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    川芎嗪聯(lián)合順鉑通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT/mTOR通路對(duì)人肺癌A549細(xì)胞侵襲能力及線粒體功能的影響*

    2021-04-02 07:02:36龐皓玥胡凱文孫滿強(qiáng)周天
    腫瘤預(yù)防與治療 2021年3期
    關(guān)鍵詞:肺癌

    龐皓玥,胡凱文,孫滿強(qiáng),周天

    100029 北京,北京中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院(龐皓玥、孫滿強(qiáng));100078 北京,北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 腫瘤科(胡凱文、周天)

    腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥致死的主要原因,如何有效抗轉(zhuǎn)移仍是臨床腫瘤治療難以攻克的關(guān)鍵問(wèn)題。有研究發(fā)現(xiàn),代謝模式變化在腫瘤轉(zhuǎn)移中必不可少[1]。癌細(xì)胞在有氧狀態(tài)下,糖酵解途徑供能增強(qiáng),而有氧磷酸化供能比例下降,這種代謝模式可以通過(guò)保證缺氧條件下的供能、提供大量合成原料、形成酸性微環(huán)境抑制免疫等途徑[2],為癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。線粒體損傷是腫瘤代謝模式變化的基礎(chǔ),如線粒體內(nèi)酶表達(dá)異常、膜通透性改變、ROS生成異常等,均有助于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[3]。因此,從能量代謝與線粒體損傷角度進(jìn)行研究,對(duì)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲能力具有重要意義。

    長(zhǎng)期以來(lái),中醫(yī)活血化瘀法被廣泛應(yīng)用于晚期癌癥患者的臨床治療中。川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是經(jīng)典活血化瘀藥川芎的主要成分,具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖的藥理作用。順鉑(Cisplatin,DDP)是傳統(tǒng)化療藥物,經(jīng)研究證實(shí),TMP與DDP的聯(lián)合,可以增強(qiáng)對(duì)非小細(xì)胞肺癌的抑制作用[4-6]。本課題組前期研究表明,TMP聯(lián)合DDP可以調(diào)控Twist表達(dá),從而抑制細(xì)胞增殖[7],而PI3K/AKT/mTOR通路為T(mén)wist上游,是細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子。因此,本研究從能量代謝角度,探討TMP聯(lián)合DDP的抗腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞株及試劑

    人肺腺癌A549細(xì)胞株購(gòu)于上海蓋寧生物科技有限公司。TMP標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司(貨號(hào):B20203);DDP標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司(貨號(hào):B24462);JC-1試劑盒購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)有限公司(貨號(hào):KGA602)。一抗:GAPDH monoclonal antibody、mTOR polyclonal Rabbit antibody、Phospho-mTOR(Ser2448) Rabbit Antibody、PI3K p85 Monoclonal antibody、AKT Monoclonal antibody購(gòu)于Proteintech公司(貨號(hào):60004-1-Ig、20657-1-AP、AF3308、60225-1-Ig、60203-2-Ig);二抗:Goat Anti-Rabbit IgG H+L、Goat Anti-Mouse IgG H+L購(gòu)于中杉金橋公司(貨號(hào):ZB-2301、ZB-2305)

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

    人肺腺癌A549細(xì)胞采用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM(高糖)培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每日觀察其生長(zhǎng)情況,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、DDP組、DDP聯(lián)合高、中、低劑量TMP組(DDP+TMP)。根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定TMP高、中、低劑量藥物濃度,DDP藥物濃度通過(guò)查找相關(guān)文獻(xiàn)確定為2 μg/mL[8],藥物處理時(shí)間24 h。

    1.3 CCK-8法測(cè)定TMP對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響

    以人肺腺癌A549細(xì)胞為測(cè)試細(xì)胞株,選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁腫瘤細(xì)胞,用胰酶消化后,以含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個(gè)/mL,將上述細(xì)胞懸液加入96孔板,每孔100 μL,37℃、5%CO2培養(yǎng)12 h后細(xì)胞貼壁。各實(shí)驗(yàn)組孔分別加入16 mM、8 mM、4 mM、2 mM、1 mM、0.5 mM梯度濃度的TMP標(biāo)準(zhǔn)品,對(duì)照組不加入藥物,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后進(jìn)行增殖能力檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)每孔加入CCK-8溶液10 μL,繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中1 h。采用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值,計(jì)算各組抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[(對(duì)照組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組平均OD值)/(對(duì)照組平均OD值-空白組平均OD值)]×100%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定DDP+TMP高、中、低劑量組TMP的藥物濃度。

    1.4 TMP聯(lián)合DDP對(duì)肺癌A549細(xì)胞形態(tài)的影響

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549細(xì)胞,以5×105個(gè)/mL細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合至75%以上時(shí),按照分組加入DDP及不同濃度TMP處理細(xì)胞。將干預(yù)后的細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,倒置顯微鏡下(放大倍數(shù)為200倍)觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照。

    1.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)測(cè)定腫瘤細(xì)胞侵襲能力

    在Transwell小室上室面加入100 μL用DMEM培養(yǎng)基稀釋的Matrigel(體積稀釋比例為1∶8),下室面用移液槍頭涂抹Fibronectin(濃度0.5 mg/mL),置于37℃培養(yǎng)箱中包被2 h,使Matrigel凝固成膠,4℃過(guò)夜風(fēng)干。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞,加入DDP及TMP處理細(xì)胞,用藥干預(yù)24 h。接種細(xì)胞前拿出小室,吸出小室中殘余液體,每小室加入100 μL DMEM,37℃孵育30 min,水化基底膜。收集各組細(xì)胞,重懸于不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL細(xì)胞。將各組細(xì)胞接種于Transwell小室的上室中,接種體積為200 μL(1×104個(gè)細(xì)胞),下室中加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后取出小室,PBS洗2次,加入4%多聚甲醛,室溫固定15 min,PBS洗2次,用棉簽擦拭小室上室面未穿過(guò)小室膜的細(xì)胞,用結(jié)晶紫染色15 min后,在倒置顯微鏡(放大倍數(shù)為200倍)下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)2次。

    1.6 透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)

    取各組細(xì)胞消化,離心,制備成1×106個(gè)/mL細(xì)胞,棄上清,留下層細(xì)胞,加入3%戊二醛固定液固定2 h, 1%鋨酸固定1 h,逐級(jí)乙醇、丙酮脫水后, 環(huán)氧樹(shù)脂包埋, 超薄切片,經(jīng)鈾、鉛雙重染色后,1200EX透射電鏡觀測(cè)各組細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)變化。

    1.7 JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)線粒體膜電位

    收集DDP及TMP干預(yù)后各組細(xì)胞量為1×106個(gè)/管, 用 PBS 洗滌細(xì)胞2次(離心2 000 r/min,5 min),取100 μL 10× Incubation Buffer加900 μL滅菌去離子水稀釋成1×Incubation Buffer,混勻并預(yù)熱至37℃,吸取500 μL加入1 μL JC-10,渦旋混勻配成JC-10工作液,取500 μL JC-10工作液將細(xì)胞均勻懸浮,37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15~20 min;室溫離心(2 000 r/min,5min)收集細(xì)胞,用1×Incubation Buffer洗兩次;吸取500 μL 1×Incubation Buffer重新懸浮細(xì)胞;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(Ex=488 nm;Em=530 nm)線粒體膜電位,設(shè)未經(jīng)處理的正常細(xì)胞為陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組,根椐陰性和陽(yáng)性對(duì)照組的雙參數(shù)散點(diǎn)圖來(lái)設(shè)定門(mén)的位置。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)2次。

    1.8 Western blot 檢測(cè) PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR的表達(dá)

    取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合至75%以上時(shí),加入DDP及相應(yīng)濃度的TMP干預(yù)細(xì)胞,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1),用細(xì)胞刮刀刮下,收集至離心管,冰上裂解25 min后,12 000 r/min,4℃,離心10 min,取上清液為蛋白樣品,采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,將蛋白樣品加入5×蛋白上樣緩沖液,置于100℃水浴中變性5 min。SDS-PAGE分離蛋白,根據(jù)目的蛋白的相對(duì)分子量配制相應(yīng)的分離膠濃度(10%)。加樣后分別進(jìn)行蛋白電泳、蛋白電轉(zhuǎn)移至PVE膜,5%脫脂奶粉常溫封閉1.5 h。將封閉后的膜按照目標(biāo)蛋白所處位置進(jìn)行剪切,分別加入對(duì)應(yīng)的一抗PI3K(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000),4℃反應(yīng)過(guò)夜。TBST洗膜3次,5min/次;根據(jù)一抗的種屬選擇相應(yīng)的二抗(Goat Anti-Rabbit IgG、Goat Anti-Mouse IgG,稀釋比例為1∶10 000)37℃孵育2 h。最后ECL發(fā)光、顯影、拍照。相對(duì)蛋白含量用各蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶的灰度值來(lái)表示。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)2次。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    運(yùn)用軟件SPSS 17.0 進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì),計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組均數(shù)比較采用單因素分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 TMP對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響,確定給藥濃度

    CCK-8結(jié)果顯示,運(yùn)用梯度濃度TMP干預(yù)肺癌A549細(xì)胞后,細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴(lài)性,隨著TMP濃度升高,其增殖抑制率也增高。與對(duì)照組相比,TMP對(duì)A549肺癌細(xì)胞的抑制差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。取TMP干預(yù)肺癌A549細(xì)胞的近半數(shù)抑制濃度,確認(rèn)TMP高、中、低給藥劑量分別為2 mM、1 mM、0.5 mM(表1)。

    表1 CCK-8測(cè)定TMP對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用(N=6)

    2.2 TMP+DDP對(duì)A549肺癌細(xì)胞形態(tài)的影響

    各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好,細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)梭形,細(xì)胞間排列緊密形成集落。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞隨藥物濃度的增高數(shù)量減少,形態(tài)改變;其中DDP+TMP(2 mM)組、DDP+TMP(1 mM)組、DDP+TMP(0.5 mM)組細(xì)胞由具有較高侵襲能力的細(xì)長(zhǎng)梭形變?yōu)榍忠u能力較弱的圓形,細(xì)胞體積縮小,部分可見(jiàn)細(xì)胞核固縮,胞漿內(nèi)可見(jiàn)顆粒和碎片,細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制(圖1)。

    圖1 不同濃度TMP+DDP對(duì)于A549細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)

    2.3 TMP+DDP對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響

    Transwell小室法檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均可使穿過(guò)鋪有人工基質(zhì) Matrigel 濾膜的細(xì)胞數(shù)量明顯降低,DDP+TMP(2mM)組細(xì)胞穿膜數(shù)量最低。隨著 TMP 濃度的增高,細(xì)胞侵襲數(shù)逐漸減少,侵襲抑制作用逐漸增強(qiáng),且穿膜面細(xì)胞形態(tài)趨于圓形(圖2)。

    圖2 不同濃度TMP+DDP對(duì)于A549細(xì)胞侵襲能力的影響(×200)

    2.4 TMP+DDP對(duì)A549細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響

    運(yùn)用透射電鏡觀察各組癌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)可見(jiàn),與對(duì)照組相比,應(yīng)用 DDP 使細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡壞死,線粒體多呈圓形,雙層膜結(jié)構(gòu)模糊,線粒體嵴數(shù)量較少,排列紊亂,肌節(jié)斷裂;聯(lián)合應(yīng)用TMP后,細(xì)胞內(nèi)線粒體形狀趨于橢圓形,且隨TMP劑量增高,線粒體形態(tài)更加飽滿,線粒體嵴數(shù)量較多,排列較清晰(圖3)。

    圖3 電鏡觀察不同濃度TMP+DDP干預(yù)A549細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)(×30 000)

    2.5 TMP+DDP對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位的影響

    JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位顯示,與對(duì)照組相比,各組線粒體膜電位均顯著降低(P<0.05),但DDP+TMP組線粒體膜電位較DDP組升高,且隨TMP濃度升高,線粒體膜電位有升高的趨勢(shì),DDP+TMP(2mM)組較DDP組線粒體膜電位升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05(圖4)。

    圖4 不同濃度TMP+DDP干預(yù)A549細(xì)胞線粒體膜電位變化(JC-1)

    2.6 TMP+DDP對(duì)A549細(xì)胞 PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響

    Western blot檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR通路蛋白,結(jié)果顯示(圖5),與對(duì)照組相比,DDP組及DDP+TMP組均可下調(diào)PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)(P<0.05)。DDP+TMP組在降低各蛋白表達(dá)方面優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用DDP組,且隨TMP濃度升高,各蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。與DDP組相比,DDP+TMP(2mM)組可明顯下調(diào)PI3K、mTOR和p-mTOR蛋白表達(dá)(P<0.05),DDP+TMP(1mM)組可下調(diào)mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)(P<0.05)。

    圖5 DDP+TMP對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路表達(dá)的影響

    3 討 論

    近年來(lái),有關(guān)癌細(xì)胞能量代謝特征的研究受到越來(lái)越多重視,能量代謝重構(gòu)被認(rèn)為參與了癌癥的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程。早在1920s,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞能量代謝的糖酵解途徑異常活躍,并認(rèn)為其與線粒體損傷有關(guān)[9]。腫瘤細(xì)胞極活躍的代謝活動(dòng),造成周?chē)h(huán)境的乏氧狀態(tài),而癌細(xì)胞線粒體功能受損,促進(jìn)了糖酵解途徑供能,保證了腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的能量需求[10]。線粒體功能受損還與腫瘤細(xì)胞抵抗凋亡、逃避免疫監(jiān)督等有助于腫瘤轉(zhuǎn)移的特性密切相關(guān)[11]。這使靶向線粒體的治療手段成為近年來(lái)腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

    中醫(yī)對(duì)癌癥常伴有血瘀狀態(tài)的認(rèn)知,與腫瘤周?chē)脱?、酸性微環(huán)境的形成十分相似。研究表明,活血化瘀中藥可以通過(guò)抑制血管生成,改善乏氧微環(huán)境等機(jī)制,發(fā)揮抗腫瘤作用[12]。而癌細(xì)胞有氧糖酵解的能量代謝異常,增強(qiáng)了其對(duì)周?chē)h(huán)境的適應(yīng)性。因此,我們推測(cè)中醫(yī)活血化瘀藥改善乏氧微環(huán)境狀態(tài),從根本上改變了線粒體損傷的環(huán)境壓力,從而使線粒體有氧代謝的功能恢復(fù),抑制糖酵解的發(fā)生,最終控制腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移。研究顯示,活血化瘀中藥改善缺氧環(huán)境作用與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路密切相關(guān)[13]。其中,AKT磷酸化后可降低線粒體ATP的消耗,使組織維持較低的線粒體膜電位,進(jìn)而減少鈣離子進(jìn)入線粒體和再灌注初期活性氧的生成[14]。因此,PI3K/AKT/mTOR通路很可能是活血化瘀中藥調(diào)節(jié)線粒體功能發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵機(jī)制。目前該研究思路還鮮有報(bào)道,值得深入挖掘。

    TMP是傳統(tǒng)中醫(yī)活血藥川芎、當(dāng)歸的主要成分,可以通過(guò)改善血液高凝狀態(tài)、抗腫瘤血管生成,改善乏氧微環(huán)境等方面抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移[15]。DDP是治療非小細(xì)胞肺癌常用的化療藥物,其通過(guò)阻礙腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制,從而抑制細(xì)胞的有絲分裂,雖然抗腫瘤效果明顯但毒性較強(qiáng)。TMP與DDP聯(lián)合使用,不僅能增強(qiáng)抗腫瘤效果,還能降低化療藥物引起的毒副作用,多項(xiàng)研究支持TMP聯(lián)合DDP在肺癌治療領(lǐng)域良好的應(yīng)用前景[16-17]。本研究擬從改善腫瘤代謝角度,闡述DDP聯(lián)合TMP抑制肺癌細(xì)胞過(guò)程中TMP發(fā)揮的作用。

    本研究首先通過(guò)CCK-8法確定TMP的用藥濃度,再觀察TMP聯(lián)合DDP對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲能力的影響。經(jīng)TMP及DDP干預(yù)24 h后,顯微鏡下觀察肺癌A549細(xì)胞體積縮小,變?yōu)閳A形,部分細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)顆粒和碎片,細(xì)胞增殖速度減慢,與對(duì)照組形成較大差異。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穿膜數(shù)量均少于對(duì)照組(P<0.05),且TMP聯(lián)合DDP對(duì)細(xì)胞穿膜的抑制明顯增強(qiáng)。以上結(jié)果說(shuō)明TMP聯(lián)合DDP可以抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲,且隨TMP劑量升高效用更加明顯。因此可以推測(cè),TMP聯(lián)合DDP增強(qiáng)了對(duì)A549細(xì)胞增殖及侵襲能力的抑制作用,較單獨(dú)應(yīng)用DDP效果更佳,且表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。

    線粒體功能正常有賴(lài)于其結(jié)構(gòu)的完整,已有的研究顯示,腫瘤細(xì)胞的線粒體普遍存在DNA突變,拷貝數(shù)變化、線粒體膜穩(wěn)定性以及線粒體結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)改變等結(jié)構(gòu)異常,而線粒體功能隨之發(fā)生紊亂,并與實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。如線粒體膜電位發(fā)生改變,增加抗凋亡蛋白的表達(dá),延長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞壽命,減少轉(zhuǎn)移侵襲過(guò)程中的損耗[19]。本研究通過(guò)透射電鏡觀察各組細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),單獨(dú)使用DDP后細(xì)胞主要發(fā)生空泡壞死,線粒體受損,表現(xiàn)為嵴數(shù)量較少且排列紊亂;聯(lián)合應(yīng)用TMP后,線粒體形態(tài)更為飽滿,且形狀趨于橢圓形,可見(jiàn)排列清晰的嵴。這提示TMP可以降低線粒體損傷程度,使其發(fā)揮正常功能。同時(shí),本研究還對(duì)線粒體膜電位進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,DDP及DDP+TMP組線粒體膜電位均顯著下降(P<0.05),但聯(lián)合應(yīng)用TMP使線粒體膜電位較單獨(dú)應(yīng)用DDP有所升高,且隨TMP濃度升高,線粒體膜電位有升高的趨勢(shì),其中,高劑量組線粒體膜電位升高較為明顯(P<0.05)。因此,我們推測(cè)TMP可以促進(jìn)線粒體的正常功能,從而影響腫瘤細(xì)胞代謝。

    PI3K/AKT通路是調(diào)控細(xì)胞能量代謝的經(jīng)典通路,研究表明,其可以通過(guò)調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α表達(dá),從而調(diào)控癌細(xì)胞的能量代謝模式,增加癌細(xì)胞對(duì)周?chē)ρ醐h(huán)境的適應(yīng)性[20]。mTOR是PI3K/AKT下游的關(guān)鍵激酶, PI3K/AKT/mTOR通路可以上調(diào)癌細(xì)胞糖酵解相關(guān)酶的活性,加強(qiáng)糖酵解過(guò)程[21]。另有一項(xiàng)三陰性乳腺癌細(xì)胞的研究顯示,AKT的激活可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的線粒體代謝和氧化磷酸化[22]。本研究利用Western blot檢測(cè)肺癌A549細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),TMP聯(lián)合DDP可使肺癌A549細(xì)胞內(nèi)PI3K、AKT及mTOR蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05),TMP聯(lián)合DDP組對(duì)PI3K/AKT/mTOR通路的抑制作用要優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用DDP組,且呈濃度依賴(lài)性。同時(shí),mTOR磷酸化修飾(p-mTOR)減少,即mTOR蛋白活性也受到了影響。這提示TMP聯(lián)合DDP增強(qiáng)了對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的抑制作用,與肺癌A549細(xì)胞的線粒體功能及能量代謝改變相關(guān)。

    綜上所述,TMP聯(lián)合DDP能抑制腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力,其機(jī)制可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR通路,改善線粒體功能,進(jìn)而使癌細(xì)胞能量代謝模式發(fā)生改變,發(fā)揮聯(lián)合抗腫瘤作用。

    作者聲明:本文全部作者對(duì)于研究和撰寫(xiě)的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任;并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存,可接受核查。

    學(xué)術(shù)不端:本文在初審、返修及出版前均通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)的學(xué)術(shù)不端檢測(cè)。

    同行評(píng)議:經(jīng)同行專(zhuān)家雙盲外審,達(dá)到刊發(fā)要求。

    利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。

    文章版權(quán):本文出版前已與全體作者簽署了論文授權(quán)書(shū)等協(xié)議。

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