荔枝核總黃酮聯(lián)合紫杉醇對前列腺癌耐藥細胞的增殖抑制作用

張維權(quán)，李小蘭，薛 薇，常 明，郭宏偉

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021；2. 長壽與老年相關(guān)疾病教育部重點實驗室&廣西醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，廣西 南寧 530021；3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)在美國男性惡性腫瘤的發(fā)病率居首位、死亡率居次位[1]。中國PCa患者發(fā)病率近年來呈明顯上升趨勢，而且發(fā)病年齡趨于年輕化[2]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是臨床治療前列腺癌的常用藥物，但在治療過程中多數(shù)患者會出現(xiàn)耐藥，聯(lián)合治療是目前解決紫杉醇腫瘤耐藥的主要手段[3]。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，荔枝核正丁醇提取物和荔枝核總黃酮(total flavonoids of litchi seed，TFLS)具有較好的抗PCa作用[4-5]，但是TFLS對前列腺癌紫杉醇耐藥細胞(prostate cancer paclitaxel resistance cells，PCa-Txr)細胞是否具有抑制作用，能否增強PCa-Txr細胞對PTX的敏感性，以及與PTX聯(lián)合應(yīng)用是否具有協(xié)同抑制作用，尚未得知。因此，本研究主要采用前列腺癌紫杉醇耐藥株P(guān)C3-Txr和DU145-Txr細胞，探討TFLS對PCa-Txr細胞的抑制作用、增敏作用以及TFLS與PTX聯(lián)合應(yīng)用是否存在協(xié)同抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物與試劑荔枝核，南寧生源中藥飲片有限責(zé)任公司，批號181001；紫杉醇，MedChemExpress公司，批號37434；CCK-8試劑盒，博士德生物工程有限公司，批號14K16B99；胎牛血清，Gibco公司，批號2109290CP；RPMI 1640培養(yǎng)基，維森特生物技術(shù)有限公司，批號350006037；0.05%胰酶消化液, 維森特生物技術(shù)有限公司，批號325041009；96孔板，costar公司，批號12619601；95%乙醇，成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號2019021301；HPD-BJQH大孔樹脂，Solarbio公司，批號218A011；其他分析純試劑。

1.2 細胞株人PCa細胞株P(guān)C3和DU145，紫杉醇耐藥細胞株P(guān)C3-Txr，DU145-Txr由“長壽與老年相關(guān)疾病”教育部重點實驗室提供。

1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱，生物安全柜，酶標(biāo)儀，Thermo公司；倒置顯微鏡，OLYMPUS公司。

1.4 方法

1.4.1TFLS的提取與純度標(biāo)定 荔枝核粉末加入三口燒瓶置于加熱攪拌器中，在三口燒瓶中加入10倍50%乙醇，持續(xù)微沸1.5 h。常溫冷卻取清液，殘渣再提取1次，將2次所得溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至適量體積。濃縮液過HPD-BJQH大孔樹脂柱，pH 7.0，20%乙醇洗脫1 h棄掉，70%乙醇洗脫1 h留取。水浴鍋過夜干燥，得TFLS。以兒茶素為標(biāo)準品，采用香草醛-鹽酸法測定兒茶素含量，通過標(biāo)準曲線標(biāo)定TFLS的純度。

1.4.2細胞培養(yǎng) PC3、DU145、PC3-Txr和DU145-Txr細胞均用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于5% CO2、37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次，用0.05%胰酶消化傳代，取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.4.3TFLS和PTX分別對PC3、DU145及PCa-Txr細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板，密度為2 500個/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的藥物(PTX：15.625、31.25、62.5、125、250、500、1×103、5×103、1×104μg·L-1；TFLS：10、20、40、60、80、120、160 mg·L-1)，另設(shè)空白對照組, 每組設(shè)6個復(fù)孔。TFLS與細胞共同培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，PTX與細胞共同培養(yǎng)72 h，每孔加入CCK8試劑10 μL，繼續(xù)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)溫育2 h后，于450 nm波長處測定各孔的吸光度A。比較藥物作用細胞的細胞活性和半數(shù)抑制濃度(the half maximal inhibitory concentration，IC50)。細胞活性/%=(藥物組A/空白組A)×100%。

1.4.4TFLS處理的PC3-Txr和DU145-Txr細胞對PTX敏感性的影響 設(shè)置PTX組，低細胞毒劑量(增殖抑制率<10%)TFLS提前干預(yù)組(pre-TFLS組)和同時給藥組(TFLS+PTX組)。PTX組用不同濃度PTX分別作用于PC3-Txr和DU145-Txr細胞；pre-TFLS組用25 mg·L-1或40 mg·L-1TFLS提前作用PC3-Txr或DU145-Txr細胞72 h后加入不同濃度PTX繼續(xù)與細胞共同培養(yǎng)；TFLS+PTX組在25 mg·L-1或40 mg·L-1TFLS的基礎(chǔ)上加入不同濃度PTX與PC3-Txr或DU145-Txr細胞共同培養(yǎng)。PC3-Txr的PTX濃度為0.625、0.9375、1.25、1.875、2.5、3.75、5 mg·L-1，DU145-Txr的PTX濃度為25、37.5、50、75、100、150、200、400 μg·L-1。每組3個復(fù)孔。藥物與細胞在96孔板內(nèi)共同培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入CCK8試劑10 μL，繼續(xù)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)溫育2 h后，于450 nm波長處測定各孔的吸光度A。比較各藥物組作用PCa-Txr細胞的IC50值變化。

1.4.5TFLS聯(lián)合PTX對PC3-Txr和DU145-Txr的細胞增殖活性的影響 采用Chou[6]推薦的聯(lián)合用藥方案來探討TFLS與PTX的協(xié)同抑制作用，以單一藥物作用細胞IC50值為中心劑量點，劑量范圍在IC5-IC95之間，并選擇藥物作用效果明顯的72 h為作用時間。同一細胞設(shè)置兩個不同的藥物組合比例，分為TFLS組，PTX組和聯(lián)合給藥組(PTX+TFLS)。各組藥物濃度配比詳見Tab 1，每組設(shè)3個復(fù)孔。藥物與細胞共同培養(yǎng)72 h后，每孔加入CCK8試劑10 μL，繼續(xù)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)溫育2 h后，于450 nm波長處測定各孔的吸光度A。比較兩單藥組和聯(lián)合組作用耐藥細胞后的細胞增殖率，依據(jù)聯(lián)合指數(shù)(Combination index，CI)評價兩藥聯(lián)合應(yīng)用的作用方式。CI = (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2，式中(Dx)1、(Dx)2分別表示藥物1、2單獨使用造成x%抑制率的劑量，(D)1、(D)2分別表示藥物1、2聯(lián)合使用造成x%抑制率的劑量。CI>1，兩藥存在拮抗作用；CI<1，兩藥存在協(xié)同作用；CI=1，兩藥存在加和作用。

Tab 1 The concentration ratios of TFLS combined PTX to PCa-Txr cells

2 結(jié)果

2.1 TFLS的含量測定我們以兒茶素為標(biāo)準品，使用香草醛-鹽酸法對荔枝核提取物中的總黃酮含量進行了檢測。經(jīng)測定，回歸方程為：Y=11.262X-0.002 3，R2=0.997 7，計算得：提取物中TFLS的含量為42.61%。

2.2 TFLS和PTX對PC3和DU145及耐藥細胞活性的影響如Fig 1A-D所示，TFLS可明顯抑制PC3、DU145及其耐藥細胞PC3-Txr和DU145-Txr增殖，并呈現(xiàn)一定的時間和劑量依賴性，各時間段IC50詳見Tab 2。其中PC3-Txr和DU145-Txr細胞的72 h IC50分別為87.74 mg·L-1、112.06 mg·L-1，而作用于PC3和DU145細胞的IC50分別為38.90、47.19 mg·L-1，耐藥細胞與親本細胞差異倍數(shù)分別為2.26倍和2.37倍。如Fig 1E-F所示，PTX作用于PC3-Txr和DU145-Txr細胞72 h的IC50分別為2.20 mg·L-1、83.65 μg·L-1，而作用于PC3和DU145細胞的IC50分別為13.63、7.71 μg·L-1，耐藥細胞與親本細胞差異倍數(shù)分別為161.41倍、10.85倍，表明PCa-Txr細胞對PTX為特異性耐藥。

Fig 1 Effects of TFLS and PTX on proliferation of PC3, DU145 and resistant n=3)A-D: Cell viability of PC3, DU145, PC3-Txr and DU145-Txr cells treated with TFLS; E-F: Cell viability of PC3, PC3-Txr, DU145 and DU145-Txr cells treated with PTX for 72 h.

Tab 2 IC50 value of TFLS on PCa and PCa-Txr cells (mg·L-1)

2.3 TFLS處理的PC3-Txr和DU145-Txr細胞對PTX敏感性的影響為了觀察TFLS是否可提高PCa-Txr細胞對PTX敏感性，我們采用低細胞毒劑量的TFLS提前干預(yù)或同時給予不同濃度的PTX作用PC3-Txr和DU145-Txr細胞，觀察TFLS作用24 h、48 h和72 h是否具有增敏的效果。如Fig 2A所示，在25 mg·L-1TFLS作用下，PC3-Txr和DU145-Txr細胞在24 h、48 h和72 h的細胞活性均大于98%，表明25 mg·L-1的 TFLS對PCa-Txr細胞無明顯毒性，因此我們首先觀察了25 mg·L-1的 TFLS對PCa-Txr細胞耐藥敏感性的影響。結(jié)果如Fig 2B-C所示，與PTX組相比，TFLS+PTX組和pre-TFLS組細胞活性在24 h、48 h和72 h均未見明顯差異。TFLS(25 mg·L-1)不論是提前干預(yù)還是與PTX同時作用，均未能降低PTX的IC50值(Tab 3)，提示25 mg·L-1的TFLS不能增強PCa-Txr細胞對PTX的敏感性。為了進一步確認TFLS是否具有增敏效果，我們將TFLS濃度增至40 mg·L-1，如Fig 2D所示，單獨給予40 mg·L-1TFLS作用72 h后，PCa-Txr細胞活性仍大于90%，因此，接下來我們檢測了40 mg·L-1TFLS作用耐藥細胞72 h的增敏活性。如Fig 2E-F所示，與PTX組相比，TFLS+PTX組和pre-TFLS組細胞活性仍未見明顯差異。PTX組、TFLS+PTX組和pre-TFLS組的PTX對PC3-Txr細胞的IC50值分別為2.21、2.09和2.12 mg·L-1；對DU145-Txr細胞的IC50值分別為80.35、79.05和77.31 μg·L-1。提示低細胞毒劑量的TFLS不能增強PCa-Txr細胞對PTX的敏感性。

Fig 2 Effects of PTX on proliferation of PC3-Txr and DU145-Txr cells treated with TFLS A: Cell viability of PC3-Txr and DU145-Txr cells treated with TFLS (25 mg·L-1); B-C: Effects of PTX on the proliferation of PC3-Txr and DU145-Txr cells treated with or without TFLS (25 mg·L-1); D: Cell viability of PC3-Txr and DU145-Txr cells treated with TFLS (40 mg·L-1) for 72 h; E-F: Effects of PTX on the proliferation of PC3-Txr and DU145-Txr cells treated with or without TFLS (40 mg·L-1) for 72 h.

Tab 3 IC50 value of PTX on PC3-Txr and DU145-Txr cells

2.4 TFLS聯(lián)合PTX抑制PC3-Txr和DU145-Txr細胞的增殖能力為了觀察TFLS 和PTX聯(lián)合應(yīng)用對PCa-Txr細胞是否有協(xié)同抑制的作用，我們采用Chou推薦的聯(lián)合給藥方案來探討TFLS與PTX對PC3-Txr和DU145-Txr細胞的協(xié)同抑制效果。結(jié)果顯示，分別與TFLS組、PTX組相比，PTX+TFLS組在TFLS劑量大于100 mg·L-1時抑制PC3-Txr細胞的活性，CI小于1，TFLS與PTX聯(lián)合應(yīng)用抑制PC3-Txr細胞增殖存在協(xié)同作用(Fig 3A-C)；分別與TFLS組、PTX組相比，PTX+TFLS組均能抑制DU145-Txr的細胞活性， CI小于1，TFLS與PTX聯(lián)合應(yīng)用抑制DU145-Txr細胞增殖存在協(xié)同作用(Fig 3D-F)。

Fig 3 Effects of TFLS combined with PTX on proliferation of PC3-Txr and DU145-Txr cells n=3)A-B: Effects of TFLS combined with PTX on the proliferation of PC3-Txr cells; C: Fa-CI plot of PC3-Txr cells; D-E: Effects of TFLS combined with PTX on the proliferation of DU145-Txr cells; F: Fa-CI plot of DU145-Txr cells. *P<0.05, **P<0.01 vs TFLS, PTX; ##P<0.01 vs TFLS.

3 討論

雄激素阻斷療法是目前PCa的主要治療方法，大多數(shù)患者起初對阻斷療法敏感，但后期會逐漸發(fā)展為去勢抵抗性PCa。以紫杉烷類藥物為基礎(chǔ)的化療對去勢抵抗性PCa有很好的治療效果，但半數(shù)患者治療一段時間后會出現(xiàn)PTX耐藥，臨床常常采取紫杉烷類藥物聯(lián)合其他藥物的化療方案來克服紫杉醇耐藥改善PCa患者的預(yù)后[7]。近來研究表明，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在PCa的聯(lián)合化療中發(fā)揮著一定作用，如延長患者生存期、減輕臨床癥狀和減少化療不良反應(yīng)等。荔枝核具有行氣散結(jié)之功，因此不少臨床中醫(yī)師在治療 PCa及其引起的癌痛時常配伍應(yīng)用[8]。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TFLS為荔枝核提取物的主要活性成分[9]，TFLS可靶向AKT/mTOR和NF-κB雙通路，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡進而抑制PCa增殖，減弱PCa細胞EMT進而抑制PCa轉(zhuǎn)移[4]。但是，TFLS對PCa-Txr細胞是否存在抑制作用，TFLS能否增加PCa-Txr細胞對PTX的敏感性，以及TFLS聯(lián)合PTX對PCa-Txr細胞是否存在協(xié)同抑制作用，仍未清楚。

本次實驗結(jié)果表明，TFLS對PC3-Txr和DU145-Txr細胞存在一定的時間-劑量依賴抑制作用，并且PC3-Txr和DU145-Txr細胞對PTX耐藥具有特異性。據(jù)此我們探討了TFLS能否增強PCa-Txr細胞對PTX的敏感性。有研究表明，在藥物劑量未明顯影響腫瘤細胞活性時，天然產(chǎn)物能增加腫瘤細胞對PTX的敏感性[10]。于是我們先后采用兩個低細胞毒性劑量的TFLS提前處理或與PTX同時作用PCa-Txr細胞，觀察不同處理方法下PTX的IC50值，結(jié)果顯示不同處理方法下的PTX各時間段IC50值均無明顯差異，提示TFLS不能增強PCa-Txr細胞對PTX的敏感性。

兩藥或多藥物聯(lián)用，除了增敏作用外，協(xié)同、拮抗和加和作用也是兩藥及多藥聯(lián)合應(yīng)用的評價方式。單一藥物與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用抑制腫瘤進展與惡化往往存在協(xié)同作用，如蟾酥活性成分與索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用抑制肝癌 HepG2 細胞生長[11]，青蒿素聯(lián)合紫杉醇抑制黑色素瘤B16細胞[12]，白藜蘆醇聯(lián)合阿霉素對乳腺癌的抑制作用等[13]。為了進一步探討TFLS與PTX是否存在協(xié)同作用，我們以單一藥物作用耐藥細胞IC50值為中心劑量，劑量范圍在IC5-IC95之間，設(shè)置了兩個不同比例的藥物聯(lián)合作用同一耐藥細胞，觀察TFLS與PTX聯(lián)合應(yīng)用對耐藥細胞的增殖影響，并依據(jù)聯(lián)合指數(shù)來評價兩藥聯(lián)合應(yīng)用的作用方式。結(jié)果顯示，TFLS聯(lián)合PTX能明顯抑制PCa-Txr細胞的增殖，且兩藥抑制DU145-Txr細胞活性更明顯。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，TFLS可明顯抑制PCa的增殖與轉(zhuǎn)移，其分子機制可能與抑制AKT/mTOR和NF-κB信號通路有關(guān)，但對MAPK通路無明顯影響[4]，而PTX可通過靶向MAPK信號通路誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡進而抑制腫瘤增殖[14]。研究顯示AKT/mTOR、NF-κB 和MAPK等通路的異常活化與腫瘤惡化、轉(zhuǎn)移及耐藥等密切相關(guān)[15-16]。單一藥物與PTX聯(lián)合應(yīng)用可靶向AKT和MAPK雙通路協(xié)同地抑制惡性腫瘤，如衣霉素聯(lián)合PTX在體內(nèi)外均能促進細胞凋亡進而抑制乳腺癌[17]，雙重阻斷AKT和MAPK活性能促進結(jié)直腸癌紫杉醇耐藥細胞的凋亡而逆轉(zhuǎn)對紫杉醇的耐藥性[18]。因此，本研究中TFLS聯(lián)合PTX對PCa-Txr細胞增殖的協(xié)同抑制作用，可能與兩藥聯(lián)合靶向不同的信號通路有關(guān)，但其具體機制還有待進一步研究。

綜上所述，TFLS可抑制PCa-Txr細胞的增殖，TFLS與PTX聯(lián)合應(yīng)用對PCa-Txr細胞存在協(xié)同抑制作用，但TFLS未能增加PCa-Txr細胞對PTX的敏感性。