L-丙氨酸的應用及生產(chǎn)現(xiàn)狀概述

聶玉朋，徐 慧，姚明靜，朱坤福，李澤潤，孫 萍，王珊珊，祝 蕾，田延軍*

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院，山東 濟南 250353；2.山東朱氏藥業(yè)集團有限公司，山東 菏澤 274300）

L-丙氨酸又叫L-α-氨基丙酸，是組成人體蛋白質的20多種氨基酸之一，也是人體血液中含量最高的氨基酸。L-丙氨酸分子式為CH3CH（NH2）COOH，分子質量89.09，密度為1.432 g/cm3，熔點為297 ℃，外觀為無色至白色結晶粉末，溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚和丙酮，無臭無毒，具有鮮味和甜味，其中甜味是蔗糖甜味的1.2倍。

1 L-丙氨酸的應用

1.1 食品領域的應用

1.1.1 調味品和腌制品

我國批準許可使用的增味劑有谷氨酸鈉、5'-鳥苷酸二鈉、5'-肌苷酸二鈉、5'-呈味核苷酸二鈉、琥珀酸二鈉、糖精鈉、辣椒油樹脂、L-丙氨酸和甘氨酸[1]。谷氨酸鈉是應用最多的一種食品增味劑，可用于復配其他鮮味劑，谷氨酸鈉攝入過多會抑制人體各種神經(jīng)功能，其中含有的鈉離子還會引起高血壓等疾病，對人體不利。琥珀酸二鈉、5'-呈味核苷酸二鈉、5'-肌苷酸二鈉、5'-鳥苷酸二鈉中也均含有鈉離子，攝入過多容易引起動脈粥樣硬化、高血壓等疾病[2]。相比之下，L-丙氨酸不含鈉離子、食用更安全，對于食品的增味效果顯著，優(yōu)勢明顯。

L-丙氨酸加入醬油中具有提高鮮味、緩和咸味的作用。在魚露中添加適量L-丙氨酸能夠起到增甜、提鮮及減緩腥臭氣味的作用[3]。在食鹽和雞精中加入L-丙氨酸既可以增加呈味性，還能減少人體過多鈉離子的攝入。

除了鮮味，L-丙氨酸還具有甜味，甜味是蔗糖的1.2倍，常被用于甜味劑的復配。L-丙氨酸用于復配甜味劑，能提高甜度、柔和甜味，減少人工合成甜味劑的使用，符合現(xiàn)代“低糖”的飲食習慣，可用于制作適合糖尿病病人食用的食品。L-丙氨酸可取代L-苯丙氨酸與天門冬氨酸合成新的二肽甜味劑阿力甜，比阿斯巴甜的甜度高約10倍，其甜味特性類似于蔗糖，沒有其他強力甜味劑通常帶有的后苦味或金屬后味[4]。

在腌漬蔬菜中添加L-丙氨酸具有緩沖咸味、增甜提鮮的效果，L-丙氨酸能夠增加腌漬蔬菜揮發(fā)性香氣中的化合物種類，并能弱化含硫化合物中所具有的不愉快氣味[5]。

1.1.2 酒和飲料

L-丙氨酸用于酒的合成，可以增加酒的甜味，使酒味更加濃香醇厚。在啤酒和發(fā)泡酒中添加，可以防止氨基酸褐變，減輕褐變對酒風味的影響。還可以促進酒精代謝，具有減輕酒精對肝臟損傷的解毒作用，被廣泛應用于低度酒的生產(chǎn)[6]。

L-丙氨酸具有緩和酸味的作用，可以調節(jié)酸奶等發(fā)酵性食品因發(fā)酵過剩產(chǎn)生的酸味。在一些飲料中添加L-丙氨酸，緩和酸味、補充氨基酸的同時還能增加飲料的甜味，提高味道的持久性。

1.1.3 防腐劑

L-丙氨酸與乙酸鈉、富馬酸等二元羧酸以及氧化性酸的混合物是保存面條的上佳防腐劑，可以起到防腐保鮮的作用。其與辣椒油、山梨酸鉀等的混合物能有效的抑制酵母菌、大腸桿菌、黑曲霉等有害菌，可用于水產(chǎn)品、面條、腌制品、海產(chǎn)品、豆制品、畜產(chǎn)品以及飼料、化妝品、藥品的保鮮[7]。

1.2 醫(yī)藥領域的應用

L-丙氨酸在醫(yī)藥領域可用于制備組織培養(yǎng)基、生化試劑，同時可作為藥物成分生產(chǎn)依那普利、索非布韋等藥品，用于治療高血壓、肝病等疾病，在測定肝功能方面也有所應用。

L-丙氨酸可用作氨基酸輸液，是治療肝病的復合氨基酸注射液“氨基酸注射液-800”的主要成分，可用于治療肝功能不全引起的氨基酸代謝紊亂，促使肝昏迷病人蘇醒[8]。其用在解酒護肝的藥物中，可以有效減輕酒精對肝臟的損害作用，是天然、健康的護肝配方成分[9]。

L-丙氨酸是營養(yǎng)劑補糖氨基酸的成分之一，也是合成維生素B6、丙谷二肽、安脲通等藥品的原料，同時也是抗菌藥氧氟沙星[10]、高血壓治療藥依那普利、新型丙肝治療藥索非布韋、新型多發(fā)性硬化癥治療藥醋酸格拉替雷等藥品的重要生產(chǎn)原料。甄俊峰[11]首次發(fā)現(xiàn)L-丙氨酸能夠通過促進三羧酸循環(huán)，增加胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，從而促進氟喹諾酮類藥物對分枝桿菌持留菌的殺傷。

L-丙氨酸可激活肝臟腺苷酸活化蛋白激酶并調節(jié)全身葡萄糖代謝[12]。L-丙氨酸可刺激體外胰島素的分泌[13]，其制成的丙氨酸營養(yǎng)補充劑可以幫助糖尿病患者維持健康的血糖水平。L-丙氨酸還具有減肥的功效，能改善肥胖患者的血糖控制和脂質代謝[14]。

L-丙氨酸在蛋白質的分解代謝和碳水化合物的合成中起中介作用，與乳酸鹽一起能夠通過肝臟中的糖異生從肌肉蛋白中產(chǎn)生葡萄糖，在肌肉蛋白質代謝中起著核心作用[15]。L-丙氨酸可用于治療成人糖原累積病二型，可減少糖原累積病二型患者的蛋白質降解，是一種簡單且相對便宜的療法[16]。高濃度的L-丙氨酸培養(yǎng)基可以選擇性消除人類誘導多能干細胞，用高濃度的L-丙氨酸進行治療有助于消除干細胞治療中的致瘤性殘留人類誘導多能干細胞[17]。

1.3 日化領域的應用

L-丙氨酸可用于合成綠色環(huán)保的溫和氨基酸表面活性劑[18]。相較于傳統(tǒng)的有機化學表面活性劑，其合成的表面活性劑不僅能夠達到相同的效果，而且去污、乳化和滲透能力強，不會污染環(huán)境，還具有優(yōu)良的爽膚和保濕能力，對人體健康，可適用于嬰幼兒和敏感性的皮膚。

L-丙氨酸可用于生產(chǎn)新型螯合劑甲基甘氨酸二乙酸（methyl glycine diacetic acid，MGDA），MGDA可替代新型高性能環(huán)保洗滌劑中的含磷螯合劑，可以在水中自然降解，避免了傳統(tǒng)磷酸鹽對環(huán)境的負面影響，避免對人體和環(huán)境造成危害[19]。L-丙氨酸可用于合成聚酯酰胺，這是一種新的可生物降解的聚合物，可用于生產(chǎn)具有定制性能的各種材料[20]。L-丙氨酸可作為催化劑催化羥醛縮合反應，催化劑可重復利用5次以上，產(chǎn)物收率為70%～84%[21]。

1.4 飼料中的應用

L-丙氨酸是畜禽飼料的主要營養(yǎng)補充成分，能提高飼料蛋白質的生物學價值，促進動物生長，預防疾病，還能防止飼料氧化變質，延長飼料保鮮期，在國外已普遍采用[8]。在飼料中添加L-丙氨酸，還可以促進幼畜的內(nèi)臟氮循環(huán)，增強幼畜的免疫力。

2 L-丙氨酸的生產(chǎn)方法

目前，L-丙氨酸的生產(chǎn)方法主要有化學合成法、提取法、酶轉化法和發(fā)酵法?；瘜W合成法生產(chǎn)的L-丙氨酸質量較差，生產(chǎn)過程易造成環(huán)境污染；水解提取法生產(chǎn)過程較復雜，不適宜規(guī)?；凸I(yè)化生產(chǎn)；酶轉化法是目前工業(yè)上常用的生產(chǎn)方法，但所用原料天冬氨酸價格昂貴，生產(chǎn)成本較高；發(fā)酵法所用原料葡萄糖價格低廉，生產(chǎn)成本低，具有廣闊的研究前景。

2.1 化學合成法

丙酸氯化法是化學合成L-丙氨酸的常見思路[22]。丙酸氯化法原料是丙酸和液氯，用質量為3%的赤磷作為催化劑，在105 ℃條件下進行氯化反應，得到DL-氯代丙酸。然后進行氨化反應，以DL-氯代丙酸和氨水為原料，烏洛托品作為催化劑，在60 ℃條件下進行氨化反應，得到DL-丙氨酸，拆分DL-丙氨酸，在甲醇溶液中進行結晶、離心、干燥后，最終得到合格的L-丙氨酸產(chǎn)品。丙酸氯化法生產(chǎn)L-丙氨酸成本高，合成的產(chǎn)品質量差，還會造成環(huán)境污染，目前已基本被淘汰。

2.2 提取法

提取法是通過酸水解或酶解玉米蛋白、絹絲或者明膠等L-丙氨酸含量高的物質，然后分離和手性拆分后得到L-丙氨酸。這種方法成本比較高，不適合規(guī)?；凸I(yè)化生產(chǎn)[23]。

2.3 酶轉化法

酶轉化法分為游離整體細胞法和固定化細胞法，酶轉化法原料是L-天冬氨酸，經(jīng)過富有L-天冬氨酸-β-脫羧酶活力的微生物細胞催化后得到L-丙氨酸，L-天冬氨酸可通過固定化大腸桿菌（Escherichia coli）高效催化富馬酸銨制得。酶的活性對L-丙氨酸的生產(chǎn)至關重要，酶轉化法生產(chǎn)L-丙氨酸的研究多從挑選合適的產(chǎn)酶菌株展開。

20世紀90年代，徐虹等[24]通過誘變篩選獲得一株產(chǎn)L-天冬氨酸-β-脫羧酶的高活性菌株PseudomonasNX-1，并對該菌株產(chǎn)酶條件進行了優(yōu)化。使用該菌株進行搖瓶實驗，經(jīng)過4～5 d的轉化，每升培養(yǎng)液大約可以轉化1 400 gL-天冬氨酸，轉化產(chǎn)物中L-丙氨酸的含量為90%以上，摩爾轉化率接近100%。進一步通過800 L的發(fā)酵罐進行菌種擴大培養(yǎng)實驗，每升培養(yǎng)液可以轉化L-天冬氨酸2 kg，最高可達2.5 kg，得到1.2 kgL-丙氨酸干品，提取平均收率為90%[25]。使用PseudomonasNX-1菌株生產(chǎn)L-丙氨酸，產(chǎn)物濃度高，反應結束后已經(jīng)有大量L-丙氨酸結晶析出，且酶反應具有專一性，幾乎無其他氨基酸生產(chǎn)，有利于后續(xù)產(chǎn)品的提取，大大降低了分離提取的成本。

2016年，徐友強等[26]在一株能生產(chǎn)L-天冬氨酸酶的大腸桿菌CICC 11022S中導入了來源于睪丸酮叢毛單胞菌的L-天冬氨酸-β-脫羧酶基因，可高效轉化富馬酸生產(chǎn)L-丙氨酸。研究結果顯示，以富馬酸為底物，經(jīng)過9 h的轉化，L-丙氨酸產(chǎn)量為112.7 g/L，生產(chǎn)速率為12.5 g/（L·h），轉化率為93.8%。富馬酸價格大約是L-天冬氨酸的40%，通過構建雙酶耦合表達的基因重組菌株，轉化富馬酸生產(chǎn)L-丙氨酸，降低了生產(chǎn)原料成本。

2020年，張奇等[27]研究出了一種混菌二次發(fā)酵技術用于L-丙氨酸的生產(chǎn)。該方法以大腸桿菌和睪丸酮叢毛單胞菌為出發(fā)菌株，可同時表達L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脫羧酶，轉化富馬酸生產(chǎn)L-丙氨酸，摩爾轉化率達98.6%。徐友強等[26]構建的雙酶耦合表達的基因重組菌株，轉化富馬酸生產(chǎn)L-丙氨酸的摩爾轉化率為93.8%。相比之下，混菌二次發(fā)酵技術的生產(chǎn)率更高?；炀伟l(fā)酵技術可以充分的利用培養(yǎng)基和設備，在同一發(fā)酵罐中經(jīng)過同一工藝過程實現(xiàn)發(fā)酵，提高了產(chǎn)品的質量。混菌二次發(fā)酵技術的產(chǎn)生為工業(yè)化生產(chǎn)L-丙氨酸提供了新思路。

隨著固定化技術的發(fā)展，人們開始研究固定化法生產(chǎn)L-丙氨酸，固定化法的最大優(yōu)勢在于連續(xù)化生產(chǎn)。

1996年，呂煒鋒等[28]對產(chǎn)酶的菌株進行了固定化，通過固定化進行L-丙氨酸的生產(chǎn)研究。研究結果表明，1 kg的固定化細胞能夠轉化2 kg的底物，轉化率在98%以上，產(chǎn)物收率＞85%，固定化細胞的酶活半衰期在80 d以上，產(chǎn)品的純度在98.5%以上。這種生產(chǎn)方法連續(xù)化生產(chǎn)程度較高，有很大的工業(yè)化潛力。

2005年，陸健等[29]選用家蠶絲素作為固定化細胞的載體，用于生產(chǎn)L-丙氨酸。該研究用戊二醛交聯(lián)固定由家蠶絲素制成的絲素溶液，制成固定化細胞絲素凝膠，利用工程菌生產(chǎn)L-丙氨酸。通過對固定化酶活性影響因素的研究，確定了使用該載體生產(chǎn)L-丙氨酸的最優(yōu)條件。研究結果顯示，通過對底物流速的控制，可使底物轉化率大于96%，產(chǎn)量最高為3.42 g/h，轉化原活力在經(jīng)過一個月的連續(xù)使用后還保持在92%以上。

游離細胞法生產(chǎn)L-丙氨酸相較于固定化細胞法生產(chǎn)成本底，生產(chǎn)步驟較簡單，而且L-天冬氨酸的摩爾轉化率和產(chǎn)品質量更容易控制。酶法催化生產(chǎn)L-丙氨酸提取工藝簡單，設備投資小，且沒有化學合成法的高污染、低產(chǎn)率等問題，是目前工業(yè)化生產(chǎn)L-丙氨酸的主要方法。但酶法工業(yè)化生產(chǎn)L-丙氨酸所用原料L-天冬氨酸的成本比較高，是需要解決的一大問題。

2.4 發(fā)酵法

L-丙氨酸的生產(chǎn)經(jīng)歷了蛋白水解提取法、化學合成法、發(fā)酵法和酶轉化法等幾個階段，隨著生物工程技術和基因工程技術的發(fā)展，越來越多的氨基酸產(chǎn)品可以用發(fā)酵法生產(chǎn)。發(fā)酵法的生產(chǎn)成本較酶法要低，生產(chǎn)的氨基酸對映體純度較高，減少了后續(xù)的純化步驟，且發(fā)酵過程條件溫和，可以防止產(chǎn)品進一步降解[30]。

2.4.1 發(fā)酵菌株的構建

1978年，CHICO E等[31]研究發(fā)現(xiàn)了低氧條件下釀酒酵母糖酵解的終產(chǎn)物是L-丙氨酸。

2010年，JOJIMA T等[32]以谷氨酸棒狀桿菌為原始菌株，刪除了乳酸、琥珀酸等有機酸的合成基因和丙氨酸消旋酶（alr）基因，插入了丙氨酸脫氫酶（alad）基因和甘油醛3-磷酸脫氫酶（gapa）基因，構建了一株L-丙氨酸高產(chǎn)菌株。利用該菌株生產(chǎn)的L-丙氨酸光學純度＞99.5%，該菌株在無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)32 h后產(chǎn)生98 g/L的L-丙氨酸。這一研究結果顯示出缺氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的前景。

2016年，ZHOU L等[33]構建了一株利用溫度調節(jié)基因開關調控大腸桿菌生產(chǎn)L-丙氨酸的菌株B0016-060BC。該菌株可利用溫度調節(jié)基因（λpR-pL）開關來動態(tài)的控制源自嗜熱脂肪地芽孢桿菌的alad基因在大腸桿菌B0016-060BC染色體上的表達，從而高效的控制菌體的生長和L-丙氨酸的產(chǎn)生，提高L-丙氨酸的產(chǎn)量。優(yōu)化條件后的發(fā)酵實驗結果顯示：以葡萄糖為唯一碳源時，L-丙氨酸效價達到120.8 g/L，產(chǎn)率為4.18 g/（L·h）。這個研究解決了產(chǎn)物L-丙氨酸的積累抑制大腸桿菌生長速率的問題，在需氧細胞生長階段關閉L-丙氨酸的產(chǎn)生，可以防止L-丙氨酸對大腸桿菌生長的抑制作用，并實現(xiàn)高生長率和生物量積累，之后開啟高效alad基因表達的遺傳開關，促進生產(chǎn)階段L-丙氨酸的形成。

2018年，蔡宇杰等[34]構建了雙酶共表達菌株BLPN/pETDuet-1-pilad-11ldh，可利用乳酸生產(chǎn)L-丙氨酸。該菌株同時表達了外源的L-丙氨酸脫氫酶基因和L-乳酸脫氫酶基因，并強化表達了菌株本身的乳酸轉運基因和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）合成基因。該菌株中的L-乳酸脫氫酶以菌體內(nèi)的NAD為輔酶，將L-乳酸脫氫生成L-丙氨酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadeninedinucleotide-reduced，NADH），L-丙氨酸脫氫酶將丙酮酸、氨合成L-丙氨酸，NADH則氧化生成NAD，實現(xiàn)了輔酶NAD的再生，同時敲除或強化表達大腸桿菌基因組上的相關基因促進乳酸的轉運，防止L-丙氨酸的分解。使用該菌株在100 mL反應體系中轉化24 h，測得L-丙氨酸質量濃度為291 g/L。使用該菌生產(chǎn)L-丙氨酸，底物廉價，生產(chǎn)過程簡單且原料易得，具有良好的應用前景。

2017年，付剛等[35]以大腸桿菌JH-B2為出發(fā)菌株進行了發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的工藝優(yōu)化研究。工藝優(yōu)化后，在50 L發(fā)酵罐中進行補料發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸，產(chǎn)量達到135.0 g/L。2019年，潘海亮等[36]敲除了大腸桿菌JH-B2的葡萄糖轉運酶（ptsg）基因得到了JH-B3菌株。利用該菌株以混合糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸，L-丙氨酸的生產(chǎn)強度較菌株JH-B2提高了21.5%。2020年，王燦等[37]在大腸桿菌JH-B3的基礎上敲除能轉運葡萄糖的D-半乳糖/D-葡萄糖結合蛋白（mglb）基因后得到了ptsg和mglb基因雙缺陷菌株JH-B6，以水稻秸稈水解液作為碳源進行發(fā)酵實驗，得出菌株JH-B6發(fā)酵周期為88 h，較菌株JH-B3縮短了31.3%，糖酸轉化率為93.9%，較JH-B3提高了4.9%。利用菌株JH-B6發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸，降低了葡萄糖效應，提高了L-丙氨酸的生產(chǎn)效率，且水稻秸稈價格低廉，降低了L-丙氨酸的生產(chǎn)成本，顯示出巨大的工業(yè)化潛力。

2.4.2 發(fā)酵底物的選擇

2016年，周麗等[38]利用大腸桿菌B0016-060BC菌株，研究了以甘油作為唯一碳源對發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的影響。利用5 L發(fā)酵罐發(fā)酵后，可合成63.64 g/LL-丙氨酸，整個發(fā)酵階段體積生產(chǎn)強度達到1.91g/（L·h），轉化率達到62.89g/100g甘油，僅合成少量的乙酸（1.73 g/L）等副產(chǎn)物。甘油作為生物柴油制造工業(yè)的副產(chǎn)物，價格低廉，這一研究為工業(yè)化生產(chǎn)L-丙氨酸提供了重要的參考價值。

2017年，劉棗等[39]選用玉米漿作為氮源，研究其對大腸桿菌JH-B22發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的影響。通過對發(fā)酵液中玉米漿的添加量進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)最適添加量下，L-丙氨酸的產(chǎn)量為54.30 g/L。雖然使用玉米漿生產(chǎn)L-丙氨酸的產(chǎn)量比無機鹽發(fā)酵培養(yǎng)基的56.12 g/L和LB發(fā)酵培養(yǎng)基的56.48 g/L低，但使用玉米漿作氮源價格低廉，不需要再額外添加酵母粉，可以有效降低生產(chǎn)成本，且玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基配制簡單，玉米漿中含有無機鹽組分，不需要再額外添加，是生產(chǎn)L-丙氨酸很好的選擇。

發(fā)酵法生產(chǎn)L-丙氨酸主要從高產(chǎn)菌株的構建、發(fā)酵條件的優(yōu)化以及提取方法的選擇等方面展開研究，其中最核心的問題是高產(chǎn)菌株的構建，選擇合適的菌種進行基因改造，通過刪除與L-丙氨酸爭奪碳源相關途徑的基因，減少副產(chǎn)物的生成，提高L-丙氨酸的產(chǎn)量。目前，用于基因改造最多的菌種是大腸桿菌，大腸桿菌具有遺傳背景清晰，易于基因工程操作，繁殖迅速，生長要求低，便宜，安全等優(yōu)勢，是良好的原始菌株。發(fā)酵法的優(yōu)勢在于所用的碳源葡萄糖是一種價格低廉的可再生資源，也有人開始研究利用廉價木質纖維素中的混合糖作為碳源，旨在降低生產(chǎn)成本。

3 展望

L-丙氨酸在食品領域、醫(yī)藥領域和日化領域都有著巨大的應用潛力。隨著人們生活水平的提高，人們對于食品的安全性要求也隨之提高，食品添加劑也成為現(xiàn)代食品行業(yè)不可或缺的一部分。L-丙氨酸作為一種天然健康無鈉的多功能食品添加劑，擁有巨大的發(fā)展?jié)摿?。作為人體20多種氨基酸之一，其在醫(yī)藥領域的應用也愈加廣泛。

目前對于L-丙氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)，提取法生產(chǎn)成本高，無法實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，對環(huán)境也有一定的污染；化學合成法生產(chǎn)成本高，合成的產(chǎn)品質量差、收率低，還會造成環(huán)境污染；酶法是當前工業(yè)化生產(chǎn)L-丙氨酸的主要方法，優(yōu)點是使用的催化劑生物酶活力高、條件溫和，不會造成污染，且設備投資小、提取工藝簡單，缺點是生產(chǎn)成本高；發(fā)酵法生產(chǎn)L-丙氨酸成本低，所得L-丙氨酸對映體純度高，減少了后續(xù)的純化步驟，顯示出了巨大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。因此未來應對發(fā)酵法生產(chǎn)L-丙氨酸的方法進行優(yōu)化改進，促進L-丙氨酸的生產(chǎn)和應用發(fā)展。