NLRCs基因在乳腺癌中的表達(dá)和預(yù)后判斷中的價(jià)值*

禚映辰，張培國，張李婷，封衛(wèi)毅

710061西安，西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部(禚映辰、張李婷、封衛(wèi)毅); 255000山東 淄博,淄博市中心醫(yī)院 疼痛科(張培國)

乳腺癌是全世界婦女目前面臨的最為常見的癌癥。世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，2018年全球約63萬人死于乳腺癌，新增病例209萬[1]。盡管在診斷和治療水平方面取得了很大的進(jìn)步，但乳腺癌仍然是女性癌癥死亡的主要原因，約占女性癌癥死亡的25%[1]。因此，尋找乳腺癌預(yù)后判斷的潛在指標(biāo)和藥物靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

越來越多的研究表明，腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展與免疫相關(guān)分子密切相關(guān)[2]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族[nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)-like receptors,NLRs]是一類存在于胞質(zhì)中的模式識(shí)別受體，可分為5個(gè)亞家族：NLRA、NLRB、NLRC、NLRP和NLRX[3]。NLRs家族成員參與免疫和炎癥相關(guān)的程序識(shí)別，在調(diào)節(jié)病原體感染以及細(xì)胞損傷引起的炎癥反應(yīng)方面起著重要作用[3]。其中NLRC家族共有五個(gè)成員，即NLRC1、NLRC2、NLRC3、NLRC4和NLRC5。研究表明，NLRCs大多為固有免疫細(xì)胞炎癥信號(hào)通路的調(diào)節(jié)劑[4]，但目前對(duì)于NLRCs在乳腺癌預(yù)后中的價(jià)值仍知之甚少。因此，本研究將利用學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)可的生物信息數(shù)據(jù)平臺(tái)，深入研究NLRCs與乳腺癌特別是浸潤性乳腺癌的關(guān)系，探討其在乳腺癌診斷和預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值，以期為進(jìn)一步研究乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供有價(jià)值的佐證。

1 資料與方法

1.1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)

Oncomine數(shù)據(jù)庫是一個(gè)在線癌基因芯片數(shù)據(jù)庫，包括715個(gè)數(shù)據(jù)集和86 733個(gè)樣本(www.oncomine.org)[5]。本研究中，設(shè)定的以下檢索條件：1)“gene：NLRC1”；2)“cancer type：breast cancer”；3)“data type：all”；4)“analysis type：cancervsnormal analysis”；5)“threshold by：P<0.05，fold change>2，gene rank=top 10%”。NLRC2、NLRC3、NLRC4和NLRC5基因依次按上述方法檢索。

1.2 TIMER數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生存分析

TIMER數(shù)據(jù)庫是系統(tǒng)性分析不同癌癥類型免疫細(xì)胞浸潤的在線數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)。本研究中，應(yīng)用Survival模塊探究基因表達(dá)和臨床結(jié)局之間的關(guān)系。

1.3 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)

從UCSC-Xenc下載TCGA-BRCA數(shù)據(jù)集，篩選浸潤性乳腺癌NLRC3基因表達(dá)譜及患者的臨床信息數(shù)據(jù)(https://xenabrowser.net/)。以NLRCsmRNA表達(dá)水平中位數(shù)為界，將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，結(jié)合患者臨床病理參數(shù)，如性別、年齡、TNM分期和腫瘤分級(jí)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生存分析

使用Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫的3 951個(gè)breast cancer數(shù)據(jù)集(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service)，分析5個(gè)NLRCs基因表達(dá)數(shù)據(jù)與患者生存時(shí)間的關(guān)系。本研究中，設(shè)定的以下檢索條件：1)“cancer：breast cancer”；2)“gene symbol：NLRC1”；3)“split patients by：median”；4)“survival： RFS ”或“OS”；由“follow up threshold：180 months”。NLRC2、NLRC3、NLRC4和NLRC5基因依次按上述方法檢索。無復(fù)發(fā)生存期(recurrence-free survival，RFS)、總生存期(overall survival，OS)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較乳腺癌組織與正常乳腺組織中NLRCsmRNA的表達(dá)量的差異；采用 Kaplan-Meier Plotter方法和Log-rank檢驗(yàn)分析NLRCs表達(dá)與浸潤性乳腺癌預(yù)后的關(guān)系；采用GraphPad Prism 8軟件和χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析NLRC3表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床常見腫瘤中NLRCs 的轉(zhuǎn)錄水平

Oncomine數(shù)據(jù)庫中共收集了1 514項(xiàng)關(guān)于NLRCs基因在不同類型癌組織和正常組織樣本中差異表達(dá)的研究數(shù)據(jù)(圖1)，表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的研究結(jié)果有91項(xiàng)，其中表達(dá)升高47項(xiàng)，表達(dá)降低44項(xiàng)。在乳腺癌中表達(dá)升高13項(xiàng)，表達(dá)降低2項(xiàng)。

圖1 NLRCs在不同腫瘤組織中mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

2.2 NLRCs基因在乳腺癌和正常組織中的表達(dá)差異

對(duì)15項(xiàng)關(guān)于乳腺癌組織和乳腺正常組織NLRCs基因有差異表達(dá)的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(表1)，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的NLRC2mRNA表達(dá)水平在5項(xiàng)研究數(shù)據(jù)集中顯著上調(diào)(P<0.05)。在TCGA數(shù)據(jù)集中，浸潤性乳腺癌NLRC2mRNA的轉(zhuǎn)錄水平為正常組織的3.053倍，浸潤性小葉癌為2.165倍，浸潤性導(dǎo)管癌為2.655倍。在Curtis等[6]和Finak等[7]數(shù)據(jù)集中，乳腺髓樣癌和浸潤性乳腺癌NLRC2mRNA的轉(zhuǎn)錄水平分別為正常組織的2.192和3.692倍。

表1 NLRCs基因在乳腺癌組織和正常組織中的表達(dá)差異

乳腺癌患者的NLRC3mRNA表達(dá)水平在4項(xiàng)研究數(shù)據(jù)集中顯著上調(diào)(P<0.05)。在Gluck等[8]數(shù)據(jù)集中，浸潤性乳腺癌NLRC3mRNA的轉(zhuǎn)錄水平為正常組織的2.750倍；在Turashvili等[9]數(shù)據(jù)集中，浸潤性小葉癌和浸潤性導(dǎo)管癌NLRC3mRNA的轉(zhuǎn)錄水平分別為正常組織的2.110和4.351倍；在Radvanyi等[10]數(shù)據(jù)集中，浸潤性導(dǎo)管癌NLRC3mRNA的轉(zhuǎn)錄分別為正常組織的2.193倍。

NLRC4mRNA表達(dá)在1項(xiàng)數(shù)據(jù)集中明顯地上調(diào)，而在2項(xiàng)數(shù)據(jù)集中顯著下調(diào)(P<0.05)。在Radvanyi等[10]數(shù)據(jù)集中，浸潤性導(dǎo)管癌NLRC4mRNA的表達(dá)既表現(xiàn)為上調(diào)又表現(xiàn)為下調(diào)，而正常組織中NLRC4mRNA的表達(dá)是浸潤性小葉癌的5.390倍。

NLRC5mRNA表達(dá)水平在3項(xiàng)研究數(shù)據(jù)集中顯著上調(diào)(P<0.05)。在Ma等[11]數(shù)據(jù)集中，乳腺導(dǎo)管原位癌和浸潤性導(dǎo)管癌NLRC5mRNA的轉(zhuǎn)錄水平分別為正常組織的3.130和2.231倍；在Karnoub[12]數(shù)據(jù)集中，浸潤性導(dǎo)管癌NLRC5mRNA的轉(zhuǎn)錄水平為正常組織的2.504倍。

2.3 NLRCs在浸潤性乳腺癌(非特殊型)中的表達(dá)

乳腺癌病理分型眾多，NLRCs基因?qū)Σ煌中腿橄侔┑挠绊懘嬗胁町?。為了使研究更加具有針?duì)性，我們將以浸潤性乳腺癌(非特殊型，約占整個(gè)乳腺癌的80%～90%)為研究對(duì)象，進(jìn)一步細(xì)化研究。通過對(duì)Oncomine數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)共有15項(xiàng)關(guān)于NLRCs在浸潤性乳腺癌與正常組織中的表達(dá)差異分析的研究，整合這15項(xiàng)的研究結(jié)果顯示(圖2)，NLRC2/3/4/5在浸潤性乳腺癌中表達(dá)量顯著高于正常組織(P<0.05)；NLRC1在浸潤性乳腺癌中的表達(dá)與正常組織差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 NLRCs在浸潤性乳腺癌中mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

2.4 NLRCs基因表達(dá)與浸潤性乳腺癌患者生存預(yù)后的關(guān)系

對(duì)1 099例TCGA數(shù)據(jù)集中浸潤性乳腺癌RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如圖3所示,高NLRC3表達(dá)與浸潤性乳腺癌較好的預(yù)后相關(guān)(Log-rankP=0.028)，即NLRC3高表達(dá)延長浸潤性乳腺癌患者的OS，而乳腺癌組織NLRC1/2/4/5的表達(dá)與患者預(yù)后無關(guān)(Log-rankP>0.05)。提示NLRC3的表達(dá)與浸潤性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

圖3 NLRCs表達(dá)水平與浸潤性乳腺癌患者OS的關(guān)系

2.5 NLRC3 mRNA水平與浸潤性乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

對(duì)1 143例TCGA數(shù)據(jù)集中浸潤性乳腺癌RNA-seq數(shù)據(jù)并結(jié)合臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析，如表2所示，浸潤性乳腺癌組織中NLRC3表達(dá)與T分期(P=0.011)和腫瘤分級(jí)(P=0.040)顯著性相關(guān)，與性別(P=0.081)、年齡(P=0.443)、淋巴結(jié)受累程度和范圍(P=0.393)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.052)無關(guān)。同時(shí)我們還觀察到，NLRC3高表達(dá)組浸潤性乳腺癌患者的臨床病理特征明顯優(yōu)于低表達(dá)組的患者，因此NLRC3與浸潤性乳腺癌的惡性程度密切相關(guān)。

表2 NLRC3與浸潤性乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.6 不同分子亞型中乳腺癌NLRC3 mRNA表達(dá)的預(yù)后價(jià)值

基因組分析可將乳腺癌分為4個(gè)分子亞型，luminal A型、luminal B型、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)過表達(dá)型和基底細(xì)胞樣(basal-like)型。通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫獲取了3 951例乳腺癌患者的生存數(shù)據(jù)，分析NLRC3基因在乳腺癌不同分子亞型中的表達(dá)對(duì)患者RFS和OS的影響(圖4)，分析發(fā)現(xiàn)NLRC3高轉(zhuǎn)錄組與低轉(zhuǎn)錄組相比，4種分子亞型患者RFS和basal-like型患者OS均顯著延長(P<0.05)。

圖4 NLRC3基因表達(dá)與不同分子亞型乳腺癌患者RFS或OS的關(guān)系

3 討 論

NLRCs是一類感應(yīng)病毒入侵和機(jī)體自身細(xì)胞損傷(或應(yīng)激)的先天免疫“傳感器”[13]。 近年來，NLRCs在影響癌癥生物學(xué)過程中的作用正受到關(guān)注。例如，NLRC1和NLRC2可直接調(diào)節(jié)NF-κB和MAPK促炎途徑，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和血管生成[14]；NLRC3通過抑制PI3K-mTOR信號(hào)通路的激活阻斷結(jié)腸腫瘤的生成[15]；NLRC4對(duì)癌癥的進(jìn)展具有雙重調(diào)控作用[16]；NLRC5與直腸癌、宮頸癌、膀胱癌、黑色素瘤和頭頸癌的患者生存預(yù)后高度相關(guān)[17]。然而，NLRCs對(duì)乳腺癌的進(jìn)一步生物信息學(xué)分析尚未完成。

鑒于此，本研究分析已收錄在Oncomine中人乳腺癌組織NLRCs基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中有13項(xiàng)研究數(shù)據(jù)顯示NLRCs基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，2項(xiàng)顯著下調(diào)，提示NLRCs的表達(dá)可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。然而，乳腺癌的組織學(xué)分型很多，不同分型存在病理特征上的差異，為此本研究主要探討5個(gè)NLRC分子在最常見的乳腺癌類型—非特殊型浸潤性乳腺癌中mRNA表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值。研究結(jié)果顯示NLRC1在浸潤性乳腺癌中的表達(dá)與正常組織差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NLRC2/3/4/5在浸潤性乳腺癌中表達(dá)量顯著高于正常組織。然而，浸潤性乳腺癌患者預(yù)后僅與NLRC3的表達(dá)呈正相關(guān)，與NLRC1/2/4/5的表達(dá)無關(guān)，這表明NLRC3可能在浸潤性乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用。進(jìn)一步亞組分析顯示NLRC3高表達(dá)組浸潤性乳腺癌患者的臨床病理特征明顯優(yōu)于低表達(dá)組的患者。因此，NLRC3有望成為浸潤性乳腺癌潛在的診斷和預(yù)測(cè)癌癥患者生存預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。今后擬開展實(shí)驗(yàn)性研究，為NLRC3成為浸潤性乳腺癌治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

浸潤性乳腺癌是一類異質(zhì)性極強(qiáng)的腫瘤，通常情況下，相同組織學(xué)分型的乳腺癌可能表現(xiàn)為不同的分子病理特征。如果只參照癌癥的組織學(xué)分型和臨床病理參數(shù)則不足以預(yù)測(cè)乳腺癌病理生理學(xué)的真實(shí)行為，多數(shù)研究更側(cè)重于分析乳腺癌的分子模式[18]?；诨虮磉_(dá)譜，Perou，Sorlie等將乳腺癌分為4種臨床相關(guān)分子亞型：luminal A型、luminal B型、HER2過表達(dá)型和basal-like型[19]。

由于大約80%的乳腺癌在組織學(xué)上被歸類為浸潤性導(dǎo)管癌，其次是浸潤性小葉癌(約占病例的10%～15%)，因此NLRC3對(duì)不同分子亞型乳腺癌的預(yù)后價(jià)值，基本可以認(rèn)為是NLRC3對(duì)不同分子亞型浸潤性乳腺癌的預(yù)后價(jià)值。分析結(jié)果顯示NLRC3對(duì)4種亞型乳腺癌患者的預(yù)后均起積極作用，其中分子型為basal-like型的NLRC3高表達(dá)組患者RFS和OS均顯著延長。因此，高NLRC3表達(dá)似乎極大改善了basal-like表型乳腺癌患者的預(yù)后。

綜上所述，本研究采用國際廣泛認(rèn)可的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)性地分析了NLRC家族成員在乳腺癌中的表達(dá)和預(yù)后價(jià)值，并對(duì)不同亞型乳腺癌進(jìn)行深入分析，結(jié)合本研究可以推測(cè)，NLRC3可能是浸潤性乳腺癌的抑癌基因(特別是basal-like分型)，有望成為有價(jià)值的患者預(yù)后評(píng)估新型生物標(biāo)志物，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。

作者聲明：本文全部作者對(duì)于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存，可接受核查。

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