細(xì)胞塊在宮頸液基細(xì)胞學(xué)腺上皮病變?cè)\斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值*

余清，吳寧，賈世軍，姚宇琪，侯俊，董浩

618000 四川 德陽(yáng)，德陽(yáng)市人民醫(yī)院 病理科(余清、吳寧)；610041 成都，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理科(賈世軍、姚宇琪、侯俊、董浩)

文獻(xiàn)報(bào)道[1-3]宮頸鱗狀上皮病變的發(fā)病率逐年降低，而宮頸腺癌的發(fā)病率則呈上升趨勢(shì)，在宮頸癌中的比例由5%升至20%左右，液基細(xì)胞學(xué)(liquid-based cytology test，LCT)識(shí)別鱗狀上皮病變的特異性較高，對(duì)腺上皮病變的診斷準(zhǔn)確性卻較低[4]。細(xì)胞塊技術(shù)的基本原理是將細(xì)胞懸浮液離心，得到高度濃縮的細(xì)胞和微小的組織塊，使用或不使用細(xì)胞塊支架,再經(jīng)10%中性福爾馬林固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、染色。細(xì)胞塊比細(xì)胞涂片收集到更多的細(xì)胞成分,能恢復(fù)一定程度的組織學(xué)結(jié)構(gòu),且更清楚地顯示腫瘤細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞核的異型特征，制成的蠟塊可以連續(xù)切片并長(zhǎng)期保存,在細(xì)胞塊基礎(chǔ)上還可以進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry，ICC)標(biāo)記和基因檢測(cè)。目前細(xì)胞塊常被用于非婦科細(xì)胞學(xué)檢查，用于宮頸腺上皮病變的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本文以此為背景，探討在LCT基礎(chǔ)上加做細(xì)胞塊及ICC檢測(cè)在診斷宮頸腺上皮病變中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年1～12月LCT診斷腺上皮細(xì)胞異常病例共302例，均制備細(xì)胞塊，其中來(lái)自四川省腫瘤醫(yī)院172例，四川省德陽(yáng)市人民醫(yī)院130例，患者年齡31～74歲，平均(50.93±13.57)歲，均有組織學(xué)活檢對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 LCT制備 暴露宮頸，用棉簽擦去宮頸血液及分泌物，采用專(zhuān)用采樣刷在宮頸肉眼可疑病變處保持適當(dāng)壓力同一方向旋轉(zhuǎn)5～8圈，采集好后取下刷頭放入美國(guó)BD公司專(zhuān)用婦科標(biāo)本保存瓶?jī)?nèi)，BD公司PrepMate-PrepStain自動(dòng)制片機(jī)制片。對(duì)不滿(mǎn)意標(biāo)本要求重新取樣制片。

1.2.2 細(xì)胞塊制備 1)在已完成LCT制片的標(biāo)本保存瓶里加入蒸餾水10 mL，利用吸管反復(fù)沖洗出保存瓶?jī)?nèi)刷頭上殘余的細(xì)胞及小組織碎片，連同LCT制片完成后剩余的細(xì)胞一并放入15 mL離心管內(nèi)，2 000 r/min離心10 min；2)用吸管輕輕吸去離心管內(nèi)上清液，加入濃度為2.51 mmol/L海藻酸鈉2 mL，于震蕩儀上震蕩10 s，2 000 r/min離心10 min；3)用吸管沿離心管內(nèi)側(cè)壁緩慢滴加濃度為18.02 mmol/L氯化鈣1 mL，靜置10 min；4)離心管底細(xì)胞聚集成團(tuán)被變性的海藻酸鈉包裹在內(nèi)，外表形似果凍狀，用鑷子夾出，并用剪刀剪去表面多余的介質(zhì)，隨后置于包埋紙內(nèi)，行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色、鏡檢。

1.2.3 ICC檢測(cè) 對(duì)LCT診斷的41例可疑腺癌用4 μm厚的細(xì)胞塊石蠟切片做ICC染色：一抗p16、p53、WT1、ER、PR、CA125、PAX-8、CK7、CK20、SP-B、TTF-1、NapsinA購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司，二抗顯色系統(tǒng)購(gòu)自丹麥Dako公司，采用EnVision二步法，具體操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用已知陽(yáng)性標(biāo)本作對(duì)照，用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷

細(xì)胞學(xué)診斷每張切片均由中、高級(jí)病理細(xì)胞學(xué)醫(yī)師雙人閱片，細(xì)胞塊判讀標(biāo)準(zhǔn)與組織學(xué)相同。

LCT判讀標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)2015年第三版Bethesda報(bào)告系統(tǒng)診斷報(bào)告模式[5]：1)未見(jiàn)腺上皮病變；2)腺上皮細(xì)胞異常：(1)非典型性腺細(xì)胞，無(wú)特殊指定，傾向反應(yīng)性(atypical glandular cells, not otherwise specified， AGC-NOS)：來(lái)源于子宮頸管腺細(xì)胞、子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞；(2)非典型性腺細(xì)胞，傾向于瘤變(atypical glandular cells, favor neoplastic，AGC-FN)：來(lái)源于子宮頸管腺細(xì)胞或無(wú)法分類(lèi)；(3)子宮頸管原位腺癌(adenocarcinoma in situ,AIS)；(4)腺癌：來(lái)源于子宮頸管腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌、子宮外腺癌。

ICC結(jié)果判讀: TTF-1、ER、PR、PAX-8、p53、WT1以腫瘤細(xì)胞胞核出現(xiàn)棕黃色或深棕色顆粒為陽(yáng)性， NapsinA、CK7、CK20、SP-B以腫瘤細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色或深棕色顆粒為陽(yáng)性，p16以腫瘤細(xì)胞胞漿和胞核出現(xiàn)棕黃色或深棕色顆粒為陽(yáng)性，CA125以腫瘤細(xì)胞胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色或深棕色顆粒為陽(yáng)性。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分率來(lái)判斷：無(wú)著色為(-)，陽(yáng)性細(xì)胞率<25%為(+)，25%～75%為(++)，>75%為(+++)。

2 結(jié) 果

2.1 302例組織學(xué)活檢結(jié)果

惡性腫瘤49例(包括宮內(nèi)膜腺癌31例、宮頸原發(fā)腺癌13例、卵巢漿液性癌4例、肺腺癌1例)，慢性炎癥253例。

2.2 302例細(xì)胞學(xué)診斷

表1顯示LCT診斷AGC-NOS 213例，AGC-FN 57例，AIS及腺癌32例; 細(xì)胞塊診斷腺癌41例(包括宮內(nèi)膜腺癌26例、宮頸原發(fā)腺癌12例、卵巢漿液性癌2例、肺腺癌1例)，未見(jiàn)腺上皮病變261例。根據(jù)診斷總符合率計(jì)算公式[6]：(真陽(yáng)性+真陰性)/總例數(shù)，LCT與病理組織學(xué)診斷總符合率為86.09%(260/302)，細(xì)胞塊與病理組織學(xué)診斷總符合率為97.35%(294/302)；根據(jù)特異性和敏感性的計(jì)算公式[6]，特異性=真陰性/(真陰性+假陽(yáng)性)，敏感性=真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陰性)，LCT的特異性和敏感性分別為83.79%(212/253)、97.96%(48/49)；細(xì)胞塊的特異性和敏感性分別為100%(253/253)、83.67%(41/49)。

表1 宮頸腺上皮病變細(xì)胞學(xué)診斷與組織學(xué)診斷對(duì)照

2.3 LCT和細(xì)胞塊顯微鏡下特點(diǎn)及ICC結(jié)果

宮頸正常腺上皮在LCT中呈柵欄狀或散在分布，可見(jiàn)小核仁，在細(xì)胞塊中呈腺樣排列，且柱狀上皮細(xì)胞核位于基底部。腺癌在LCT中多呈三維立體結(jié)構(gòu)或單個(gè)散在，在細(xì)胞塊中呈腺樣排列，具體特點(diǎn)及ICC結(jié)果見(jiàn)表2和圖1。

表2 LCT、細(xì)胞塊顯微鏡下特點(diǎn)及ICC結(jié)果

圖1 腺癌在LCT和CB中的形態(tài)特點(diǎn)及ICC結(jié)果

3 討 論

子宮頸癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤，是威脅亞洲婦女健康的第二大惡性腫瘤[7]。LCT是子宮頸癌及癌前病變的初篩法，存在一定的假陰性和假陽(yáng)性[8]。近年來(lái)，細(xì)胞塊應(yīng)用于宮頸LCT的文獻(xiàn)報(bào)道[8-11]多是在鱗狀上皮病變內(nèi)的研究。由于腺上皮受炎癥、修復(fù)、化生、放化療等因素影響易發(fā)生反應(yīng)性改變，這一類(lèi)良性反應(yīng)性病變僅通過(guò)LCT很難與腫瘤性病變區(qū)分開(kāi)，本文研究中LCT診斷與組織學(xué)診斷的總符合率為86.09%，其中LCT診斷的212例AGC-NOS、39例AGC-FN和2例AIS，組織學(xué)最終確診為良性反應(yīng)性改變。余小蒙[12]也認(rèn)為在宮頸脫落細(xì)胞學(xué)診斷中包括子宮下段的取樣、輸卵管型上皮化生、修復(fù)、宮內(nèi)節(jié)育器、子宮頸管息肉、微小腺體增殖、Aria-Stella反應(yīng)和電離放射效應(yīng)等其細(xì)胞形態(tài)特征可能貌似子宮頸腺上皮腫瘤，造成鑒別困難。

LCT不易辨別宮頸腺上皮良性反應(yīng)性改變與腺上皮腫瘤，并且不能確定腺癌細(xì)胞的來(lái)源，我們將LCT制片完成后取樣瓶?jī)?nèi)剩余液體標(biāo)本離心收集細(xì)胞并通過(guò)海藻酸鈉遇氯化鈣迅速變性形成凝膠包裹住細(xì)胞的原理制備成細(xì)胞塊。該方法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需加熱及反復(fù)多次離心，目前尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)于宮頸LCT微量標(biāo)本，通過(guò)該方法細(xì)胞數(shù)量得到最大程度收集且細(xì)胞形態(tài)保存較好。通過(guò)對(duì)本文302例細(xì)胞塊切片閱片觀察發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)清晰,背景干凈，無(wú)血液、黏液、炎癥細(xì)胞等干擾，細(xì)胞塊中腺上皮細(xì)胞保留了接近于組織學(xué)的形態(tài)，并且通過(guò)離心高度濃縮恢復(fù)了一定的組織學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，特別是腺癌細(xì)胞在細(xì)胞塊中出現(xiàn)形似組織學(xué)的腺體結(jié)構(gòu)，更容易被識(shí)別。本文研究中細(xì)胞塊的敏感性為83.67%低于LCT的97.96%，但細(xì)胞塊的特異性為100%高于LCT的83.79%，并且細(xì)胞塊與組織學(xué)診斷的總符合率為97.35%高于LCT與組織學(xué)診斷的總符合率86.09%。與LCT對(duì)比，從細(xì)胞塊鏡下形態(tài)很容易識(shí)別出腺上皮受炎癥、修復(fù)、化生、放化療等因素影響導(dǎo)致的良性反應(yīng)性改變，可對(duì)LCT診斷的非典型性腺細(xì)胞(atypical glandular cells，AGC)病例分流，避免不必要的宮頸活檢術(shù)；另外，對(duì)于腺癌可用細(xì)胞塊切片做ICC檢測(cè)明確腺癌的來(lái)源，并且細(xì)胞塊也為不耐受手術(shù)的晚期腫瘤患者的后續(xù)基因檢測(cè)提供了條件。藍(lán)旭麗[9]認(rèn)為鑒于陰道鏡活檢取材的局限性，細(xì)胞塊有明顯優(yōu)勢(shì)，它可以把臨床采集的幾乎所有的細(xì)胞收集起來(lái)通過(guò)連續(xù)切片可能會(huì)看到陰道鏡活檢陰性的病變。本文研究中細(xì)胞塊漏檢8例(宮內(nèi)膜腺癌5例，宮頸原發(fā)腺癌1例，卵巢漿液性癌2例)，其中3例宮內(nèi)膜腺癌和2例卵巢漿液性癌通過(guò)細(xì)胞塊連續(xù)切片并未查見(jiàn)腫瘤細(xì)胞，我們分析是由于卵巢和宮內(nèi)膜癌從原發(fā)灶脫落并移到子宮頸口或陰道的腫瘤細(xì)胞數(shù)量較少，LCT制片完成后用于制備細(xì)胞塊的剩余標(biāo)本僅含有極其稀少的腫瘤細(xì)胞或者已無(wú)腫瘤細(xì)胞；另外2例宮內(nèi)膜腺癌和1例宮頸原發(fā)腺癌通過(guò)連續(xù)切片后查見(jiàn)腺癌細(xì)胞。我們建議在制備細(xì)胞塊時(shí)盡可能最大量的收集細(xì)胞成分，比如反復(fù)沖洗涮出保存瓶?jī)?nèi)刷頭上殘余的細(xì)胞及小組織碎片，另外需要注意在細(xì)胞塊修片時(shí)少修并且連續(xù)切片8張以上以提高細(xì)胞塊中的陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)。

宮頸脫落細(xì)胞學(xué)診斷腺癌時(shí)，我們?cè)诳紤]宮頸原發(fā)病變的同時(shí)，也要考慮到有子宮內(nèi)膜、卵巢和輸卵管等鄰近生殖器官惡性腫瘤脫落或累及的可能。文獻(xiàn)報(bào)道[13]約30%的內(nèi)膜癌、7%的卵巢癌患者的宮頸涂片中可以發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞，內(nèi)膜癌比卵巢癌容易更早期出現(xiàn)于宮頸涂片中。內(nèi)膜、卵巢等生殖道來(lái)源的癌細(xì)胞脫落或累及至宮頸時(shí)可以與原發(fā)宮頸癌的癥狀相似,臨床癥狀上均表現(xiàn)為不規(guī)則陰道出血或排液，患者常規(guī)進(jìn)行宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查，可以及早地發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜、卵巢等部位的腫瘤性病變。腺癌細(xì)胞從原發(fā)灶脫落又移到子宮頸口或陰道，惡性細(xì)胞常常退變明顯，細(xì)胞清晰度不佳且細(xì)胞量較少，LCT通常表現(xiàn)為無(wú)特異性的三維立體或巢團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，而細(xì)胞塊中可以查見(jiàn)更易辨識(shí)的典型形態(tài)學(xué)特征：如宮內(nèi)膜樣腺癌中由復(fù)層腺上皮圍成的腺腔結(jié)構(gòu)、卵巢漿液性癌的砂粒體結(jié)構(gòu)等，在細(xì)胞塊形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上加做相關(guān)ICC檢測(cè)就能進(jìn)一步明確腺癌來(lái)源。另外，宮頸脫落細(xì)胞學(xué)查見(jiàn)腺癌細(xì)胞，除了生殖道來(lái)源外，還需要考慮到少見(jiàn)的子宮外腫瘤的轉(zhuǎn)移。本文研究中確診肺腺癌宮頸轉(zhuǎn)移1例，肺腺癌宮頸轉(zhuǎn)移國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道罕見(jiàn)，經(jīng)過(guò)檢索截止目前僅有6例[14-19]，本例既往有肺癌病史，且細(xì)胞塊切片中的平鋪狀腺樣結(jié)構(gòu)不同于內(nèi)膜及頸管腺癌，結(jié)合TTF-1(+)、NapsinA(+)、CK7(+)、SP-B(+)、CK20(-)支持肺腺癌宮頸轉(zhuǎn)移的診斷。鑒別宮頸腺癌是原發(fā)還是子宮外遠(yuǎn)隔部位的轉(zhuǎn)移十分重要，臨床上宮頸的早期原發(fā)腺癌首選手術(shù)治療、中晚期輔以放射治療[20]，而子宮外腫瘤轉(zhuǎn)移至宮頸，臨床分期晚，治療主要以針對(duì)原發(fā)灶的治療為主。

綜上所述，宮頸脫落細(xì)胞的細(xì)胞塊制備操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，細(xì)胞塊具有形似組織學(xué)結(jié)構(gòu)的特征并可在其基礎(chǔ)上做ICC及基因檢測(cè)，我們建議在宮頸細(xì)胞學(xué)篩查時(shí)，對(duì)LCT診斷腺上皮細(xì)胞異常病例可以常規(guī)制備細(xì)胞塊進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)。

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