出芽短梗霉菌PA-2脂肽類物質(zhì)抑菌活性及其發(fā)酵條件優(yōu)化

岳登高，程 亮，郭青云

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀測實驗站，青海 西寧 810016)

近年來由于抗生素的大量使用，使病原菌耐藥性問題變得日趨嚴(yán)峻[1]。對革蘭氏陽性菌具有顯著抗性的脂肽類物質(zhì)便成為眾多學(xué)者研究的熱點之一。脂肽(lipopeptide)又名脂酰肽(acylpep-tide)，是一類由脂肪鏈和肽鏈組成的具有兩親結(jié)構(gòu)的微生物次級代謝產(chǎn)物[2]。脂肽類抗菌物質(zhì)包括表面活性素(surfcatin)、伊枯草菌素(iturin)和芬薺素(fengycin)三大類[3]，其具有抗細(xì)菌[4]、真菌[5]、病毒和支原體的功能[6]，在農(nóng)業(yè)[7]、工業(yè)[8]和生物醫(yī)藥[9]等方面有著很高的利用價值。然而高成本低產(chǎn)量限制了抗菌脂肽的工業(yè)化生產(chǎn)，因此急需對產(chǎn)肽菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，從而降低發(fā)酵成本，提高脂肽產(chǎn)量。目前關(guān)于產(chǎn)抗菌脂肽的菌株研究主要集中于芽孢桿菌屬。高兆建等[10]從凝結(jié)芽孢桿菌XZQ-16發(fā)酵液中分離得到抗菌脂肽化合物。吳艷清等[11]通過對枯草芽孢桿菌WL2的次生代謝產(chǎn)物研究發(fā)現(xiàn)，它可產(chǎn)生對致病疫霉有抑制作用的脂肽類物質(zhì)。關(guān)于出芽短梗霉菌的次生代謝產(chǎn)物有胞外多聚糖、胞外酶、黑色素、嗜鐵素和短梗霉素A，其中短梗霉素A是從出芽短梗霉菌NR106的液體培養(yǎng)基中分離得到的一種環(huán)狀脂肽類抗生素[12-13]，這為本文出芽短梗霉菌PA-2的產(chǎn)肽研究提供了依據(jù)。當(dāng)前關(guān)于出芽短梗霉菌PA-2產(chǎn)生抗菌脂肽類物質(zhì)并以脂肽產(chǎn)量為響應(yīng)值進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化的研究還未曾報道?；诖?，本研究通過分析出芽短梗霉菌PA-2脂肽類物質(zhì)對致病菌的抑菌活性及發(fā)酵條件優(yōu)化，為該菌株及其脂肽類物質(zhì)的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)PA-2菌株由青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室分離和保存。

供試靶標(biāo)菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538、釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)ATCC9098、大腸埃希菌(Escherichiacoli)ATCC8739、白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC10231均來自山東魯微科技有限公司。櫻桃球腔菌(Mycosphaerellacerasella)LD-2、大麥網(wǎng)斑病(Pyrenophorateres)HZ-2保存于青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基

出芽短梗霉菌PA-2的平板培養(yǎng)和斜面保存采用PDA培養(yǎng)基，出芽短梗霉菌PA-2的種子液制備采用PDB液體培養(yǎng)液。出芽短梗霉菌PA-2的發(fā)酵培養(yǎng)采用培養(yǎng)基(葡萄糖 20 g·L-1，(NH4)2SO45 g·L-1，K2HPO41.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，CaCl20.1 g·L-1，NaCl 0.1 g·L-1，F(xiàn)eCl30.5 mg·L-1，ZnSO40.5 mg·L-1)； 靶標(biāo)菌(細(xì)菌和酵母菌)的培養(yǎng)和抑菌活性檢測采用LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g·L-1，肉提取物3 g·L-1，乳糖5 g·L-1，溴麝香草酚蘭0.024 g·L-1，瓊脂粉16 g·L-1)；靶標(biāo)菌(真菌)的培養(yǎng)和抑菌活性檢測采用PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器

SQ 510C型立式蒸汽滅菌鍋，重慶雅瑪拓科技有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺，萊特科學(xué)儀器有限公司；ZWY-1102型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；TGL-50型臺式離心機(jī)，常州金壇良友儀器有限公司；D-6000-VN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，河北中碩儀器科技有限公司；SHB-3型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HX-1050型恒溫循環(huán)器，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；KQ-250E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PA-2脂肽粗提物的制備

將活化的PA-2菌株接種于裝液量為150 mL的液體培養(yǎng)基中，接種量為每50 mL接種1個菌餅(Ф=1.0 cm)，于25 ℃、180 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)5 d后，在4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min，收集上清液。用6 mol·L-1的HCl將上清液調(diào)pH至2.0，在4 ℃冰箱中靜置24 h。然后在4 ℃、10 000 r·min-1的條件下離心10 min，收集沉淀[14-15]。沉淀經(jīng)凍干處理后用適量甲醇反復(fù)抽提3次，合并抽提液，然后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干得到淡黃色晶體。并用適量甲醇溶解晶體，濃度為0.1 g·mL-1，經(jīng) 0.22 μm微孔濾膜過濾，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脂肽粗提物的定性檢測

通過原位酸水解-茚三酮顯色法[16]對脂肽粗提物進(jìn)行定性檢測。首先取a、b兩塊硅膠板分別在距離上下沿1.5 cm處用鉛筆劃線，然后用毛細(xì)管蘸取粗提物點樣于硅膠板下沿劃線處，待點樣位置完全干燥后將硅膠板置于展開劑為氯仿/甲醇/水體積比60∶30∶4的層析杠中進(jìn)行層析。當(dāng)展開劑上升至硅膠板上沿劃線處時取出硅膠板，待a板晾干后噴灑茚三酮顯色劑，最后置于65 ℃烘箱中約30 min。將取出的b板置于密閉容器(內(nèi)含小燒杯乘有的濃鹽酸)中，在110 ℃烘箱中進(jìn)行原位酸水解1 h，之后再噴灑茚三酮顯色劑，置于65 ℃烘箱中約30 min。

1.2.3 PA-2脂肽粗提物的抑菌活性測定

以金黃色葡萄球菌、釀酒酵母菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、櫻桃球腔菌和大麥網(wǎng)斑病為指示菌，通過瓊脂打孔擴(kuò)散的方法測定粗提物的抑菌活性[17-18]。首先制備靶標(biāo)菌的平板培養(yǎng)基，然后將靶標(biāo)菌活菌數(shù)調(diào)整到2.0×107CFU·mL-1，其次在平板上均勻的涂布200 μL，待平板晾干后，用打孔器(Ф=1.0 cm)在平板上打孔。最后將100 μL脂肽類提取物注入到不同靶標(biāo)菌對應(yīng)的孔中作為處理組，每個處理重復(fù)3次。以在平板孔中注入甲醇為陰性對照，注入已經(jīng)滅菌但未接種PA-2菌株的液體發(fā)酵液作為陽性對照。經(jīng)25 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d，觀察抑菌圈情況并測定抑菌圈直徑大小，用以表示抑菌活性高低。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化出芽短梗霉菌PA-2產(chǎn)抗菌脂肽的發(fā)酵條件

種子液的制備。從PDA斜面上挖取一塊菌塊接種于PDA平板中，活化培養(yǎng)7 d后，用打孔器(Ф=1.0 cm)打取菌餅1個，接種于盛有50 mL PDB培養(yǎng)液的三角瓶中(規(guī)格300 mL)，在25 ℃、180 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)48 h作為種子液。

脂肽含量測定。發(fā)酵液經(jīng)上述1.2.1節(jié)中脂肽粗提物的制備方法處理后得到固態(tài)粗提物，固態(tài)粗提物質(zhì)量為旋蒸瓶旋蒸甲醇抽提液前(m1)后(m2)質(zhì)量之差，最后用未發(fā)酵之前的培養(yǎng)液體積(V)求脂肽濃度，即ρ粗提=(m2-m1)·V-1。

單因素試驗設(shè)計。根據(jù)劉暢[19]對出芽短梗霉菌發(fā)酵條件優(yōu)化的研究從影響微生物生長的溫度、裝液量、接種量、培養(yǎng)基初始pH和轉(zhuǎn)速5個條件進(jìn)行單因素試驗。分別設(shè)定接種量為3.0%、5.0%、7.0%、9.0%、11.0%，轉(zhuǎn)速為100、130、160、190、220 r·min-1，溫度為21、23、25、27、29 ℃，裝液量為50、100、150、200、250 mL，初始pH為5、6、7、8、9，每個處理3次重復(fù)。從而確定單個因素的最佳發(fā)酵條件，為中心組合設(shè)計提供中心點。

響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件試驗設(shè)計。利用軟件Design-Expert 10.0.3，以上述單因素試驗確定的最佳條件為中心點，以脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，接種量(A)、轉(zhuǎn)速(B)、溫度(C)、裝液量(D)、培養(yǎng)基初始pH(E)為自變量進(jìn)行通用旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計，試驗因素水平設(shè)計如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肽粗提物的定性檢測

按照1.2.2節(jié)中的方法對PA-2粗提物進(jìn)行定性檢測，結(jié)果如圖1所示。a板層析結(jié)束后直接噴灑茚三酮其結(jié)果不顯色。b板經(jīng)酸水解后噴灑茚三酮，發(fā)現(xiàn)硅膠板上出現(xiàn)明顯條帶。

由于茚三酮能與所有氨基酸及具有游離氨基的脂肽發(fā)生顏色反應(yīng)，因此，a板未顯色說明粗提物中不含氨基酸及具有游離氨基的脂肽，b板經(jīng)酸水解后噴灑茚三酮出現(xiàn)明顯條帶說明粗提物中環(huán)狀脂肽經(jīng)酸水解后產(chǎn)生游離氨基酸，所以初步判定粗提物為環(huán)狀脂肽類物質(zhì)。

表1 響應(yīng)面法-通用旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計因素及水平

圖1 PA-2粗提物顯色結(jié)果Fig.1 Color development results of PA-2 crude extract

2.2 PA-2脂肽類物質(zhì)抑菌活性測定

金黃色葡萄球菌、釀酒酵母菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、櫻桃球腔菌和大麥網(wǎng)斑病脂肽粗提物的抑菌活性測定結(jié)果如圖2所示，脂肽粗提物對金黃色葡萄球菌、釀酒酵母菌、大腸埃希菌、櫻桃球腔菌和大麥網(wǎng)斑病都有抑制效果，抑菌圈直徑分別為3.65、1.95、2.15、1.35、2.18 cm(表2)。而白色念珠菌培養(yǎng)皿中沒有抑菌圈的出現(xiàn)，這說明脂肽粗提物對這種細(xì)菌無抑制效果。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 接種量對脂肽產(chǎn)量的影響

按照接種量分別為3%、5%、7%、9%、11%，其他條件均保持不變，對發(fā)酵液進(jìn)行接種，脂肽產(chǎn)量結(jié)果如圖3-A所示。單因素方差分析結(jié)果表明，接種量為7%、9%、11%時的脂肽產(chǎn)量顯著高于接種量為3%、5%時的脂肽產(chǎn)量(P<0.05)。

A，金黃色葡萄球菌；B，釀酒酵母；C，大腸埃希菌；D，白色念珠菌；E，櫻桃球腔菌；F，大麥網(wǎng)斑??；CK-，陰性對照；CK+，陽性對照。A， Staphylococcus aureus; B， Saccharomyces cerevisiae; C， Escherichia coli; D， Candida albicans; E， Mycosphaerella cerasella; F， Pyrenophora teres; CK-， Negative control; CK+， Control.圖2 脂肽類物質(zhì)對不同菌株的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of crude lipopeptide on different strains

表2 脂肽粗提物對不同細(xì)菌的抑菌直徑

且接種量為7%時脂肽產(chǎn)量最大。7%、9%、11%的接種量下脂肽產(chǎn)量兩兩之間差異不顯著，并且3%的接種量和5%的接種量下的脂肽產(chǎn)量差異不顯著。

2.3.2 轉(zhuǎn)速對脂肽產(chǎn)量的影響

按照轉(zhuǎn)速為100、130、160、190、220 r·min-1，其他條件均保持不變的條件下對液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，脂肽產(chǎn)量結(jié)果如圖3-B所示。單因素方差分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速為190、220 r·min-1時脂肽產(chǎn)量顯著高于轉(zhuǎn)速為100、130、160 r·min-1時的脂肽產(chǎn)量(P<0.05)，且當(dāng)轉(zhuǎn)速為190 r·min-1時脂肽產(chǎn)量最大。轉(zhuǎn)速在100、130、160、190 r·min-1的條件下脂肽產(chǎn)量兩兩之間差異顯著，轉(zhuǎn)速為190、220 r·min-1時的脂肽產(chǎn)量之間無顯著差異。

2.3.3 溫度對脂肽產(chǎn)量的影響

按照溫度為21、23、25、27、29 ℃，其他條件均保持不變的條件下對液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，脂肽產(chǎn)量結(jié)果如圖3-C所示。在溫度為23、25、27 ℃條件下的脂肽產(chǎn)量顯著高于21和29 ℃條件下的脂肽產(chǎn)量(P<0.05)，且25 ℃時脂肽產(chǎn)量最大。溫度為21、23、25、27 ℃條件下脂肽產(chǎn)量兩兩之間差異顯著。溫度為21 ℃下的脂肽產(chǎn)量與溫度為29 ℃下的脂肽產(chǎn)量無顯著差異。這說明菌株的產(chǎn)肽量在21～27 ℃這個范圍內(nèi)對溫度變化非常敏感，但低于21 ℃或高于29 ℃時菌株的產(chǎn)肽量會驟減，且會對溫度變得不敏感。

2.3.4 裝液量對脂肽產(chǎn)量的影響

按照裝液量為50、100、150、200、250 mL，其他條件均保持不變的條件下對液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，脂肽產(chǎn)量結(jié)果如圖3-D所示。當(dāng)裝液量為50、100、150 mL時脂肽產(chǎn)量兩兩之間差異顯著，150 mL時脂肽產(chǎn)量最大。當(dāng)裝液量為150、200 mL時脂肽產(chǎn)量無顯著差異，當(dāng)裝液量為150、250 mL時脂肽產(chǎn)量間有顯著差異。這表明最適裝液量范圍為150～200 mL。

2.3.5 發(fā)酵液初始pH對脂肽產(chǎn)量的影響

按照初始pH為5、6、7、8、9，其他條件均保持不變的條件下，對液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，脂肽產(chǎn)量結(jié)果如圖3-E所示。當(dāng)pH為5、6、7時脂肽產(chǎn)量兩兩間有顯著差異，且當(dāng)pH為7時脂肽產(chǎn)量最大。當(dāng)pH為6、8時脂肽產(chǎn)量間無顯著差異，pH為5、9時脂肽產(chǎn)量間亦無顯著差異。說明酸性環(huán)境和堿性環(huán)境均不利于菌株產(chǎn)生脂肽類化合物。

綜合以上單因素試驗結(jié)果最終確定以接種量7%，轉(zhuǎn)速190 r·min-1，溫度25 ℃，裝液量150 mL，初始pH 7為中心點進(jìn)行中心組合實驗設(shè)計。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果與分析

2.4.1 回歸方程的建立與合理性分析

基于以上單因素實驗的研究結(jié)果和中心組合設(shè)計(CCD)采樣原理，以接種量(A)7%，轉(zhuǎn)速(B)190 r·min-1，溫度(C)25 ℃，裝液量(D)150 mL，初始pH(E)7為中心點進(jìn)行5因素5水平的中心組合試驗。中心組合設(shè)計及實驗結(jié)果見表3。

利用Design-Expert 10.0.3軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項回歸方程：Y=0.8624+0.0057A+0.1082B+0.0257C-0.0254D+0.0095E-0.0019AB-0.0281AC-0.0075AD-0.0106AE+0.0225BC-0.0244BD-0.0088BE-0.0781CD-0.0038CE+0.0019DE-0.0756A2-0.0517B2-0.0729C2-0.0985D2-0.0959E2(編碼制)。根據(jù)回歸方程方差分析表4進(jìn)行分析。其中，F(xiàn)值可用來檢驗各變量對響應(yīng)值影響的顯著性高低，F(xiàn)值越大，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。當(dāng)模型的顯著性檢驗概率P<0.05時，認(rèn)為該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。從表4中可以看出，各實驗因素對脂肽化合物產(chǎn)量影響大小順序為：轉(zhuǎn)速(B)>溫度(C)>裝液量(D)>pH(E)>接種量(A)，其中轉(zhuǎn)速(B)、溫度(C)、裝液量(D)對脂肽濃度影響極顯著。在交互項中AC、BC、BD、CD對脂肽濃度影響極顯著。模型的決定系數(shù)R2為0.984 0，說明模型具有較高顯著性，同時調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2(Adj)=0.973 0，能夠解釋實驗97.30%的響應(yīng)值變異，且與預(yù)測相關(guān)系數(shù)R2(Pred)=0.952 4也接近，說明此實驗?zāi)Ｐ团c真實數(shù)據(jù)擬合程度良好，具有實踐指導(dǎo)意義，因此可以用該模型分析和預(yù)測脂肽化合物產(chǎn)量的最優(yōu)發(fā)酵條件。

圖3 不同因素對出芽短梗霉菌PA-2脂肽粗提物產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different factors on the yield of crude extract of Aureobasidium pullulans PA-2 lipopeptide

2.4.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

基于表4方差分析，得出各因素顯著交互作用對脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量影響的三維響應(yīng)曲面圖如圖4所示。由圖4-A可知，接種量-溫度交互作用曲面具有良好的對稱性，表明二者在交互作用中的貢獻(xiàn)相當(dāng)，對脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量的影響相當(dāng)，表現(xiàn)為：脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量隨接種量和溫度的增加先增加后減小，且變化較為平緩。僅考慮二者影響下的發(fā)酵條件為：接種量7%、溫度25.5℃水平附近值的組合最為合適。

由圖4-B可知，轉(zhuǎn)速-溫度交互作用對脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量的影響呈傾斜拱形曲面分布，且轉(zhuǎn)速方向縱向跨度較大，為影響脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量的敏感因素。實際發(fā)酵條件中應(yīng)優(yōu)先滿足轉(zhuǎn)速處于205～220 r·min-1此時對促進(jìn)脂肽類物質(zhì)生成最為有利。

由圖4-C可知，轉(zhuǎn)速-裝液量在交互作用中脂肽濃度與轉(zhuǎn)速呈正相關(guān)關(guān)系，而與裝液量則呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢，且轉(zhuǎn)速對目標(biāo)產(chǎn)物影響大于裝液量的影響。所以轉(zhuǎn)速205～220 r·min-1、裝液量120～160 mL時，有利于獲得更高的脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量。

由圖4-D可知，在裝液量-溫度交互曲面中，曲面隨溫度變化波動幅度更大，表明溫度較裝液量影響顯著。當(dāng)裝液量小于140 mL時，脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量與裝液量呈正相關(guān)關(guān)系，而當(dāng)裝液量大于140 mL時，其相關(guān)關(guān)系發(fā)生轉(zhuǎn)折，裝液量在140 mL附近取值時為脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量的最高點，溫度的臨界最佳參數(shù)為26 ℃左右。

為協(xié)同考慮各因素之間的交互作用對脂肽化合物產(chǎn)量的影響，進(jìn)一步確定全局最優(yōu)發(fā)酵條件，以最大脂肽化合物產(chǎn)量為優(yōu)化目標(biāo)，根據(jù)Design-Expert 10.0.3 軟件運行結(jié)果，脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量在多因素共同影響下的最優(yōu)發(fā)酵條件為：接種量6.85%、轉(zhuǎn)速216.24 r·min-1、溫度25.80 ℃、裝液量124.87 mL、pH 7.17，在此條件下模型預(yù)測的脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量為0.94 g·L-1。

表3 中心組合試驗結(jié)果及預(yù)測

表4 擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

根據(jù)軟件預(yù)測結(jié)果，結(jié)合實際發(fā)酵條件的可行性，取接種量6.8%、轉(zhuǎn)速216 r·min-1、溫度26 ℃、裝液量125 mL、pH 7進(jìn)行發(fā)酵。實驗重復(fù)3次，最后平均脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量為0.92 g·L-1，與模型預(yù)測結(jié)果接近，且比原來的0.61 g·L-1提高了近51%，說明基于該響應(yīng)面模型分析優(yōu)化脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量的發(fā)酵方法有一定的可行性。

3 結(jié)論與討論

脂肽類物質(zhì)是一類重要的抗生素，其抑菌種類與抑菌活性強(qiáng)弱直接決定其應(yīng)用范圍。本文中所提取的脂肽類化合物主要對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌這2種細(xì)菌和釀酒酵母菌有明顯的抑制效果，對絲狀真菌櫻桃球腔菌和大麥網(wǎng)斑病在試驗第3天會出現(xiàn)明顯抑菌圈，但之后抑菌圈會逐漸變小直至消失，這說明脂肽粗提物對這2種絲狀真菌的抑制作用有限。脂肽類物質(zhì)按結(jié)構(gòu)主要分為伊枯草菌素、表面活性素和豐原素。伊枯草菌素具有很強(qiáng)的溶血性及抑制真菌活性，只有一定抑制細(xì)菌和病毒的能力[20-21]，伊枯草菌素的抑菌譜與本實驗中脂肽粗提物的抑菌譜不同，故本實驗中脂肽粗提物不可能是伊枯草菌素。表面活性素是目前認(rèn)為較好的生物表面活性劑，具有很強(qiáng)的乳化和發(fā)泡作用，可以破壞細(xì)胞膜，猜測是其三維結(jié)構(gòu)在起作用，具有很好的抗病毒、溶血、抗支原體和抗細(xì)菌的作用，對真菌沒有太大的抑制作用[22-23]。這一結(jié)論與本實驗中脂肽粗提物的抑菌測定結(jié)果基本相同，故脂肽粗提物的結(jié)構(gòu)很可能與表面活性素結(jié)構(gòu)相似。豐原素只對絲狀真菌具有抑菌活性且有一定的溶血性[24]，這一說法與本實驗結(jié)論也不相符，說明本文中的脂肽粗提物也不可能是豐原素。

圖4 各交互作用顯著因素對脂肽濃度影響的三維響應(yīng)曲面Fig.4 Three-dimensional response surface of the effect of various interaction factors on lipopeptide yield

目前有關(guān)出芽短梗霉菌的發(fā)酵條件優(yōu)化都是以產(chǎn)糖量、產(chǎn)酸量或產(chǎn)孢量為響應(yīng)值，本文以脂肽產(chǎn)量為響應(yīng)值，接種量、轉(zhuǎn)速、溫度、裝液量、培養(yǎng)基初始pH為自變量進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，得到最適發(fā)酵條件為：接種量6.8%、轉(zhuǎn)速216 r·min-1、溫度26 ℃、裝液量125 mL、pH 7.17，這一結(jié)果與楊瑩等[25]以產(chǎn)孢量為響應(yīng)值對出芽短梗霉菌發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果相比除pH條件相近外其它條件均有所不同。李睿穎等[26]，何太波等[27]以產(chǎn)酸量為響應(yīng)值對出芽短梗霉菌發(fā)酵條件的研究結(jié)果基本與本文研究結(jié)果相一致。沈琦等[28]以產(chǎn)糖量為響應(yīng)值對出芽短梗霉菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化的研究結(jié)果除pH與本文結(jié)論相近外其他條件也均有較大差異。綜上所述，無論是以產(chǎn)糖量、產(chǎn)酸量或產(chǎn)孢量哪一種物質(zhì)為響應(yīng)值，出芽短梗霉菌發(fā)酵條件的pH都是中性環(huán)境，而其他條件會因目標(biāo)產(chǎn)物的不同而有所差異。在本實驗中轉(zhuǎn)速、溫度、裝液量對脂肽濃度影響極顯著，pH與接種量對脂肽濃度影響不顯著，這一結(jié)論與楊潔[29]報道的關(guān)于枯草芽孢桿菌E1R-j產(chǎn)抗菌脂肽的發(fā)酵條件結(jié)果相吻合。

綜上所述，出芽短梗霉菌PA-2的脂肽類物質(zhì)對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、櫻桃球腔菌(Mycosphaerellacerasella)和大麥網(wǎng)斑病(Pyrenophorateres)的生長均有抑制作用，抑菌圈分別為3.65、1.95、2.15、1.35、2.18 cm；該類物質(zhì)在接種量6.8%、轉(zhuǎn)速216 r·min-1、溫度26 ℃、裝液量125 mL、pH 7條件下發(fā)酵，產(chǎn)量達(dá)到0.92 g·L-1，比優(yōu)化前的產(chǎn)量(0.61 g·L-1)提高了51%，為后期的發(fā)酵放大實驗提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。