沉默GTPBP4基因表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、侵襲和化療敏感性影響*

張翠紅，呂欣，侯春立，張建軍，馬博敬，范才

050082 石家莊，解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八〇醫(yī)院 放療科(張翠紅、張建軍、馬博敬、范才)， 腫瘤科(侯春立)；055450 河北 邢臺(tái)，柏鄉(xiāng)縣中心醫(yī)院 醫(yī)務(wù)科(呂欣)

癌癥是目前人類最致命的疾病之一，而食管癌在癌癥導(dǎo)致的死亡中排名第8，并且大約一半的病例發(fā)生在中國(guó)，食管鱗狀細(xì)胞癌占食管癌病例的90%[1-2]。手術(shù)輔以放化療的綜合治療手段是目前臨床絕大多數(shù)中晚期食管癌患者的主要治療措施，并且新輔助化療改善了食管癌患者的預(yù)后，大大提高了患者術(shù)后5年的生存率[3-4]。因此，如何有效提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性已經(jīng)成為當(dāng)前食管癌研究的一個(gè)新方向。

GTP結(jié)合蛋白4(GTP binding protein 4，GTPBP4)是一種定位于核仁的新型G蛋白，參與核糖體60S亞基合成和成熟的鳥苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase,GTPase)的一個(gè)新成員，與細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)密切相關(guān)，是近年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因[5-6]。目前僅少部分研究發(fā)現(xiàn)GTPBP4可能對(duì)結(jié)腸癌[7]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[8]的生物學(xué)行為有一定影響，但有關(guān)GTPBP4在食管癌中的研究相對(duì)較少，有關(guān)其在食管癌化療敏感性方面的研究更是鮮見。本研究首先通過GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，分析食管癌患者組織中GTPBP4的表達(dá)情況，然后將LV-GTPBP4-siRNA干擾慢病毒轉(zhuǎn)染至食管癌EC109細(xì)胞，觀察沉默GTPBP4基因后對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、侵襲能力及化療敏感性的影響，為食管癌基礎(chǔ)和臨床研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人食管黏膜上皮細(xì)胞系(human esophageal epithelial cell,HEEC)及食管癌細(xì)胞系EC109、EC9706和KYSE-150均購(gòu)自中國(guó)細(xì)胞資源庫(kù)(北京)，液氮中保存。DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清FBS購(gòu)自中國(guó)Gibco公司；pGCSIL-GFP/LV-GTPBP4-siRNA慢病毒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司；氟尿嘧啶(5-Fu，每支250 mg，批號(hào)：1236)，為天津金耀氨基酸有限公司產(chǎn)品；順鉑(100 mg，貨號(hào)：J-SD8810-100)，為上海研謹(jǐn)生物有限公司產(chǎn)品。CCK8試劑購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PCR引物序列購(gòu)自上海生工生物股份有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒和SYBY Green PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；兔多克隆抗體GTPBP4和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自中國(guó)武漢proteintech公司；細(xì)胞裂解及蛋白抽提試劑、蛋白濃度檢測(cè)試劑考馬斯亮藍(lán)、Western blot配膠試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜、ECL發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)MJ Research Inc公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人食管黏膜上皮細(xì)胞系HEEC及食管癌細(xì)胞系EC109、EC9706和KYSE-150均在含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，用含0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative pol-ymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測(cè)GTPBP4mRNA的表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4種細(xì)胞，按Trizol操作說明書提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)及確定核糖核酸濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。GTPBP4基因的上游引物序列為5’-GATGAAGTATGGCG-ACTCTCTCT-3’，下游引物序列為5’-GTATTCGGATCAATGGTTGGCA-3’；內(nèi)參照 β-actin的上游引物序列為5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游引物序列為5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’(引物購(gòu)自上海生工生物股份有限公司)。PCR反應(yīng)條件：95℃ 2 min ；95℃ 15 s，60℃ 1 min ；共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)中每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，以2-ΔΔCt值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Western blot檢測(cè)GTPBP4蛋白的表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4種細(xì)胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒操作說明提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗(GTPBP4：1∶1 000)，4℃搖床孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG(1∶2 000)，室溫下孵育1.5 h，化學(xué)發(fā)光儀上進(jìn)行顯色，β-actin作為內(nèi)參，利用Image J圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 慢病毒感染EC109細(xì)胞 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109細(xì)胞，胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，以1.5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到約30%；根據(jù)制造商的指南進(jìn)行感染，感染復(fù)數(shù)值(multiplicity of infection,MOI)為10，加入適宜量LV-GTPBP4-siRNA病毒，設(shè)為干擾組(LV-GTPBP4-siRNA組);陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染含有非特異性干擾序列的陰性病毒(LV-NC組)；未做任何處理的細(xì)胞為空白對(duì)照組(NC組)。感染72 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況，熒光率大于80%，收集各組細(xì)胞提取RNA和蛋白，以實(shí)時(shí)PCR和Western blot檢測(cè)沉默效率；感染效率低于80%的實(shí)驗(yàn)組，重新進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取慢病毒感染72 h后的3組EC109細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種100 μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，96孔板放入孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 后，更換新鮮無血清培養(yǎng)基100 μL，各孔加入CCK-8 溶液10 μL，放入37℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(optical density, OD)，使用GraphPad Prism 7.0軟件繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線。

1.2.6 流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周期分布 慢病毒感染后72 h的3組EC109細(xì)胞，胰酶消化并收集3組細(xì)胞，用PBS洗滌并重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，取1mL單細(xì)胞懸液，離心去上清，加入1mL 70%的預(yù)冷乙醇，4℃固定過夜。染色前用PBS洗滌2次，加入100 mg/L的RNaseA，37℃水浴30 min。再加入500 μL(50 mg/L)，碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色液混勻，4℃避光反應(yīng)30 min后，轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，每組重復(fù)3次。

1.2.7 CCK8檢測(cè)EC109細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性 慢病毒感染72 h后收集NC組、LV-NC組和LV-GTPBP4-siRNA組細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔約2×103個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，分別加入0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol的順鉑，或0、25、50、100、200、400 μmol的5-氟尿嘧啶，其中0 μmol為對(duì)照組，同時(shí)設(shè)立空白組(只含培養(yǎng)基不含藥物和細(xì)胞)進(jìn)行校正，每組樣品5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加人CCK8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的OD值，細(xì)胞存活率(cell survival rate,CSR)=(ODLV-GTPBP4-siRNA組-OD空白組)/(ODNC組-OD空白組)×100%，細(xì)胞抑制率(cell inhibition,CI)=1-細(xì)胞存活率。使用GraphPad Prism 7.0軟件計(jì)算細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(50% inhibiting concentration,IC50)及繪制細(xì)胞存活率曲線。

1.2.8 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 用DMEM培養(yǎng)液將預(yù)包被基質(zhì)膠Matrigel稀釋(1∶6)，取80 μL加入至Transwell上室，37℃放置過夜。慢病毒感染72 h后收集NC組、LV-NC組和LV-GTPBP4-siRNA組細(xì)胞，接種于6孔板中，每孔約5×104個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別加入終濃度為3 μg/mL的順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，胰酶消化制備成每孔4×104個(gè)細(xì)胞懸液，接種至Transwel上室鋪勻(已鋪基質(zhì)膠)，下室加入600 μL含20% FBS的DMEM培養(yǎng)液，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用棉簽拭去聚碳酸酯膜表面的Matrigel膠，PBS沖洗，4%的多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS沖洗晾干，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞，以此反映細(xì)胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析GTPBP4在人食管癌組織中的表達(dá)

GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中分析16例人正常食管組織及配對(duì)16例食管癌組織中GTPBP4的表達(dá)情況。結(jié)果表明，人食管癌組織中GTPBP4明顯高于正常食管組織(P<0.001)(圖1)。 以上結(jié)果提示，GTPBP4基因作為癌基因，可能與食管癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。

圖1 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析GTPBP4在人食管癌組織中的表達(dá)(****P<0.001)

2.2 人食管黏膜上皮細(xì)胞和食管鱗癌細(xì)胞系GTPBP4的表達(dá)

RT-qPCR和Western blot法檢測(cè)人食管黏膜上皮細(xì)胞系HEEC及食管癌細(xì)胞系EC9706、EC109和KYSE-150細(xì)胞GTPBP4mRNA和蛋白表達(dá)水平。EC9706、EC109和KYSE-150細(xì)胞GTPBP4mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為2.66±0.32、4.62±0.06、3.38±0.17，明顯高于HEEC細(xì)胞(均P<0.001)(圖2A)；EC9706、EC109和KYSE-150細(xì)胞GTPBP4蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為2.46±0.56、3.95±0.36、3.18±0.10，明顯高于HEEC細(xì)胞(P<0.01，P<0.001，P<0.001)(圖2B、C)，其中EC109細(xì)胞GTPBP4mRNA和蛋白表達(dá)水平較EC9706和KYSE-150細(xì)胞升高更為明顯，故以EC109細(xì)胞系作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。

圖2 人食管黏膜上皮細(xì)胞和食管鱗癌細(xì)胞系GTPBP4的表達(dá)(*** P<0.01,**** P<0.001)

2.3 GTPBP4基因沉默效果的測(cè)定

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組(1.00±0.00)比較，LV-GTPBP4-siRNA組(0.62±0.06)EC109細(xì)胞中GTPBP4mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030)，NC組與LV-NC組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.930)(圖3A)。

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組(101.30±4.00)比較，LV-GTPBP4-siRNA組(48.22±2.84)EC109細(xì)胞中GTPBP4蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，NC組與LV-NC組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.550)(圖3B、C)。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot法分別檢測(cè)沉默GTPBP4表達(dá)后EC109細(xì)胞中GTPBP4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平變化(*P<0.05, **** P<0.001)

2.4 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力及流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周期

CCK8法分別比較24、48和72 h時(shí)3組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，雙因素方差分析，F(xiàn)組間=366.500，P<0.001，F(xiàn)時(shí)間=8 097.000，P<0.001，F(xiàn)組間×?xí)r間=98.410，P<0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別比較各時(shí)間點(diǎn)3組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，24 h時(shí)3組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.094)；與NC組比較，LV-GTPBP4-siRNA組EC109細(xì)胞在48 h、72 h生長(zhǎng)抑制明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)，而NC組與LV-NC組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.063，P=0.063)。組間比較：與NC組相比，LV-GTPBP4-siRNA組細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制(P<0.001)(圖4A)。以上結(jié)果提示，沉默GTPBP4基因表達(dá)可使食管癌EC109細(xì)胞的增殖能力降低。

流式細(xì)胞法檢測(cè)結(jié)果顯示：與NC組比較(55.31±0.43)%，LV-GTPBP4-siRNA組EC109細(xì)胞周期G0/G1期的細(xì)胞數(shù)增多(70.62±1.21)%，而S期細(xì)胞數(shù)減少，分別為(26.10±0.76)%，(19.27±1.17)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)(圖4B、C)。上述結(jié)果表明，沉默GTPBP4基因表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯，從而抑制細(xì)胞的增殖。

圖4 CCK8法和流式細(xì)胞法檢測(cè)沉默GTPBP4基因?qū)C109細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞周期的影響(**** P<0.001)

2.5 CCK8檢測(cè)EC109細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性

慢病毒感染EC109細(xì)胞后加入不同濃度順鉑或5-氟尿嘧啶，結(jié)果表明，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞的存活率逐漸下降。順鉑處理后NC組IC50為185.60 μmol/L，LV-GTPBP4-siRNA組IC50為150.10 μmol/L；5-氟尿嘧啶處理后NC組IC50為402.20 μmol/L，LV-GTPBP4-siRNA組IC50為203.10 μmol/L，兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖5)。結(jié)果表明，沉默GTPBP4基因表達(dá)后細(xì)胞對(duì)兩種化療藥物更加敏感。

圖5 CCK8法檢測(cè)沉默GTPBP4基因后EC109細(xì)胞的化療敏感性(**** P<0.001, *** P<0.01)

2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，慢病毒感染EC109細(xì)胞后，細(xì)胞的侵襲能力發(fā)生了改變，與NC組(976.00±17.58)相比，LV-GTPBP4-siRNA組的穿膜細(xì)胞數(shù)量(518.00±54.49)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖6A、B)。慢病毒感染EC109細(xì)胞聯(lián)合化療藥物順鉑處理后，與NC組(701.00±84.66)相比，LV-GTPBP4-siRNA組的穿膜細(xì)胞數(shù)量(354.30±49.69)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)(圖6C、D)。以上結(jié)果提示沉默GTPBP4基因表達(dá)，可明顯增加順鉑抑制食管癌細(xì)胞侵襲的能力，提高藥物敏感性。

圖6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默GTPBP4基因表達(dá)聯(lián)合順鉑對(duì)EC109細(xì)胞體外侵襲能力變化(****P<0.001，** P=0.001)

3 討 論

GTPBP4，也稱為慢性腎功能衰竭蛋白(chronic renal failure geneprotein，CRFG)，是由10號(hào)染色體長(zhǎng)臂14-15區(qū)(10q15-14)編碼、由633個(gè)氨基酸組成的重要功能蛋白，是一種定位于核仁的新型G蛋白，故也稱作核仁GTP結(jié)合蛋白1(nucleolar GTP-binding protein 1,NOG1)[9-10]。當(dāng)前，對(duì)于該基因的研究較少，許多機(jī)制功能需要進(jìn)一步探究，目前研究顯示該蛋白主要參與核糖體60S亞基的合成和成熟，還和腎病末期的發(fā)展有密切關(guān)系[11-12]。但是對(duì)于該基因和腫瘤的關(guān)系研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中，GTPBP4表達(dá)水平下調(diào)，轉(zhuǎn)染GTPBP4過表達(dá)質(zhì)粒后，可明顯降低雪旺氏細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA合成及裸鼠成瘤的能力，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GTPBP4抑制細(xì)胞增殖的能力是通過調(diào)節(jié)Merlin蛋白、CyclinD1蛋白實(shí)現(xiàn)的，從而扮演抑癌基因角色[8]。但也有研究和上述結(jié)果不一致，在乳腺癌中，GTPBP4呈高表達(dá)，且與預(yù)后差、生存期短呈正相關(guān)[13-14]。另有研究發(fā)現(xiàn)：在胃癌組織、多種胃癌細(xì)胞株中GTPBP4表達(dá)均升高，GTPBP4高表達(dá)與胃癌患者的臨床分期、腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，下調(diào)GTPBP4表達(dá)后，胃癌細(xì)胞株MKN-45及AGS的增殖能力及克隆形成減低、凋亡增加[15]，提示該蛋白可能在腫瘤中承擔(dān)潛在癌基因角色。

基于以上研究發(fā)現(xiàn)，GTPBP4在惡性腫瘤中的表達(dá)水平不同(下調(diào)或上調(diào))，提示GTPBP4可能是一種癌基因或抑制基因，主要依賴于特定的腫瘤類型。而到目前為止，GTPBP4與食管癌關(guān)系及食管癌化療藥物敏感性方面的探討尚未被研究。所以，綜合以上研究，我們首先利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)[16]，發(fā)現(xiàn)食管癌組織中GTPBP4表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組。為了證實(shí)這一現(xiàn)象，我們利用人食管黏膜上皮細(xì)胞系HEEC及食管癌細(xì)胞系EC9706、EC109和KYSE-150細(xì)胞系，檢測(cè)GTPBP4mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常食管黏膜上皮細(xì)胞HEEC相比，GTPBP4在食管鱗癌細(xì)胞系EC9706、EC109和KYSE-150中的表達(dá)明顯升高，并且EC109細(xì)胞中GTPBP4表達(dá)水平升高更為明顯，故以EC109細(xì)胞系作為下一步研究的對(duì)象。進(jìn)一步，我們利用慢病毒載體LV-GTPBP4-siRNA感染EC109細(xì)胞，從而靶向沉默GTPBP4基因表達(dá)，采用RT-qPCR及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因沉默效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默GTPBP4基因后，EC109細(xì)胞的中GTPBP4mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯下降，證實(shí)重組慢病毒可以有效沉默GTPBP4基因的表達(dá)。CCK8法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，沉默GTPBP4基因表達(dá)可有效抑制EC109細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯，S期細(xì)胞明顯減少，從而抑制細(xì)胞的增殖，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[17]。

化療是食管癌重要的輔助治療手段，然而在化療過程中，往往會(huì)出現(xiàn)化療不敏感或者化療緩解后復(fù)發(fā)[18-19]。因此，尋找化療抵抗時(shí)的生物學(xué)標(biāo)志物和化療增敏劑、恢復(fù)耐藥腫瘤細(xì)胞的化療敏感性具有重要意義。目前臨床常用于食管癌化療的藥物是順鉑或氟尿嘧啶，本研究通過慢病毒感染食管癌EC109細(xì)胞并經(jīng)化療藥物順鉑作用后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力變化。CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默GTPBP4基因聯(lián)合順鉑或氟尿嘧啶使細(xì)胞的存活率及IC50顯著降低，明顯增加順鉑抑制食管癌細(xì)胞侵襲的能力，提示靶向沉默GTPBP4基因的siRNA和順鉑或氟尿嘧啶具有協(xié)同效應(yīng)，能夠大大改善食管癌細(xì)胞EC109對(duì)化療藥物的敏感性。

既往研究發(fā)現(xiàn)，核糖體生物合成受損會(huì)影響細(xì)胞功能，導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，而這種應(yīng)激反應(yīng)是通過核糖體-Mdm2-p53(ribosomal protein-Mdm2-p53,RP-Mdm2-p53)途徑，阻礙了Mdm2與p53結(jié)合，致使p53泛素化降解障礙，p53通路激活，細(xì)胞周期停滯、損傷修復(fù)、自噬等，在腫瘤發(fā)生過程中有重要作用[20-22]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在具有野生型p53的乳腺癌個(gè)體中，GTPBP4蛋白表達(dá)增加與患者生存率降低相關(guān)，提示GTPBP4可能是促癌基因，且可能是通過抑制p53信號(hào)通路發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[17]。以上研究報(bào)道提示，GTPBP4可能是促癌基因，且可能是通過調(diào)節(jié)p53信號(hào)途徑來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制凋亡而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但對(duì)于本實(shí)驗(yàn)，該理論還需要我們進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明GTPBP4基因在人食管鱗癌組織中高表達(dá)，LV-GTPBP4-siRNA慢病毒載體可有效沉默食管癌EC109細(xì)胞中GTPBP4基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖，降低其侵襲能力，增強(qiáng)人食管鱗癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。雖然其作用機(jī)制還不是很明確， 但該結(jié)果為GTPBP4在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究奠定了基礎(chǔ)，提供了假設(shè)，為探索GTPBP4在食管癌化療增敏及靶向治療方面提供了新思路。

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