BoneCeramic和Bio-Oss骨粉對(duì)狗骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化能力影響的比較研究

路佳佳，李偉瓊，許 敏，徐 濤，朱友明，徐建光，張紅艷

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)學(xué)院，安徽省口腔疾病研究中心實(shí)驗(yàn)室，2.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032)

自體骨移植一直被認(rèn)為是治療頜面骨組織缺損的金標(biāo)準(zhǔn)[1]，但是自體骨的采集需要開辟二次術(shù)區(qū)，導(dǎo)致額外的并發(fā)癥，患者常常難以接受[2]，因此，人們對(duì)骨移植替代物的關(guān)注越來越大?！白罴选钡墓且浦蔡娲锊粌H要有良好的生物相容性和促成骨分化性能，還需具有合適的降解速率[3]。臨床上最常見的修復(fù)口腔頜面部缺損的骨移植替代物是Bio-Oss (Geistlich Pharma，Wolhusen，Switzerland)。Bio-Oss屬于天然的異質(zhì)骨移植物，是一種商品化的去蛋白牛骨礦物質(zhì)，由高孔隙率的羥基磷灰石晶體組成，它提供了充足的表面積，為成骨細(xì)胞的遷移和粘附提供了良好的相容性和機(jī)械穩(wěn)定性[4-5]。但在移植后，Bio-Oss的降解速率非常緩慢。文獻(xiàn)報(bào)道在植入后數(shù)年，體內(nèi)仍可觀察到Bio-Oss骨粉材料殘留[6]。臨床上Bio-Oss骨粉通常被用在口腔種植領(lǐng)域，以減少術(shù)后骨重建所導(dǎo)致的骨質(zhì)喪失。

近年來，隨著組織工程學(xué)的不斷發(fā)展，一種新的100%合成骨移植替代物BoneCeramic(Straumann，Basel，Switzerland)已正逐漸用于骨缺損的修復(fù)治療[7]。BoneCeramic是一種雙相磷酸鈣，由60%的羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)和40%的β-磷酸三鈣組成，孔隙率高達(dá)90%，相互連通的孔直徑為100-500μm。文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]，移植后，β-磷酸三鈣可以迅速地吸收并被再生骨完全取代,與此同時(shí)，吸收速度緩慢的HA可作為新血管向內(nèi)生長(zhǎng)和成骨細(xì)胞附著的良好支架。

骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞因其強(qiáng)大的增殖能力、卓越的成骨分化潛能等[10], 成為目前骨組織工程首選的種子干細(xì)胞[11]。其中，狗骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(dog bone marrow mesenchymal stem cells，DBMSCs)具有取材方便, 能夠迅速擴(kuò)增，并在擴(kuò)增過程中保持多向分化潛能，同時(shí)在特定的環(huán)境下能分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，因此，本研究選擇了狗骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

目前，由于缺乏對(duì)這兩種骨粉材料之間標(biāo)準(zhǔn)化的直接科學(xué)比較，合成骨移植材料的促成骨分化性能是否優(yōu)于天然骨移植材料仍然值得探究。因此，本研究旨在比較BoneCeramic骨粉與現(xiàn)今臨床上廣泛使用的Bio-Oss骨粉對(duì)DBMSCs體外成骨分化能力的影響，為骨替代材料的臨床選擇和應(yīng)用提供一定的指導(dǎo)和建議。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器和試劑♂健康比格犬，購于儀征安立卯生物科技有限公司(No 20201207)。BoneCeramic (Straumann，Switzerland，VR294)；Bio-Oss(Geistlich Pharma, Switzerland，81901307);胎牛血清((杭州四季青生物科技公司,18120502);胰酶消化液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，121920191228)、DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司,AF29498406);PBS緩沖劑(美國(guó)Solarbio公司，AF29561133);CCK-8試劑(日本同仁公司，SD787);CO2恒溫孵箱(美國(guó)Therno公司);茜素紅(美國(guó)Sigma公司，MKCF4917);油紅O(美國(guó)Sigma公司， 20190424);堿性磷酸酯酶試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，061820200929) ;PCR引物(上海生物工程股份有限公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Stratagene公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-tek公司);

1.2 方法

1.2.1比格犬骨髓干細(xì)胞(DBMSCs)的體外分離培養(yǎng) 比格犬經(jīng)3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉后，選取髂后脊為穿刺點(diǎn)，碘伏消毒，16號(hào)骨穿刺針穿刺,回抽見混有脂滴的血液，證實(shí)為骨髓,內(nèi)盛500 uL肝素溶液的20 mL注射器抽取10 mL骨髓,加入PBS緩沖液1 ∶1混勻后，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中，用密度梯度離心法培養(yǎng)原代細(xì)胞，該細(xì)胞記為P0代。每隔3 d換液，待細(xì)胞達(dá)到80%-90%融合，加入0.25%胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，此傳代細(xì)胞記為P1代，細(xì)胞代數(shù)標(biāo)記以此類推。

1.2.2DBMSCs成骨、成脂誘導(dǎo)分化 P3代DBMSCs以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，將培養(yǎng)基更換為相應(yīng)的成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基。培養(yǎng)21 d后，棄掉上清液，4%甲醛固定30 min，PBS清洗2次，分別進(jìn)行茜素紅染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成；進(jìn)行油紅O染色,顯微鏡下觀察細(xì)胞中脂滴的形成。

1.2.3CCK-8檢測(cè)兩種骨粉浸提液對(duì)DBMSCs細(xì)胞增殖的影響 無菌條件下分別取Bio-Oss和BoneCeramic兩種骨粉顆粒，將顆粒加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基浸泡(濃度為0.1 kg· L-1)，浸泡48 h后獲得浸提原液,過濾后備用。將DBMSCs以4×107個(gè)·L-1的密度接種在96孔板中，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，將原培養(yǎng)液更換為浸提原液,對(duì)照組不更換培養(yǎng)液，每3 d換液。分別在培養(yǎng)1、3、5 d，加入CCK-8工作液，置于恒溫培養(yǎng)箱2 h，隨后在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4SEM觀察DBMSCs在骨粉表面黏附的情況 無菌環(huán)境下，將Bio-Oss和BoneCeramic顆粒分別放入15 mL離心管中，加入密度為1×109個(gè)·L-1的DBMSCs，培養(yǎng)3 d后，小心吸出培養(yǎng)液，加入2.5%掃描電鏡專用戊二醛，4 ℃固定細(xì)胞12 h后，去除戊二醛，PBS洗滌3次。采用60%、70%、80%、90%和100%的無水乙醇對(duì)細(xì)胞進(jìn)行梯度脫水，每步脫水20 min，臨界點(diǎn)干燥，完成后鍍金90 s，將鍍金后的顆粒于掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.5ALP定量檢測(cè) 無菌環(huán)境下，將Bio-Oss和BoneCeramic顆粒分別平鋪于6孔板皿底中，DBMSCs以5×105個(gè)/孔的密度滴入其中，培養(yǎng)1 d后，將生長(zhǎng)培養(yǎng)基(growth medium，GM)更換為成骨培養(yǎng)基(osteogenic medium，OM)，每2 d換液。Bio-Oss植入細(xì)胞(OM)：A組，BoneCeramic植入細(xì)胞(OM)：B組,純DBMSCs(OM)：C組，純DBMSCs(GM)：D組。應(yīng)用堿性磷酸酶試劑盒檢測(cè)成骨誘導(dǎo)4、7、10 d后細(xì)胞培養(yǎng)上清中堿性磷酸酶的水平。按照堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒操作說明，于酶標(biāo)儀405 nm檢測(cè)各孔吸光光度值，按照公式計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清堿性磷酸酶的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6qRT-PCR檢測(cè) 如上，按照ALP定量檢測(cè)的分組方法和操作步驟，分別于7、14 d后提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行RT-PCR定量檢測(cè)核心結(jié)合因子2 (RUNX2)、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素( OCN)、骨橋蛋白(OPN)基因表達(dá)水平。按TRIzol試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA，使用PrimeScriptTM-PC R kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,以此為模板,用目的基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。PCR引物序列見Tab 1，其中GAPDH為內(nèi)參。

Tab 1 Primers used for quantitative real time PCR

2 結(jié)果

2.1 DBMSCs的體外分離培養(yǎng)密度梯度離心法培養(yǎng)DBMSCs，約3-6 d光鏡下可觀察到原代細(xì)胞開始貼壁，為橢圓形或短梭形，有伸展突起，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞開始變?yōu)殚L(zhǎng)梭形或多角形，經(jīng)2次傳代后即可獲得細(xì)胞形態(tài)均一、貼壁能力強(qiáng)、易于消化的梭形DBMSCs。見Fig 1。

Fig 1 Microscopic morphology of DBMSCs A: DBMSCs on day 5; B-C: DBMSCs of the P2, Magnification: B ×8; C ×16

2.2 DBMSCs的成骨、成脂分化DBMSCs成骨誘導(dǎo)顯示誘導(dǎo)21 d后茜素紅染色可見大量紅染的礦化鈣鹽結(jié)節(jié)沉積；成脂誘導(dǎo)顯示誘導(dǎo)21 d后細(xì)胞內(nèi)可形成脂滴團(tuán), 油紅O染色后呈鮮紅色脂滴泡。見Fig 2。

Fig 2 Osteogenic and lipogenic differentiation of DBMSCs(50×)A: Alizarin red staining; B: Oil red O staining

2.3 CCK-8檢測(cè)兩種骨粉浸提液對(duì)DBMSCs細(xì)胞增殖的影響在加入浸提液的d 1、3、5，Bio-Oss組和BoneCeramic組細(xì)胞OD值相較于對(duì)照組均有增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，BoneCeramic組的細(xì)胞數(shù)量要比Bio-Oss組略高，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見Fig 3。

2.4 掃描電子顯微鏡(SEM)檢測(cè)Fig 4是DBMSCs接種3 d后在Bio-Oss和BoneCeramic兩種骨粉支架材料上的典型掃描電鏡圖像。在Bio-Oss表面觀察到少數(shù)分離的DBMSCs，與Bio-Oss相比，DBMSCs在BoneCeramic骨粉表面分布的更加廣泛。見Fig 4。

2.5 ALP定量檢測(cè)d 4，A組、B組、C組ALP活性均高于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，A組、B組、C組3組之間無明顯差異; d 7, A組、B組、C組ALP 活性均高于D組，A組、B組活性高于C組，B組高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);d 10, A組、B組、C組ALP 活性均高于D組，A組、B組活性高于C組，B組高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見Fig 5、Tab 2。

Fig 3 Effect of bone powder extracts on proliferation of *P<0.05 vs control group

Fig 4 Scanning electron microscopy (SEM)Distribution of DBMSCs on the surfaces of Bio-Oss and BoneCeramic after 3 days of inoculation, the blue arrow points to the cell. Magnification:× 500(a,c);×1000(b,d)

Fig 5 ALP quantitative detection n=6)Group A: Bio-OSS+DBMSCs (OM), Group B: BoneCeramic+DBMSCs (OM), Group C: DBMSCs(OM), group D: DBMSCs(GM) . *P<0.05 vs Group D; #P<0.05 vs Group C; &P<0.05 vs Group A

Tab 2 OD value in ALP quantitative

2.6 qRT-PCR檢測(cè)檢測(cè)成骨相關(guān)基因(OPN、OCN、RUNX-2、ALP)在d 7、14的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果表明：與對(duì)照D組相比，A、B、C 3組的mRNA水平在這幾種成骨相關(guān)基因中都要顯著增高，同時(shí)，B組(BoneCeramic+細(xì)胞)要高于A組(Bio-Oss+細(xì)胞)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。也就是說明DBMSCs在BoneCeramic表面要比Bio-Oss更加有利于其成骨分化。見Fig 6。

3 討論

目前，臨床上最常見的骨移植材料包括自體骨、同種異體骨、異質(zhì)骨以及合成骨移植材料[12]，自體骨是骨移植的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于需要二次手術(shù)，限制了其使用，同種異體骨可以很好的避免二次手術(shù)的問題，但存在著免疫原性的問題[13]，非人類源性的異質(zhì)骨則會(huì)比同種異體骨導(dǎo)致更明顯的免疫學(xué)問題，比如瘋牛病或牛海綿狀腦炎(BSE)[14]。這使得合成骨移植材料在臨床上的運(yùn)用越來越廣泛，BoneCeramic是一種新型的純合成骨移植材料，在臨床上投入廣泛使用之前，必須先在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試。這項(xiàng)研究的目的是比較Bio-Oss和BoneCeramic兩種骨粉材料對(duì)DBMSCs成骨分化的影響。

CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，浸泡了48h的Bio-Oss和BoneCeramic骨粉浸提液對(duì)DBMSCs的增殖沒有抑制作用(Fig 3)；掃描電子顯微鏡(SEM)結(jié)果顯示，相較于Bio-Oss，DBMSCs在BoneCeramic表面分布的更加廣泛(Fig 4)。ALP堿性磷酸酶定量檢測(cè)的結(jié)果得出(Fig 5，Tab 2)，A組(Bio-Oss植入細(xì)胞)和B組(BoneCeramic植入細(xì)胞)與沒有加入骨粉支架的C組相比，ALP的活性明顯增高，說明DBMSCs黏附在骨粉支架表面要比單獨(dú)的細(xì)胞更有利于其成骨分化，這主要是由于骨粉材料的空間結(jié)構(gòu)和三維支架結(jié)構(gòu)拓展了細(xì)胞的生長(zhǎng)空間，使得細(xì)胞和材料的接觸面積變大，減少了接觸抑制，從而更加有利于DBMSCs的成骨分化。同時(shí)B組的ALP活性高于A組，說明在DBMSCs黏附在BoneCeramic表面更有利于成骨分化。qRT-PCR檢測(cè)第4、7、10天相關(guān)成骨基因(OPN、OCN、RUNX-2、ALP)的相對(duì)表達(dá)水平也證實(shí)了ALP的結(jié)果(Fig 6)。綜上所述，Bio-Oss和BoneCeramic這兩種骨粉材料對(duì)狗骨髓干細(xì)胞的細(xì)胞毒性均很低，同時(shí)，相較于Bio-Oss，BoneCeramic能更加的促進(jìn)狗骨髓干細(xì)胞的增殖和成骨分化。

Fig 6 Expression of genes related to osteogenic differentiation detected by RT-PCR(n=5)A: Bio-OSS+DBMSCs (OM)； B: BoneCeramic+DBMSCs (OM) ； C: DBMSCs (OM)； D: DBMSCs (GM) . *P<0.05 , **P<0.001 vs Group C; ▲P<0.05，▲▲P<0.001 vs Group A.

除了生物相容性和成骨性之外，材料的降解也是組織工程學(xué)的重點(diǎn)[15]。BoneCeramic是一種雙相磷酸鈣，由60%的羥基磷灰石(HA)和40%的β-磷酸三鈣組成。HA有著與人體骨骼高度相似的生物相容性和較低的溶解度，因此，廣泛的運(yùn)用在組織工程學(xué)中作為細(xì)胞附著的良好支架。β-磷酸三鈣是一種生物相容性磷酸鈣，已被成功的運(yùn)用到口腔種植上頜竇提升術(shù)中，β-磷酸三鈣它有一個(gè)相對(duì)較晚的重塑期，它的降解主要是通過物質(zhì)的化學(xué)溶解而不是破骨細(xì)胞的再吸收。BoneCeramic結(jié)合了HA的生物相容性和β-磷酸三鈣的良好吸收性，在促進(jìn)骨再生的同時(shí)，BoneCeramic可以在較短的時(shí)間內(nèi)完全被吸收并被再生骨所取代[16]。因此，在需要材料降解的骨組織工程里，也許BoneCeramic會(huì)是一種很好的材料。

本文主要研究一種新型的純合成骨粉材料BoneCeramic，經(jīng)過一系列體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，BoneCeramic與臨床廣泛使用的Bio-Oss相比，有著同樣優(yōu)異的生物相容性，在成骨性能方面甚至要高于Bio-Oss。在未來，應(yīng)該測(cè)試Bio-Oss和BoneCeramic的體內(nèi)生物相容性和成骨性。目前尚不清楚BoneCeramic是如何支持DBMSCs的增殖的，也許應(yīng)該進(jìn)行一些研究以了解其中的機(jī)制作用，這會(huì)更加有利于BoneCeramic在臨床上的廣泛運(yùn)用。