孕期糖皮質(zhì)激素暴露所致子代長骨發(fā)育異常研究進(jìn)展

王佳琪，倪曲波，肖 浩，汪 暉，陳廖斌

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院骨科, 2.發(fā)育源性疾病湖北省重點實驗室, 3.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，湖北 武漢 430071)

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)是腎上腺皮質(zhì)產(chǎn)生的主要激素，在妊娠過程中對胎兒各臟器的分化發(fā)育有一定促進(jìn)作用。人工合成GC用于治療有早產(chǎn)風(fēng)險的孕婦已有近40年歷史，其能通過促進(jìn)肺表面活性物質(zhì)的合成，增強肺表面張力，實現(xiàn)促胎肺成熟，有效減少早產(chǎn)兒呼吸窘迫綜合征發(fā)生和死亡率，但可使胎兒內(nèi)源性GC水平降低。同時，臨床回顧性研究及動物實驗發(fā)現(xiàn)，母親在妊娠期間暴露于尼古丁、乙醇、咖啡因[1]等外源物可導(dǎo)致母體血GC水平異常升高，其可通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，導(dǎo)致胎兒血GC高于正常生理濃度。近年來研究表明，孕期使用人工合成類GC或暴露于不良環(huán)境后所致胎兒血GC水平異常，可引起胎兒神經(jīng)內(nèi)分泌代謝編程改變，導(dǎo)致胎兒低出生體重及多種臟器發(fā)育障礙。已有研究表明，胎源性骨質(zhì)疏松癥與孕期異常GC暴露有關(guān)[2]。因此，胎兒血GC是影響胎兒包括骨在內(nèi)的多器官分化發(fā)育的重要因素?；诖?，該綜述著眼于當(dāng)下孕期GC暴露現(xiàn)狀，對孕期內(nèi)外源性GC暴露所致胎兒長骨發(fā)育異?，F(xiàn)象進(jìn)行總結(jié)，并概述其表觀遺傳學(xué)和內(nèi)分泌代謝編程機制。

1 孕期糖皮質(zhì)激素暴露現(xiàn)狀及分類

由于工業(yè)化導(dǎo)致環(huán)境中各種污染物水平增加，女性孕期與各種不良環(huán)境的接觸機會增多。作為孕期一類常用藥物，人工合成GC(如地塞米松等)在臨床中的應(yīng)用也較為廣泛。

1.1 孕期不良環(huán)境所致母源性糖皮質(zhì)激素過暴露孕期不良環(huán)境是指包括外源環(huán)境因素(如：外源物暴露、微生物感染等)和母體健康因素(如：營養(yǎng)不良、妊娠合并疾病等)在內(nèi)的多種負(fù)面因素。宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation，IUGR)是指各種原因?qū)е碌呐咛セ蛱荷L發(fā)育限制，表現(xiàn)為多器官功能發(fā)育障礙、生長遲緩及低出生體重。不良環(huán)境是除先天因素以外造成胎兒IUGR的重要因素。已知，宮內(nèi)GC對胎兒各臟器的分化發(fā)育有一定促進(jìn)作用，但過高水平GC則會導(dǎo)致胎兒發(fā)育障礙(如:IUGR等)，其潛在機制可能與母體高水平血GC通過胎盤到達(dá)胎兒血中，抑制胎兒下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary- adrenal，HPA)軸，進(jìn)而影響諸多器官發(fā)育有關(guān)。有動物研究表明，大鼠妊娠d 9～20接受尼古丁(2.0 mg·kg-1·d-1)皮下注射,產(chǎn)后早期(出生后d 1、d 7)后代體內(nèi)皮質(zhì)酮水平明顯升高[3]，而產(chǎn)后晚期(出生后d 35、d 60、d 100)則降低，原因是孕期尼古丁暴露導(dǎo)致胎兒母源性GC過暴露，限制了胎兒HPA軸的發(fā)育。同樣，在孕期通過灌胃法給予乙醇4 g·kg-1·d-1的大鼠，檢測到孕d 20胎兒的血清皮質(zhì)酮水平明顯升高[4]。此外，孕期多種不良環(huán)境暴露如外源物、微生物感染、營養(yǎng)、抑郁[5]等，均可導(dǎo)致母源性GC水平升高，使得胎兒血GC也升高，阻礙胎兒宮內(nèi)發(fā)育。以上研究提示，孕期母體外源物暴露會導(dǎo)致胎兒母源性GC過暴露。

1.2 孕期合成類糖皮質(zhì)激素應(yīng)用孕婦在孕期可能使用到的有指征的外源性糖皮質(zhì)激素主要包括：潑尼松、地塞米松、倍他米松、丙酸倍氯米松和氫化可的松。其具體適應(yīng)癥及建議用量詳見Tab 1。值得注意的是，使用這些糖皮質(zhì)激素治療孕期并發(fā)癥的同時，會對胎兒產(chǎn)生不良影響。已有文獻(xiàn)報道，孕期使用大劑量(≥20 mg·d-1)潑尼松有可能導(dǎo)致死胎；孕期使用地塞米松有可能導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩，且會導(dǎo)致子代成年后多種代謝性疾病易感；孕期使用倍他米松有可能導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩及成年后代謝綜合征易感；孕期大劑量(≥1 000 μg/次)使用吸入性糖皮質(zhì)激素倍氯米松有可能導(dǎo)致胎兒先天畸形(主要是肌肉骨骼、心臟發(fā)育畸形)等。根據(jù)美國婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會實踐標(biāo)準(zhǔn)，妊娠24～34周合并早產(chǎn)風(fēng)險的婦女應(yīng)接受單療程地塞米松或倍他米松肌肉注射，接受該治療后d 7～14仍在懷孕的婦女，建議在短期效應(yīng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行多次人工合成GC治療，以此來降低早產(chǎn)風(fēng)險和胎兒死亡率。隨著產(chǎn)前地塞米松治療在臨床上的廣泛應(yīng)用，人們更加需要考慮潛在的后續(xù)不良反應(yīng)。有報道稱，產(chǎn)前地塞米松暴露(prenatal dexamethasone exposure，PDE)與胎兒低出生體重和體型縮小有關(guān)，在妊娠d 9-20的大鼠皮下注射0.2 mg·kg-1·d-1地塞米松，在孕d 20檢測到雌性胎兒血地塞米松濃度為267 nmol·L-1，為母體血清地塞米松濃度的31.6%[6]，即母體內(nèi)地塞米松可進(jìn)入胎兒循環(huán)，并導(dǎo)致胎兒體重下降，IUGR率升高。這提示，將胎兒過度暴露于人工合成GC，增加了后代發(fā)育異常的風(fēng)險。

Tab 1 Indications and dosage of possible glucocorticoid use during pregnancy

2 孕期糖皮質(zhì)激素暴露對子代長骨發(fā)育的近、遠(yuǎn)期影響

骨的發(fā)生起始于胚胎時期，來源于間充質(zhì)，主要有兩種方式，即膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。人體大多數(shù)骨，如四肢骨、軀干骨等，都以軟骨內(nèi)成骨方式發(fā)生。人胚胎從第四周末即開始進(jìn)行軟骨內(nèi)成骨過程。胎兒長骨發(fā)育受血GC調(diào)控，正常的成骨過程建立在合適的血GC水平之上，過早的暴露于高GC(包括內(nèi)源性和外源性)環(huán)境將阻礙長骨發(fā)育過程。

孕期內(nèi)外源性GC暴露對骨發(fā)育具有近期影響和遠(yuǎn)期編程效應(yīng)。其不僅可以在宮內(nèi)阻礙胎兒長骨發(fā)育進(jìn)程，還可引起子代成年后一系列長骨發(fā)育相關(guān)的健康問題和疾病易感。

2.1 出生前后長骨發(fā)育異常生長板(growth plate)是骨骺與骨干之間在次級骨化中心出現(xiàn)后保留的一層軟骨細(xì)胞，是胎兒出生后長骨縱向生長的基礎(chǔ)。在母豬妊娠最后45 d，每2 d肌肉注射地塞米松會導(dǎo)致其雄性后代股骨、脛骨生長板增生、肥大區(qū)厚度明顯變薄[7]。多項流行病學(xué)調(diào)查表明，孕婦攝入咖啡因與胎兒體長增長受損有關(guān)。有動物研究提示，從孕d 11-20給予大鼠咖啡因(120 mg·kg-1·d-1)灌胃，母嬰血GC水平均升高，胎兒體長明顯減少，胎兒股骨生長板中細(xì)胞外基質(zhì)成分合成明顯抑制，生長板中軟骨生成延遲[8]。在另一項動物研究中，用地塞米松誘導(dǎo)骨發(fā)育受損模型，構(gòu)建的大鼠模型也表現(xiàn)出骨生長板狹窄、生長板軟骨細(xì)胞增殖減少、凋亡增加的現(xiàn)象[9]。在小鼠(懷孕平均持續(xù)36～38 d)妊娠d 20開始皮下注射125 mg·kg-1·d-1地塞米松，直至產(chǎn)前，其后代生長板肥大區(qū)厚度明顯變薄，生長板軟骨細(xì)胞蛋白聚糖含量明顯降低[10]，地塞米松暴露會上調(diào)脛骨生長板中糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)的表達(dá)，抑制骨的縱向生長。以上研究結(jié)果表明，孕期GC暴露會明顯抑制長骨生長板的發(fā)育。

骨化中心包括初級骨化中心和次級骨化中心，是軟骨內(nèi)成骨過程中長骨中央和兩端軟骨內(nèi)首先骨化的區(qū)域。孕期給予地塞米松的大鼠，H&E染色顯示股骨初級骨化中心明顯縮短，礦化區(qū)域變小，骨小梁長度變短，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前咖啡因暴露導(dǎo)致的宮內(nèi)高GC環(huán)境也導(dǎo)致胎兒股骨長度明顯縮短，初級骨化中心長度也縮短[11]。另外，孕期外源性地塞米松多次、高濃度、早期暴露對長骨和軟骨發(fā)育有更強的毒性[12]，表現(xiàn)為子代股骨初級骨化中心長度顯著縮短。這些結(jié)果都表明，孕期高GC會顯著影響長骨初級骨化中心的發(fā)育。

2.2 成年后骨質(zhì)疏松癥易感及可遺傳性峰值骨量是人或動物一生中骨礦物質(zhì)組織的最高含量，它可以反映骨骼的健康狀況。在人類中，青春期骨質(zhì)積聚的峰值率在11～14歲之間(6～12周齡的幼鼠)，成年后最高峰在20～35歲之間(7～9月大鼠)。出生前24 d給予地塞米松的仔豬出生時即表現(xiàn)為長骨骨密度、骨礦含量降低[13]。一項對雞胚的研究證明，產(chǎn)前地塞米松暴露可致發(fā)育中的雞胚長骨縮短，并加速鈣鹽的沉積，降低骨量[14]。本實驗室動物研究表明，產(chǎn)前地塞米松暴露可顯著降低雄性子代峰值骨量，其骨量的降低從孕20 d一直持續(xù)到生后28周，并可以延續(xù)到孫代(雄性)，其機制與地塞米松介導(dǎo)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)組蛋白乙?；鰪娪嘘P(guān)。

孕期不良環(huán)境暴露和直接使用人工合成GC都會導(dǎo)致母嬰血GC水平升高，引起胎兒發(fā)育遲緩和低出生體重，最終導(dǎo)致成年后骨質(zhì)疏松癥易感。對大量臨床隨訪總結(jié)發(fā)現(xiàn)，在懷孕期間暴露于地塞米松會影響胚胎的成骨作用，主要原因可能是地塞米松在發(fā)育過程中對骨祖細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。部分較早的臨床研究表明，孕期因治療早產(chǎn)所使用地塞米松治療會影響產(chǎn)后胎兒的骨礦化[15]。

最新研究提示，孕期咖啡因暴露所致的母源性高GC，可以通過激活后代骨局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin-system，RAS)、抑制胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF1)的表達(dá)，抑制后代長骨發(fā)育，導(dǎo)致子代成年后骨質(zhì)疏松癥易感。孕期尼古丁暴露可以通過升高母體皮質(zhì)酮，影響成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的分化進(jìn)程，延遲后代初級骨化中心的形成。后續(xù)研究表明，孕d 9～20適量地塞米松暴露會延緩胎鼠長骨發(fā)育、降低后代峰值骨量、增加成年鼠骨質(zhì)疏松癥易感性[16]，并且胎鼠峰值骨量的降低具有代際遺傳效應(yīng)。以上研究結(jié)果都提示，孕期內(nèi)源性高GC以及一定劑量的地塞米松暴露，可以導(dǎo)致后代成年后骨質(zhì)疏松癥的易感性顯著升高，且這一改變具有代際遺傳的特點。

3 孕期糖皮質(zhì)激素暴露所致長骨發(fā)育異常的發(fā)生機制

宮內(nèi)長骨的發(fā)育異常機制，主要與宮內(nèi)異常GC暴露下骨發(fā)育過程中相關(guān)細(xì)胞的發(fā)育異常、骨發(fā)育相關(guān)基因表觀遺傳學(xué)修飾和內(nèi)分泌代謝編程改變有關(guān)。孕期不良環(huán)境所致的母體內(nèi)分泌代謝紊亂是后代多種代謝性疾病易感的一個主要因素。HPA軸是機體重要的神經(jīng)內(nèi)分泌軸，孕期不良環(huán)境(如：外源物暴露、合成類糖皮質(zhì)激素直接應(yīng)用)一方面可以破壞胎盤中滅活GC的11β-羥類固醇脫氫酶2(11β-HSD2)，破壞胎盤對母體來源GC的屏障功能；另一方面可直接或間接使母親HPA軸活性增加，使其效應(yīng)器官——腎上腺分泌功能旺盛。兩者合力使得胎兒血GC水平異常，導(dǎo)致胎兒包括骨在內(nèi)的多器官發(fā)育障礙。

參與骨發(fā)育的細(xì)胞主要包括軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。軟骨內(nèi)骨化過程中軟骨細(xì)胞的肥大、凋亡與后續(xù)成骨細(xì)胞分化關(guān)系密切。肥大前及肥大早期由軟骨細(xì)胞分泌的印度刺猬(Indian hedgehog ，IHH)蛋白控制著成骨細(xì)胞分化的開始。成骨細(xì)胞和生長板軟骨細(xì)胞可以表達(dá)腎上腺素B2(Ephrin B2)等多種蛋白，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化并抑制破骨細(xì)胞形成，同時破骨細(xì)胞以打隧道的方式溶解吸收退化的軟骨組織。由肥大的軟骨細(xì)胞高度表達(dá)和分泌的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)能直接刺激骨血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化、增殖和分裂，從而刺激骨血管生成。綜上所述，在軟骨內(nèi)骨化過程中各細(xì)胞分化發(fā)育息息相關(guān)。

3.1 軟骨細(xì)胞相關(guān)機制早在1997年就有研究指出，產(chǎn)前用人工合成GC(曲安奈德)處理的母鼠，其子代肱骨生長板軟骨細(xì)胞排列更加紊亂[17]。長骨生長板軟骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在宮內(nèi)骨骼生長中起著重要作用。IGF1相關(guān)信號通路是機體內(nèi)調(diào)控內(nèi)分泌系統(tǒng)的主要通路之一，其參與包括骨在內(nèi)的多種組織和器官的分化發(fā)育，IGF1/IRS途徑通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞早期發(fā)育過程中PI3K/Akt磷酸化來調(diào)節(jié)ECM蛋白的合成。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號也參與各種骨細(xì)胞的存活、粘附、增殖、遷移和分化。內(nèi)源性高GC首先通過降低胎兒生長板軟骨細(xì)胞中IGF1啟動子區(qū)域的H3K9和H3K27乙?；?，導(dǎo)致IGF1蛋白表達(dá)水平降低，且IGF1R、IRS1和AKT1/2的蛋白表達(dá)水平也呈降低趨勢，整體上降低軟骨細(xì)胞ECM合成[18]；其次，內(nèi)源性高GC上調(diào)絲裂原誘導(dǎo)基因6(mitogen-inducible gene，Mig-6)的表達(dá)，由此抑制軟骨細(xì)胞中EGFR / c-Jun N末端激酶(JNK)信號通路和末端分化基因的表達(dá)并減少軟骨細(xì)胞凋亡，延緩軟骨內(nèi)成骨進(jìn)程[19]，兩者合力最終導(dǎo)致胎兒長骨發(fā)育遲緩。以上研究提示，內(nèi)源性高水平GC在降低軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成的同時延緩軟骨細(xì)胞終末分化和凋亡，阻礙軟骨內(nèi)成骨的進(jìn)程。

3.2 成骨細(xì)胞相關(guān)機制成骨細(xì)胞是貼附于軟骨基質(zhì)表面形成新生骨組織的主力軍。RAS具有調(diào)節(jié)局部細(xì)胞分化的作用，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡。另外，在軟骨ECM合成調(diào)節(jié)中發(fā)揮主要作用的IGF1，在間充質(zhì)干細(xì)胞的定向分化中也起到至關(guān)重要的作用。外源性GC(地塞米松)一方面增強骨局部ACE啟動子區(qū)H3K9和H3K27乙?；剑⒃黾友芫o張素II(angiotensin II，Ang II)表達(dá)水平，表現(xiàn)為骨局部RAS激活，從而降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。此外，該表觀遺傳學(xué)改變原理還與孕期接觸外源物種類有關(guān)。如導(dǎo)致內(nèi)源性GC水平升高的乙醇(ethanol)會介導(dǎo)早期生長反應(yīng)因子1的高表達(dá)并促進(jìn)其進(jìn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞核，介導(dǎo)ACE啟動子區(qū)乙?；缴遊20]；導(dǎo)致內(nèi)源性GC水平升高的尼古丁(nicotine)通過作用于α4β2-煙堿乙酰膽堿受體(α4β2-nAChR)，誘導(dǎo)組蛋白乙?；竝300進(jìn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞核，導(dǎo)致ACE啟動子區(qū)H3K9乙酰化水平增加等[21]。另一方面內(nèi)源性高GC通過誘導(dǎo)糖皮質(zhì)激素受體(GR)進(jìn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞核內(nèi)，募集增強子結(jié)合蛋白α，分別降低成骨細(xì)胞中IGF1的 H3K9和H3K14組蛋白乙酰化水平，導(dǎo)致長骨局部IGF1表達(dá)降低，使得長骨內(nèi)諸如Runx2、Osterix、Ⅰ型膠原等多種成骨分化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)降低[22]，最終導(dǎo)致成骨分化障礙，此表觀遺傳學(xué)改變可以延遲到出生后。本實驗室由此提出胎源性疾病宮內(nèi)編程的GC-胰島素樣生長因子1(GC-insulin-like growth factor 1，GC-IGF1)軸理論：即宮內(nèi)高濃度的GC通過表觀遺傳學(xué)機制抑制IGF1的表達(dá)，骨發(fā)育受到影響；胎兒出生后脫離宮內(nèi)高GC環(huán)境，IGF1表達(dá)有所恢復(fù)，但個體對環(huán)境刺激的敏感性增加，更易受到環(huán)境對個體造成的損傷作用。GC對胎兒產(chǎn)生的表觀遺傳學(xué)影響大多是通過促進(jìn)局部組織細(xì)胞內(nèi)GR核轉(zhuǎn)位實現(xiàn)的。

3.3 破骨細(xì)胞相關(guān)機制在骨發(fā)育過程中，隨著血管、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及其祖細(xì)胞侵入肥大軟骨細(xì)胞區(qū)，破骨細(xì)胞降解礦化的肥大軟骨細(xì)胞，為骨細(xì)胞的沉積提供空間。因此從長骨發(fā)生的角度來講，破骨細(xì)胞數(shù)量的增加會加速礦化軟骨基質(zhì)的降解，從而增強軟骨內(nèi)骨化。核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)及其受體RNAK和其誘餌受體骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成的關(guān)鍵分子，參與骨發(fā)育和骨代謝。孕期內(nèi)源性高GC暴露的胎兒經(jīng)TRAP染色顯示，股骨軟骨-骨交界處破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少。雖然RANKL的mRNA表達(dá)沒有明顯受到GC的影響，但骨局部OPG mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，使得骨局部RNAKL/OPG比值顯著降低，因此軟骨-骨交界處破骨細(xì)胞數(shù)量也降低，延遲了軟骨內(nèi)成骨進(jìn)程[23]。但在體外，外源性GC(如地塞米松)可以刺激破骨細(xì)胞的增殖和分化，抑制成熟破骨細(xì)胞的骨吸收活性[24]，體現(xiàn)GC作用的雙相性，原因可能和個體發(fā)育階段有關(guān)。

3.4 血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)機制VEGF-A是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的結(jié)合生長因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加血管通透性。外源性GC(如地塞米松)暴露可使軟骨細(xì)胞VEGF-A表達(dá)增強，促進(jìn)雛雞胚胎中趾骨內(nèi)的血管生成、增殖和遷移。內(nèi)源性高GC還會降低胎盤VEGF120和VEGF188亞型的表達(dá)，并在短期內(nèi)阻止正常胎盤迷宮血管的發(fā)育[25]。由于GC可以通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，由此我們可以推測，內(nèi)、外源性GC可能通過誘導(dǎo)骨局部VEGF相關(guān)亞型表達(dá)降低，從而抑制骨局部血管生成，抑制骨發(fā)育。

4 總結(jié)展望

綜上所述，孕期內(nèi)、外源性GC暴露會對子代長骨發(fā)育產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，其發(fā)生機制見Fig 1。由于臨床產(chǎn)科地塞米松應(yīng)用的劑量、時間、療程不盡相同，因此不同孕期、不同濃度、不同療程應(yīng)用地塞米松對胎兒骨發(fā)育、出生后骨量增長、骨代謝性疾病易感性影響尚不明確。人們使用地塞米松等對早產(chǎn)、反復(fù)流產(chǎn)等進(jìn)行預(yù)防與治療的同時，有必要篩選合理的劑量、時間范圍。另外，宮內(nèi)GC對后代骨發(fā)育影響的代際遺傳效應(yīng)已經(jīng)被證明，但這種代際遺傳效應(yīng)最終能持續(xù)多少代仍有待進(jìn)一步研究。

Fig 1 Long bone dysplasia mechanism caused by glucocorticoid exposure during pregnancy