，白藜蘆醇對健康的益處是廣泛存在的。但是，目前關于白藜蘆醇治療IgAN的研究報道非常少。Chang等[7]研究證實：白藜蘆醇通過保持線粒體完整性和增強自噬作用來抑制NLRP3炎癥小體的激活，從而減輕IgAN小鼠模型的腎小球增生、硬化和炎癥。周敏[8]證實：白藜蘆醇可以明顯下調IgAN大鼠IL-5的表達，同時降低血清循環(huán)免疫復合物的濃度。本實驗證明：白藜蘆醇可以通過3個關鍵環(huán)節(jié)延緩IgAN的進展。因此，白藜蘆醇對IgAN的治療作用是毋庸置疑的，只是具體的機制并不十分明確，還有待進一步研究。

本次實驗，我們使用的是IgAN的大鼠模型。實驗第4周，IgAN大鼠開始出現(xiàn)蛋白尿，之后不斷增加，在第16周時達到最高值。12周末使用白藜蘆醇進行干預，4周后觀察到大鼠蛋白尿明顯減少。在本次實驗中，IgAN大鼠的腎臟功能參數(shù)并沒有發(fā)生明顯變化。在第16周時，腎病組的肌酐值高于對照組，但白藜蘆醇干預組沒有發(fā)現(xiàn)肌酐變化。以上結果表明，IgAN在疾病的早期腎功能可以維持正常，而后期持續(xù)性蛋白尿使腎功能受到影響，因此蛋白尿是該病發(fā)展為慢性腎病的危險因素。雖然在一開始腎功能變化并不非常明顯，但它們會繼續(xù)惡化；而白藜蘆醇能夠顯著減輕蛋白尿，從而起到保護腎功能的作用。

IgAN至今仍然病因不明，其發(fā)病機制也與多種因素相關，目前公認的觀點是：IgAN是一種由免疫復合物沉積引起的腎小球疾病[9]。IgAN患者體內含有大量缺乏半乳糖殘基的IgA[10]，結構的異常使其能夠逃避肝細胞和單核細胞的吞噬作用，并形成免疫復合物沉積在系膜區(qū)；IgA與腎小球中性粒細胞和系膜細胞受體結合后刺激細胞增殖，之后導致多種細胞因子釋放，這些細胞因子繼續(xù)加重細胞和細胞外基質增殖與聚集，最終導致間質纖維化[11-13]。

此次實驗的結果表明，白藜蘆醇能夠明顯減少IgA免疫復合物在系膜區(qū)的沉積。IgAN患者大多存在半乳糖鏈缺失型IgA的升高，但這僅僅是發(fā)展為IgAN的一個誘發(fā)因素，IgA必須形成復合物并沉積在腎小球系膜區(qū)才能引發(fā)IgAN[11]。經(jīng)過白藜蘆醇4周的治療，與對照組比較可以觀察到IgA的熒光強度明顯減弱，證明白藜蘆醇能夠抑制IgA沉積；只是經(jīng)過白藜蘆醇干預后仍然存在較明顯的IgA沉積，這一結果提示，白藜蘆醇無法起到逆轉已沉積IgA的作用。那么白藜蘆醇是如何抑制IgA的沉積的呢？這可能與白藜蘆醇能夠抑制淋巴細胞的增殖和功能相關，但具體的作用機制有待我們進一步研究。細胞增殖在IgAN的整個發(fā)病過程中起著重要作用，而免疫復合物的沉積可以刺激系膜區(qū)細胞增殖，其大量增殖又可以導致細胞因子和細胞外基質的釋放，最終引起腎小球硬化[14]。本實驗在白藜蘆醇干預治療4周后，我們用PAS和Masson染色，結果顯示腎小球體積明顯減小，同時系膜區(qū)細胞與基質增生受到明顯抑制。

系膜細胞和炎性細胞的異常增殖能夠使它們產生大量的細胞因子，如血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)和轉化生長因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)。PDGF是間充質細胞的有絲分裂原和趨化劑，是一種重要的促有絲分裂因子，能促進纖維母細胞、平滑肌細胞、神經(jīng)膠質細胞等分裂。PDGF是參與腎臟疾病整個疾病過程最具特征的生長因子之一，激活的PDGF信號誘導纖維樣母細胞合成大量細胞外基質并沉積于細胞間質，從而促進纖維化的發(fā)生。PDGF有3種二聚體結構形式：PDGF-AA，PDGF-BB和PDGF-AB，其中促進纖維母化作用最強的是BB型式。TGF-β超家族有調節(jié)細胞生長和分化的作用，TGF-β1為其中的一員，它對細胞的形態(tài)、增殖和分化過程起著重要的調節(jié)作用，能通過誘導細胞凋亡、細胞骨架移位或細胞骨架丟失而導致足細胞損傷。已有研究證實，TGF-β1及PDGF-B表達增多與腎小球硬化關系密切[15-16]。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，IgAN組中兩者的表達均有明顯增加，而白藜蘆醇則可以明顯減少腎小球PDGF-B和TGF-β1的表達。腎小球系膜細胞、細胞因子和細胞外基質3者之間相互影響，相互促進是IgAN進展的主要原因，而白藜蘆醇則可以分別作用于3者，從而起到了阻止IgAN進展的作用。

IgAN的治療主要包括免疫治療和非免疫治療，治療方案主要包括以下四個方面[17-18]：使IgA免疫復合物的合成減少；限制IgA免疫復合物在系膜區(qū)的沉積；通過拮抗PDGF和TGF的作用，達到抑制細胞增殖和細胞外基質釋放的作用；減輕浸潤性中性粒細胞對腎小球的損害作用。而此次研究證明，白藜蘆醇能夠直接或間接通過多個關鍵環(huán)節(jié)干擾IgAN發(fā)展為ESRD。這些關鍵環(huán)節(jié)包括：使IgA免疫復合物的沉積減少；使系膜區(qū)細胞增殖及細胞外基質的分泌得到抑制；還可以使促纖維化生長因子PDGF-B和TGF-β1的表達下調，從而起到減緩IgAN進展的作用。

綜上所述，白藜蘆醇作為一種細胞保護性藥物可以通過多個環(huán)節(jié)對 IgAN起到明顯的改善作用和延緩疾病進展的作用。此次實驗也將為 IgAN患者的臨床治療提供新的思路。