探討變色酸2R－亮綠在腎活檢組織染色中的應(yīng)用

姚 倫，劉樹(shù)軍，高 丹，婁 巖，韓 梅＊

（1.吉林省人民醫(yī)院凱旋院區(qū)綜合內(nèi)科，吉林長(zhǎng)春130052；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院）

探討變色酸2R－亮綠在腎活檢組織染色中的應(yīng)用

姚 倫1，劉樹(shù)軍2，高 丹2，婁 巖2，韓 梅2＊

（1.吉林省人民醫(yī)院凱旋院區(qū)綜合內(nèi)科，吉林長(zhǎng)春130052；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院）

目前腎活檢病理特殊染色是確診腎臟疾病病理類(lèi)型的主要手段，Masson三色染色法是腎活檢病理特殊染色主要方法之一，主要反映腎小球內(nèi)免疫復(fù)合物沉積及膠原纖維增生等情況，有效反映腎小球內(nèi)免疫復(fù)合物沉積的形態(tài)和特征，對(duì)腎臟疾病病理診斷起到?jīng)Q定性的作用［1］。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)變色酸2R－亮綠法不僅能達(dá)到傳統(tǒng)Masson三色染色法的效果，同時(shí)也縮短了染色時(shí)間，簡(jiǎn)化了染色步驟。本文將變色酸2R－亮綠法所示腎小球內(nèi)免疫復(fù)合物沉積的形態(tài)和部位與免疫熒光和電鏡（TEM）比較，以驗(yàn)證變色酸2R－亮綠法在腎活檢組織染色中應(yīng)用的可行性和可重復(fù)性，以評(píng)價(jià)其臨床推廣意義。

1 材料與方法

1.1 材料 選取吉林大學(xué)第二醫(yī)院腎病內(nèi)科2012年1月至2014年12月，腎穿刺活檢組織標(biāo)本842例，每例標(biāo)本分成光鏡、免疫熒光、透射電鏡（TEM）三部分。光鏡標(biāo)本制作成2μm病理切片，行變色酸2R－亮綠染色；免疫熒光標(biāo)本制作成3μm免疫熒光切片，行IgG、IgA、IgM、C1q、C3、C4、Fib、HB－sAg、HBcAg、HBeAg染色；TEM標(biāo)本送于北京大學(xué)第一院電鏡室，行醋酸雙氧鈾－檸檬酸鉛染色和TEM檢查。染色結(jié)果均由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行評(píng)價(jià)和診斷。

1.2 染液配制方法 變色酸2R－亮綠染液：磷鎢酸3.2g，冰醋酸4ml，變色液2R2.0g，亮綠1.7g，蒸餾水400ml。

1.3 染色方法 1）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；2）媒染劑（10%三氯醋酸、10%重鉻酸鉀等量混合）15min，流水沖洗；3）Harris蘇木精染液3min，流水沖洗；4）1%鹽酸－酒精分化數(shù)秒，流水沖洗；5）弱氨水返藍(lán)數(shù)秒，流水沖洗；6）變色酸2R－亮綠染液數(shù)秒；7）0.2%冰醋酸水溶液數(shù)秒；8）95%乙醇快速脫水；9）無(wú)水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固。

2 結(jié)果

2.1 IgA腎?。↖gAN）免疫熒光、TEM、光鏡比較

免疫熒光證明IgA（＋＋）、C3（＋）呈團(tuán)塊狀沉積于腎小球系膜區(qū)（圖1，A）。TEM檢查證明腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕度增生，系膜區(qū)和副系膜區(qū)塊狀電子致密物沉積，基底膜無(wú)明顯病變，上皮足突節(jié)段融合（圖1，B）。變色酸2R－亮綠染色法顯示腎小球系膜區(qū)有紅色物質(zhì)沉積，即免疫復(fù)合物所沉積部位，系膜區(qū)及毛細(xì)血管襻被染成綠色，其中綠色的系膜區(qū)較正常的腎小球?qū)挻螅崾鞠的せ|(zhì)增生（圖1，C）。變色酸2R－亮綠法所示IgA腎病免疫復(fù)合物沉積的形態(tài)和部位與免疫熒光和TEM一致。

圖1 IgAN（Lee分級(jí)2級(jí)） A：免疫熒光IgA（＋＋）呈團(tuán)塊狀沉積于腎小球系膜區(qū)；B：TEM顯示電子致密物系膜區(qū)和副系膜區(qū)塊狀沉積；C：變色酸2R－亮綠染色法顯示免疫復(fù)合物沉積于腎小球系膜區(qū)，系膜基質(zhì)增生

2.2 膜性腎?。∕N）免疫熒光、TEM、光鏡比較

免疫熒光證明IgG（＋＋＋）、C3（＋＋）呈顆粒狀沿腎小球毛血管襻呈均勻沉積（圖2，A）。TEM檢查證明腎小球基底膜大部分增厚，節(jié)段釘突樣增生，上皮下多數(shù)塊狀電子致密物沉積，上皮足突廣泛融合（圖2，B）。變色酸2R－亮綠染色法所示上皮下有紅色物質(zhì)沉積，即免疫復(fù)合物沉積部位，同時(shí)綠染基底膜均質(zhì)增厚（圖2，C）。變色酸2R－亮綠法所示MN免疫復(fù)合物沉積的形態(tài)和部位與免疫熒光和TEM一致。

圖2 MN（Ⅱ期） A：免疫熒光IgG（＋＋＋）呈顆粒狀沿腎小球毛血管襻呈均勻沉積；B：TEM腎小球基底膜節(jié)段釘突樣增生，上皮下多數(shù)塊狀電子致密物沉積；C：變色酸2R－亮綠染色法顯示免疫復(fù)合沉積于腎小球上皮下，基底膜均勻增厚

2.3 狼瘡性腎炎（LN）免疫熒光、TEM、光鏡比較

免疫熒光證明IgG（＋＋）、IgA（＋＋）、IgM（＋）、C1q（＋＋）、C3（＋＋）、C4（＋＋）及Fib（＋）在腎小球毛細(xì)血管襻呈顆粒狀沉積（圖3，A）。TEM檢查證明腎小球內(nèi)節(jié)段性?xún)?nèi)皮下、上皮下少量電子致密物沉積，上皮足突廣泛融合（圖3，B）。變色酸2R－亮綠法所示LN內(nèi)皮下有及上皮下紅色免疫復(fù)合物沉積，部分呈“白金耳”樣損害（圖3，C）。變色酸2R－亮綠法所示LN免疫復(fù)合物沉積的形態(tài)和部位與免疫熒光及TEM結(jié)果一致。

2.4 乙肝相關(guān)性腎炎（HBVN）免疫熒光、TEM、光鏡比較

免疫熒光證明IgG（＋＋）、IgA（＋＋）、C1q（＋＋）、C3（＋＋）、HBsAg（＋＋）、HBcAg（＋＋）呈顆粒狀均勻沉積于腎小球毛細(xì)血管襻，少許呈團(tuán)塊狀在系膜區(qū)沉積（圖4，A）。TEM檢查證明腎小球上皮下、基底膜內(nèi)、節(jié)段性系膜區(qū)及副系膜區(qū)塊狀電子致密物沉積，基底膜大部分不規(guī)則增厚，上皮足突廣泛融合（圖4，B）。變色酸2R－亮綠法所示HBVN內(nèi)皮下有彌漫性的紅色物質(zhì)沉積，系膜區(qū)有少許紅色物質(zhì)沉積，即免疫復(fù)合物沉積的部位，綠染腎小球系膜基質(zhì)和基底膜提示系膜基質(zhì)節(jié)段性輕度增生及基底膜增厚（圖4，C）。變色酸2R－亮綠法所示HBVN免疫復(fù)合物沉積的形態(tài)和部位與免疫熒光及TEM一致。

圖3 LN（IV－G（A）） A：免疫熒光IgG（＋＋）呈顆粒狀沿腎小球毛細(xì)血管襻沉積；B：TEM腎小球內(nèi)節(jié)段性?xún)?nèi)皮下、上皮下少量電子致密物沉積，上皮足突廣泛融合；C：變色酸2R－亮綠法顯示毛細(xì)血管襻內(nèi)皮下有及上皮下免疫復(fù)合物沉積，部分呈“白金耳”樣損害。

圖4 HBVN A：免疫熒光HBcAg（＋＋）呈顆粒狀均勻沉積于腎小球毛細(xì)血管襻，少許呈團(tuán)塊狀在系膜區(qū)沉積；B：TEM腎小球上皮下、基底膜內(nèi)、節(jié)段性系膜區(qū)及副系膜區(qū)塊狀電子致密物沉積，上皮足突廣泛融合；C：變色酸2R－亮綠法顯示腎小球內(nèi)皮下及系膜區(qū)有均有免疫復(fù)合物沉積，系膜基質(zhì)輕度增生、基底膜增厚

2.5 膜增生性腎小球腎炎（MPGN）免疫熒光、TEM、光鏡比較

免疫熒光證明IgG（＋＋）、C3（＋＋）、C1q（＋＋＋）、IgM（＋＋）呈顆粒狀沿腎小球毛血管襻呈均勻沉積（圖5，A）。TEM檢查證明腎小球上皮細(xì)胞腫脹、足突消失，內(nèi)皮、系膜區(qū)及節(jié)段電子致密物沉積（圖5，B）。變色酸2R－亮綠染色法所示上皮下、內(nèi)皮下及系膜區(qū)少許有紅色免疫復(fù)合物沉積，同時(shí)綠染基底膜均質(zhì)增厚、基質(zhì)增多（圖5，C）。變色酸2R－亮綠法所示MPGN免疫復(fù)合物沉積的形態(tài)和部位與免疫熒光及TEM一致。

圖5 MPGN C3（＋＋） A：免疫熒光IgG（＋＋）呈顆粒狀沿腎小球毛細(xì)血管襻沉積；B：TEM證明腎小球上皮細(xì)胞腫脹、足突消失，內(nèi)皮、系膜區(qū)及節(jié)段電子致密物沉積；C：變色酸2R－亮綠法顯示上皮下、內(nèi)皮下及系膜區(qū)有少許免疫復(fù)合物沉積，同時(shí)綠染基底膜均質(zhì)增厚、基質(zhì)增多

2.6 非免疫介導(dǎo)的腎小球疾病免疫熒光、TEM、光鏡比較

微小病變型腎?。∕CN）免疫熒光證明免疫熒光均為陰性，即腎小球系膜區(qū)和毛細(xì)血管襻均無(wú)免疫復(fù)合物沉積（圖6，A）。TEM檢查證明腎小球各部位均無(wú)電子致密物沉積（圖6，A）。變色酸2R－亮綠染色法則均顯示無(wú)免疫復(fù)合物沉積（圖6，C）。在非免疫復(fù)合沉積引起的腎小球疾病的診斷中，變色酸2R－亮綠染法能夠正確的“還原”腎小球病變，無(wú)假陽(yáng)性情況，進(jìn)而提高臨床診斷的準(zhǔn)確率。

圖6 MCN A：免疫熒光均為陰性；B：TEM腎小球各部位均無(wú)電子致密物沉積；C：變色酸2R－亮綠法顯示無(wú)免疫復(fù)合物沉積

3 討論

腎組織病理檢查是腎臟疾病診斷，指導(dǎo)治療，判斷預(yù)后及腎臟病研究中不可缺少的手段［2］。腎組織病理切片通過(guò)特殊染色可顯示標(biāo)本中沉積的特殊物質(zhì)，如免疫復(fù)合物和淀粉樣變性等，目前顯示腎臟疾病中免疫復(fù)合沉積的形態(tài)和部位的主要方法是傳統(tǒng)Masson三色染色法，但病理組織染色與陰離子染料分子的大小和組織的滲透性有關(guān)。染料的分子大小，主要依靠分子量來(lái)體現(xiàn)，小分子量易穿透結(jié)構(gòu)致密滲透性低的組織，而大分子只能進(jìn)入結(jié)構(gòu)疏松滲透性高的組織［3］，而傳統(tǒng)Masson三色染色法中的麗春紅和酸性品紅的分子量為480.42和585.53，而變色酸2R的分子量為468.36［4］，故變色酸2R較前兩者更容易穿透結(jié)構(gòu)致密的肌纖維，著色也較為鮮紅；傳統(tǒng)Masson三色染色法中苯胺藍(lán)分子質(zhì)量為737.72，而亮綠分子質(zhì)量分為792.72［3］，故亮綠分子較容易與腎臟疏松的膠原纖維結(jié)合，使腎小球基膜、腎小球基底膜、系膜基質(zhì)及腎間質(zhì)呈綠色，并且染色對(duì)比度優(yōu)于苯胺藍(lán)。

因此將變色酸2R－亮綠染色法應(yīng)用于腎臟病理的染色，變色酸2R和亮綠分別代替?zhèn)鹘y(tǒng)Masson三色染色法中的麗春紅、酸性品紅和苯胺藍(lán)，經(jīng)大量臨床實(shí)踐證明變色酸2R－亮綠染色法染色結(jié)果鮮艷，對(duì)比度明顯，步驟簡(jiǎn)單，節(jié)省實(shí)踐，總體來(lái)講優(yōu)于傳統(tǒng)Masson三色染色法。

變色酸2R－亮綠染色法染色結(jié)果顯示免疫復(fù)合物為紅色、細(xì)胞核為淡紅色、膠原纖維為綠色、肌纖維為紅色。經(jīng)過(guò)臨床實(shí)踐證明變色酸2R－亮綠染色法較準(zhǔn)確反應(yīng)腎小球疾病免疫復(fù)合物沉積的部位和形態(tài)，并且與TEM和免疫熒光一致，較大程度提高臨床診斷率，為臨床治療提供有力依據(jù)。但經(jīng)變色酸2R－亮綠染色法處理的切片，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間存放易褪色，如何避免變色酸2R－亮綠染色切片褪色，對(duì)此需要再做進(jìn)一步研究。

［1］劉 暢，楊 琪，何志軍.腎穿刺病理制片中特殊染色的問(wèn)題及對(duì)策［J］.診斷病理學(xué)雜志，2014，21（5）.313.

［2］王玉芳，徐曉艷，武 彥.常用特殊染色在病理診斷中的應(yīng)用［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，2013，20（12）.1357.

［3］李繼承.組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：22－26.

［4］李健東.變色酸2R－亮綠染色法在面神經(jīng)髓鞘染色中的應(yīng)用［J］.中國(guó)耳鼻喉頭頸外科，2004，11（4）：259.

姚倫（1962－），男，學(xué)士學(xué)位，主任醫(yī)師，主要從事腎臟疾病及血液凈化研究。

2015－01－12）

1007－4287（2015）10－1777－03

＊通訊作者