丹參素治療妊娠期高血壓大鼠效果及機制探討

劉莎莎，孫國強，吳利榮

1 湖北省婦幼保健院，武漢430070；2 武漢科技大學附屬漢陽醫(yī)院

妊娠期高血壓（PIH）一般發(fā)生于妊娠20 周后，以高血壓、蛋白尿、水腫為主要臨床癥狀并伴全身性多臟器損害［1-2］。PIH 病因和發(fā)病機制復雜，是導致孕婦和胎兒死亡的主要原因［3-4］。胎兒正常生長發(fā)育需要胎盤建立豐富的血管網(wǎng)絡和滋養(yǎng)層細胞。在PIH 過程中，胎盤組織所分泌的生長因子水平變化對胎盤形成及胎兒發(fā)育過程起重要作用［5-6］。血管內皮生長因子受體1（sFlt-1）、胎盤生長因子（PLGF）可由胎盤分泌，是血管內皮生長因子（VEGF）家族成員，參與胎盤滋養(yǎng)層細胞侵襲和分化、胎盤絨毛膜血管形成及胚胎發(fā)育過程，二者表達異常與PIH 發(fā)病關系密切［7-8］。中藥丹參能破宿血、生新血、安生胎、落死胎、止崩中帶下，為調經脈之神品，其提取物丹參素具有降低血壓、軟化血管、改善血液黏度等藥理作用［9-10］。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)，丹參對PIH 有較好的治療效果［11-12］，然而具有降壓和軟化血管作用的丹參素對PIH 過程中PLGF、sFlt-1 表達及血管功能的影響，目前報道較少。2018 年1 月—2020 年2月，本研究觀察了丹參素對大鼠PIH模型的治療作用，并從PLGF、sFlt-1表達及血管功能方面探討相關治療機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 健康雌性SPF 清潔級SD 大鼠（6～7 周齡，體質量200～220 g）購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心［SCXK（粵）2018-0002］，飼養(yǎng)于本院動物飼養(yǎng)中心。飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食，溫度25 ℃，相對濕度50%。本研究經本院動物倫理委員會批準，批號為IACUC-01（20160917）。實驗嚴格遵循3R原則。丹參素注射液（規(guī)格10 mg）購自北京索萊寶科技有限公司。一氧化氮合酶（eNOs）抑制劑亞硝基左旋精氛酸甲酯（規(guī)格5 g）購自南京奧多福生物科技有限公司。HE 染色試劑盒購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司。24 h尿蛋白試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。一氧化氮（NO）試劑盒購自上海研生實業(yè)有限公司。sFlt-1抗體、PLGF抗體、磷酸化eNOs（p-eNOs）抗體購自美國Abcam 公司。細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒購自上海三抒生物科技有限公司。BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶購自美國Pierce 公司。手動輪轉式切片機購自德國Leica 公司。光學顯微鏡購自日本尼康公司。蛋白電泳儀、半干轉膜儀購自美國Bio-Rad 公司。凝膠成像儀購自Miulab公司。

1.2 PIH 模型建立、分組及給藥方法 參照肖麗等［12］的方法，將雌雄大鼠混養(yǎng)，次日檢查雌性大鼠陰道精子，挑選出有精子的雌性大鼠70 只單獨飼養(yǎng)，并記為妊娠第1 天，于妊娠第14天隨機從70 只孕鼠中選出60 只經靜脈注射亞硝基左旋精氛酸甲酯（7 mg/kg、1次/天、連續(xù)4 d）建立PIH模型，用小動物血壓計檢測大鼠尾動脈收縮壓，若血壓高于110 mmHg視為造模成功。將造模成功的50 只孕鼠隨機分為PIH 組，丹參素低、中、高劑量組以及陽性對照組，每組10 只。妊娠第18天，丹參素低、中、高劑量組和陽性對照組分別經尾部肌肉注射5、10、20 mg/kg的丹參素和100 mg/kg 的硫酸鎂［12-13］，1 次/天，共給藥3 d；PIH 組只造模不給予其他藥物。10只未造模的孕鼠為正常組，給予尾靜脈注射生理鹽水，1次/天，共3 d。

1.3 血壓、尿蛋白監(jiān)測 于妊娠第20 天末次給藥6 h 后收集大鼠24 h 尿液，取1 mL 用考馬斯亮藍法檢測24 h 尿蛋白量。于妊娠第21 天采用小動物血壓測量計，借助生物信號采樣分析系統(tǒng)，通過套尾法測定大鼠尾動脈收縮壓。

1.4 胎鼠體質量、體長及畸形率、死亡率檢測 各組大鼠在進行完“1.3”實驗后，立即行剖宮術，小心取出胎鼠，并測定各胎鼠身長、體質量，統(tǒng)計畸形率、死亡率。

1.5 胎盤質量及胎盤損傷情況觀察 胎盤稱重后，取0.5 g 胎盤組織剪碎，用組織研磨器勻漿，離心后取上清液，置于－20 ℃冰箱中保存，剩余胎盤組織于4% 多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)透明、浸蠟、包埋，切成厚度為5 μm 的切片。行HE 染色，顯微鏡下觀察胎盤組織絨毛形態(tài)變化。

1.6 血清NO 及胎盤組織中sFlt-1、PLGF、p-eNOs蛋白檢測 各組大鼠用3% 戊巴比妥鈉麻醉，取腹主動脈血5 mL，靜置、離心后取上清液，按ELISA 試劑盒說明書檢測血清NO。取組織勻漿液，于4 ℃冰箱中解凍后，用蛋白提取試劑盒及BCA 試劑盒提取蛋白并檢測蛋白總濃度，取50 μg 蛋白上樣，進行電泳和轉膜反應，加入5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h 后，加入一抗（sFlt-1、PLGF、p-eNOs 為1∶1 000，內參β-actin 為1∶2 000），室溫孵育過夜后，加入HRP 羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h 后，采用增強化學發(fā)光法顯色，用凝膠成像儀觀察條帶并拍照，Image J軟件分析各組蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較行LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血壓及尿蛋白量比較 造模各組大鼠血壓、24 h 尿蛋白量均高于正常組（P均＜0.05）；PIH 組、陽性對照組及丹參素低、中、高劑量組的血壓、24 h尿蛋白量依次降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血壓、24 h尿蛋白量比較（）

表1 各組大鼠血壓、24 h尿蛋白量比較（）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與PIH 組相比，bP＜0.05；與陽性對照組相比，cP＜0.05；與丹參素低劑量組相比，dP＜0.05；與丹參素中劑量組相比，eP＜0.05。

24 h尿蛋白量（mg）271.33 ± 6.71abcde 381.12 ± 16.82abcd 492.95 ± 16.99ab 498.97 ± 17.08ab 678.29 ± 18.64a 163.17 ± 16.29組別丹參素高劑量組丹參素中劑量組丹參素低劑量組陽性對照組PIH組正常組n 10 10 10 10 10 10血壓（mmHg）125.92 ± 10.19abcde 140.69 ± 11.21abcd 156.62 ± 11.79ab 156.59 ± 11.21ab 179.58 ± 13.25a 102.95 ± 10.99

2.2 各組胎鼠體質量、體長及畸形率、死亡率、胎盤質量比較 造模各組大鼠胎盤質量、胎鼠體質量、體長低于正常組，畸形率、死亡率高于正常組（P均＜0.05）；PIH 組、陽性對照組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組大鼠胎盤質量、胎鼠體質量、體長依次增高，胎鼠畸形率、死亡率依次降低（P均＜0.05）；丹參素各組大鼠胎盤質量、胎鼠體質量、體長及畸形率、死亡率兩兩相比，P均＜0.05。見表2。

2.3 各組胎盤組織損傷情況比較 正常組大鼠胎盤組織形態(tài)和結構正常，未見明顯損傷。與正常組相比，PIH 組大鼠胎盤組織絨毛數(shù)目減少、結構萎縮、結構不清。與PIH 組相比，丹參素低、中、高劑量組及陽性對照組大鼠胎盤組織絨毛數(shù)目減少、結構萎縮等病理損傷程度減輕。見圖1。

表2 各組大鼠胎盤質量、新生鼠體質量、體長、畸形率、死亡率比較（）

表2 各組大鼠胎盤質量、新生鼠體質量、體長、畸形率、死亡率比較（）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與PIH組相比，bP＜0.05；與陽性對照組相比，cP＜0.05；與丹參素低劑量組相比，dP＜0.05；與丹參素中劑量組相比，eP＜0.05。

死亡率（%）組別n 胎盤質量（g）新生鼠體質量（g）新生鼠體長（cm）畸形率（%）3.53 ± 0.11abcde 7.01 ± 0.10abcd 13.05 ± 0.11ab 13.61 ± 0.12ab 15.09 ± 0.13a 0丹參素高劑量組丹參素中劑量組丹參素低劑量組陽性對照組PIH組正常組10 10 10 10 10 10 3.22 ± 0.04abcde 2.61 ± 0.03abcd 1.83 ± 0.02ab 1.82 ± 0.03ab 1.08 ± 0.02a 3.95 ± 0.04 5.03 ± 0.11abcde 4.61 ± 0.10abcd 3.95 ± 0.09ab 3.91 ± 0.09ab 3.29 ± 0.08a 5.57 ± 0.11 4.33 ± 0.11abcde 3.99 ± 0.10abcd 3.45 ± 0.09ab 3.41 ± 0.09ab 3.09 ± 0.03a 4.67 ± 0.04 6.53 ± 0.11abcde 19.11 ± 0.27abcd 25.59 ± 0.28ab 26.01 ± 0.29ab 30.19 ± 0.31a 0

2.4 各組大鼠血清NO 水平及胎盤組織sFlt-1、PLGF、eNOS 蛋白表達比較 造模各組大鼠血清NO水平、胎盤組織PLGF 和p-eNOS 蛋白表達低于正常組，sFlt-1蛋白表達高于正常組（P均＜0.05）；PIH組、陽性對照組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組大鼠血清NO 水平、胎盤組織PLGF 和p-eNOS 蛋白表達依次升高，sFlt-1 蛋白表達依次降低（P均＜0.05）；丹參素各組NO 水平及sFlt-1、PLGF、eNOS 蛋白表達兩兩相比，P均＜0.05。見表3、圖2。

3 討論

PIH 主要發(fā)生在妊娠中晚期，主要臨床癥狀為高血壓、蛋白尿，可導致死胎、死產、胎盤早剝及母兒死亡等嚴重產科并發(fā)癥［14］。靜脈注射亞硝基左旋精氛酸甲酯可建立大鼠PIH 模型，該造模方法簡單、成功率高、大鼠死亡率低［15］。本研究用上述方法建立PIH 模型后發(fā)現(xiàn)，大鼠血壓、尿蛋白量升高的同時，胎鼠體質量、身長降低，死胎率、胎鼠畸形率升高，伴隨著胎盤質量降低及胎盤組織絨毛數(shù)目減少、結構萎縮、結構不清等病理損傷加重，與人PIH 臨床癥狀及并發(fā)癥相似，表明造模成功。

圖1 各組大鼠胎盤組織HE染色觀察結果

表3 各組大鼠血清NO水平及胎盤組織中sFlt-1、PLGF、p-eNOS蛋白表達比較（）

表3 各組大鼠血清NO水平及胎盤組織中sFlt-1、PLGF、p-eNOS蛋白表達比較（）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與PIH組相比，bP＜0.05；與陽性對照組相比，cP＜0.05；與丹參素低劑量組相比，dP＜0.05；與丹參素中劑量組相比，eP＜0.05。

p-eNOS 0.94 ± 0.12abcde 0.75 ± 0.14abcd 0.56 ± 0.12abc 0.51 ± 0.13ab 0.25 ± 0.14a 1.24 ± 0.12組別丹參素高劑量組丹參素中劑量組丹參素低劑量組陽性對照組PIH組正常組n 10 10 10 10 10 10 NO（μmol/mL）30.39 ± 2.79abcde 22.42 ± 2.82abcd 14.68 ± 1.92ab 14.38 ± 1.33ab 6.92 ± 0.96a 30.86 ± 3.09 sFlt-1 0.54 ± 0.13abcde 0.73 ± 0.14abcd 1.01 ± 0.15ab 1.02 ± 0.16ab 1.41 ± 0.17a 0.24 ± 0.13 PLGF 1.06 ± 0.12abcde 0.74 ± 0.10abcd 0.47 ± 0.05abc 0.49 ± 0.06ab 0.16 ± 0.05a 1.39 ± 0.15

圖2 大鼠胎盤組織中sFlt-1、PLGF、p-eNOS蛋白表達情況

近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管內皮受損、血管活性物質失衡導致的血管功能紊亂是PIH 發(fā)病的重要因素［16］。eNOs 及NO 在妊娠血管內皮分化、修復及血管新生中扮演重要角色。劉懷昌等［17］發(fā)現(xiàn)妊娠時胎盤血管內皮細胞中eNOs增多，在促進滋養(yǎng)細胞分化及增殖的同時，能促進內皮細胞釋放合成大量NO來擴張血管，調節(jié)血流速度來降低血壓，維持孕婦循環(huán)系統(tǒng)功能正常，從而使孕婦更好適應妊娠全過程。這表明eNOs、NO 在妊娠血壓及孕婦血液循環(huán)系統(tǒng)功能調節(jié)中扮演重要角色。另外，NO減少也與PIH 及不良妊娠結局關系密切。周瑞霞等［18］發(fā)現(xiàn)，血清NO 越高，血管內皮素水平越低，PIH 不良妊娠結局發(fā)生率越小。本研究發(fā)現(xiàn)，PIH 組大鼠血壓升高的同時，血清NO 水平及胎盤組織p-eNOs 表達也隨之降低，提示PIH 大鼠胎盤組織eNOs 活性降低，NO合成減少可能與胎盤血管功能受損關系密切。

大量研究證實，胎盤組織PLGF、sFlt-1表達異常也可引起血管生成及功能障礙，導致胎盤缺氧，參與PIH不良妊娠結局的發(fā)生［7］。JIANG等［19］發(fā)現(xiàn)，sFlt-1在胎盤產生后，可抑制VEGF 信號傳遞及生物學活性，引起血管生成障礙，并干擾胎盤滋養(yǎng)層細胞侵襲和分化，引起不良妊娠結局。王芳［20］研究認為，PIH過程中胎盤組織sFlt-1 異常升高引起血管生成失衡，是造成胎盤滋養(yǎng)層侵襲不足、子宮螺旋動脈重鑄不良、胎盤缺氧的重要原因，而胎盤缺氧損傷又可進一步促進sFlt-1 生成，引起血管生成失衡及胎盤損傷，從而加重PIH 進程。PLGF 是胎盤滋養(yǎng)層細胞分化及內皮細胞增殖過程中的重要因子。KIDRON等［21］研究表明，PLGF能促進早孕時滋養(yǎng)細胞增殖與分化，誘導內皮細胞增殖、遷移并抑制內皮細胞凋亡，增加血管通透性，是重要的促血管生成因子，本研究發(fā)現(xiàn)，PIH 大鼠胎盤絨毛細胞數(shù)目減少的同時，也伴隨著sFlt-1 表達增高及PLGF 表達減少，提示這兩種變化也可能與PIH 大鼠胎盤組織損傷關系密切。

目前，臨床治療PIH 的主要藥物為硫酸鎂，但該藥不良反應重，因此，尋找治療PIH 安全、有效的藥物是臨床研究重點［22］。中醫(yī)藥治療PIH 具有降壓效果好、不良反應輕等優(yōu)點［23］。有學者發(fā)現(xiàn)，中藥丹參注射液在降低PIH 患者及模型大鼠血壓、改善母嬰結局方面有一定療效，提示丹參可能是治療PIH 的潛在藥物，但其具體治療機制不甚清楚［12-13］。丹參素為丹參的主要活性物質，臨床研究發(fā)現(xiàn)其在降血壓和改善微循環(huán)方面有較好療效［9-10］?；诖?，本研究推測丹參素可能是治療PIH 的主要活性物質，并建立PIH 大鼠模型進行驗證，結果發(fā)現(xiàn)，丹參素低、中、高劑量組及陽性對照組大鼠胎盤組織sFlt-1 表達降低，NO、PLGF、eNOs表達升高的同時，血壓及尿蛋白含量也降低，胎鼠死亡率、畸形率等不良妊娠結局發(fā)生率及胎盤結構損傷等均得到顯著改善，且隨著丹參素劑量升高則效果越明顯。另外，丹參素低劑量組改善效果優(yōu)于陽性對照組，表明丹參素可減輕PIH 大鼠胎盤損傷、減少不良妊娠結局，對PIH 有較好的治療效果，其治療作用可能與抑制胎盤組織sFlt-1 表達、上調PLGF 表達，提高胎盤組織eNOs 活性和血清NO合成，改善胎盤血管功能有關。

綜上所述，丹參素可抑制胎盤組織sFlt-1 表達、上調PLGF表達，提高胎盤組織eNOs活性和血清NO合成，減輕PIH 大鼠胎盤血管功能受損，進而改善妊娠結局，以上結果可為臨床治療PIH 提供一定參考。然而，PIH 病理過程相當復雜，丹參素還可能通過其他途徑治療PIH，且丹參素改善PIH 血管功能的具體分子機制仍需進一步探索。