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    酵母雙雜交篩選與小麥黃花葉病毒P2互作的寄主因子

    2021-04-01 07:58:12韓曉蕾高仕祺姜鴻明李林志
    浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報 2021年3期

    韓曉蕾,高仕祺,張 帆,羊 健,劉 芃,姜鴻明,李林志,*

    (1.煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,山東 煙臺 265500; 2.煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺 265500; 3.寧波大學(xué)/農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點(diǎn)實驗室,浙江 寧波 315000)

    小麥黃花葉病是嚴(yán)重威脅我國小麥生產(chǎn)的主要土傳病害之一,主要是由小麥黃花葉病毒(wheat yellow mosaic virus,WYMV)引起,并以禾谷多粘菌(Ploymyxagraminis)為介體進(jìn)行傳播。根據(jù)調(diào)查,小麥黃花葉病在我國分布廣泛,已遍及長江流域各省份以及河南、陜西等省。據(jù)統(tǒng)計,該病害可導(dǎo)致小麥減產(chǎn)20%~30%,嚴(yán)重的時候達(dá)70%~80%,并呈逐年蔓延趨勢。1927年,首先在日本鑒定得到WYMV基因組序列。隨后,我國河南、江蘇、四川等地區(qū)的WYMV分離物基因組序列也被相繼報道[1]。WYMV病毒粒子呈彎曲線狀且基因組由兩條單鏈正義RNA組成[2]。RNA1包含了7 635個核苷酸,共編碼8個蛋白,分別命名為:P3、7K、CI(細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含體蛋白,cytoplasmic inclusion)、14K、VPg、NIa(細(xì)胞核內(nèi)含體蛋白a,nuclear inclusion a)、NIb(細(xì)胞核內(nèi)含體蛋白,nuclear inclusion b)和CP(外殼蛋白,coat protein)[3-5]。其中,P3可以通過+2移碼產(chǎn)生P3 N端部分蛋白P3N-PIPO(N-terminal portion of P3 protein)[6]。RNA2共編碼核苷酸3 651個,編碼約100 ku的多聚蛋白,被切割后生成兩個成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白P1蛋白與P2蛋白[7-9]。研究表明,WYMV中的7K和14K蛋白具有一個跨膜結(jié)構(gòu)域,推測與病毒復(fù)制、胞間運(yùn)動相關(guān)[10];HC-Pro為馬鈴薯Y病毒屬成員,研究發(fā)現(xiàn)與P1的蛋白結(jié)構(gòu)十分相像,可能與RNA沉默抑制的活性有關(guān)[11];VPg具備NLS(核定位信號,nuclear localization signal)和NES(核穿梭信號,nuclear export signal),推測VPg具有病毒長距離移動及復(fù)制功能[12]。

    病毒不但基因組簡單,被編碼的蛋白少。而且病毒的復(fù)制、病毒粒子組裝和侵染等都需要借助于寄主的代謝系統(tǒng)完成[13]。目前,篩選蛋白間互作的方法眾多,其中酵母雙雜交技術(shù)已被普遍應(yīng)用于各類生物的蛋白質(zhì)互作試驗中。因此,利用該技術(shù)篩選病毒蛋白的互作靶標(biāo)對研究病毒的致病機(jī)制至關(guān)重要[14-15]。Zhao等[16]以番茄花葉病毒(tomato mosaic tobamovirus,ToMV)運(yùn)動蛋白(movement protein,MP)為誘餌,利用酵母雙雜交技術(shù)篩選本氏煙cDNA文庫,分離得到寄主互作因子核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基(Rubisco small subunit,RbCS)。該基因沉默后,病毒在系統(tǒng)葉中的侵染受到限制,表明RbCS參與了病毒運(yùn)動過程。Kong等[17]利用酵母雙雜交系統(tǒng),以水稻條紋病毒(rice stripe virus,RSV)病害特異性蛋白(disease-specific protein,SP)為誘餌,篩選水稻cDNA文庫,得到一個放氧復(fù)合體蛋白(oxygen-evolving complex,OEC)。進(jìn)一步研究表明,SP通過改變OEC的亞細(xì)胞定位和葉綠體的結(jié)構(gòu)功能,從而增強(qiáng)了病毒癥狀的形成。前期報道表明,P2蛋白具有重排細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并形成聚集結(jié)構(gòu)的能力,同時能夠與P1、P3、Nia-Pro及VPg互作,并將其招募至聚集結(jié)構(gòu)中,與WYMV的復(fù)制密切相關(guān)[18]。目前,關(guān)于WYMV-P2在病毒與寄主分子相互作用中起到哪些具體功能和機(jī)制仍知之甚少。且對于WYMV編碼的蛋白與寄主因子互作機(jī)制研究相對較少。我們主要運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)篩選出與P2互作的候選寄主因子,為研究WYMV致病機(jī)理奠定理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    供試材料為小麥品種揚(yáng)麥158,cDNA保存于-80 ℃冰箱備用。大腸埃希菌(Escherichiacoli)感受態(tài)Mac1-T1 Competent Cell、DH5α農(nóng)桿菌感受態(tài)。DH10B、Y187購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 小麥cDNA構(gòu)建

    文庫是利用Clontech Mate&Plate TM Library Construction方法進(jìn)行構(gòu)建。并運(yùn)用Trizol方法[19],提取總的小麥RNA并融解在RNase-free H2O中,用超微量分光光度計儀器測量RNA的純度與濃度。分離純化后,根據(jù)Fast Track MAG mRNA Isolation Kit說明書中的方法獲得mRNA。然后,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。初級文庫的構(gòu)建是通過Clone-Miner方法進(jìn)行。把提取到的初級文庫質(zhì)粒稀釋成300 ng·μL-1后,在酵母載體pGADT7-DEST進(jìn)行LR重組反應(yīng)試驗,電轉(zhuǎn)化于DH10B感受態(tài)細(xì)胞后,成功獲得可以用于酵母雙雜交的小麥cDNA文庫。把提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)至Y187感受態(tài)細(xì)胞中,獲得小麥cDNA酵母文庫。用1.5 mL離心管分裝備用。

    1.2.2 文庫質(zhì)量的測定

    取10 μL酵母文庫大腸埃希菌甘油菌,利用無菌水以100倍比例稀釋,用104、106和108的菌液100 μL涂布在LB瓊脂平板上(Amp+),并計算菌落生成個數(shù)。根據(jù)公式計算文庫滴度:文庫滴度=平板的克隆數(shù)×稀釋的倍數(shù)×103/涂板體積。將cDNA文庫質(zhì)粒用大腸埃希菌感受態(tài)Mac1-T1中轉(zhuǎn)化后,取100 μL均勻涂布在LB瓊脂平板上(Amp+),從中隨機(jī)挑選單克隆,利用pGADT7通用載體引物對其進(jìn)行PCR檢測,檢測插入片段大小。利用公式:文庫重組率=(反應(yīng)個數(shù)/反應(yīng)總數(shù))×100%,計算重組率。

    1.2.3 Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備

    運(yùn)用Clontech Matchmaker TM Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual 說明書方法進(jìn)行。從-80 ℃冰凍保存的Y2HGold酵母細(xì)胞在YPDA瓊脂平板上進(jìn)行劃線,放置30 ℃培養(yǎng)箱3 d后,在YPDA瓊脂平板上挑取新鮮的單克隆菌落至3 mL的YPDA液體培養(yǎng)基中,于30℃搖床以250 r·min-1振蕩8~12 h。吸取5 μL至50 mLYPDA液體培養(yǎng)基中,30 ℃以250 r·min-1搖至D值為0.4~0.6;5 000 r·min-1離心收集菌體,用ddH2O洗滌酵母細(xì)胞后,以1.5 mL的1.1×TE/LiAc重懸菌液,最終形成酵母感受態(tài)并用于后續(xù)試驗。

    1.2.4 重組誘餌載體pGBKT7-P2的構(gòu)建

    以侵染小麥黃花葉病毒的小麥cDNA為擴(kuò)增模板擴(kuò)出目的片段;擴(kuò)增產(chǎn)物及pGBKT7-T載體用BamHⅠ和SmaⅠ在37 ℃條件下酶切4 h后,用T4連接酶4 ℃連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Mac1-T1大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞中。此后用pGBKT7通用引物對單克隆進(jìn)行檢測,并用含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基對陽性單克隆進(jìn)行擴(kuò)培,質(zhì)粒提取后送杭州有康生物公司進(jìn)行測序。將重組的質(zhì)粒pGBKT7-P2、空載體pGADT7,轉(zhuǎn)入到Y(jié)2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中,涂布在兩種營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上。倒置在30 ℃培養(yǎng)箱,孵育2~3 d后觀察菌落生長情況,并判斷誘餌質(zhì)粒pGBKT7-P2是否有自激活能力和毒性。

    1.2.5 小麥cDNA文庫篩選

    將15 μg的cDNA文庫質(zhì)粒和2 μg誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-P2共同轉(zhuǎn)至酵母感受態(tài)細(xì)胞中,均勻涂布在兩種篩選培養(yǎng)基SD(-Trp/-Leu)和SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)平板上,30 ℃孵育,篩選陽性克隆。提取生長正常的單克隆質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中,測序。測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對后,獲得候選靶標(biāo)的基因全長。將其中兩個基因Ta14-3-3與TaTIFY的開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)構(gòu)建至pGADT7中(引物見表1),獲得靶標(biāo)載體pGADT7-Ta14-3-3及pGADT7-TaTIFY。將靶標(biāo)載體分別與pGBKT7-P2共轉(zhuǎn)至酵母感受態(tài)細(xì)胞中,并在缺陷型培養(yǎng)基SD(-Leu/-Trp)和SD(-Leu/-Trp/-His/-Ade)中進(jìn)行培養(yǎng),驗證互作結(jié)果。

    表1 酵母重組質(zhì)粒構(gòu)建引物

    2 結(jié)果與分析

    2.1 小麥cDNA文庫的構(gòu)建及檢測

    小麥文庫構(gòu)建完成后,通過文庫滴度計算公式,得到小麥cDNA文庫滴度大于1.0×108CFU·mL-1,庫容量算得為3.2×107CFU,重組率大于96%。文庫質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化后,隨機(jī)挑選平板上生長狀態(tài)良好的47個單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖1顯示,插入片段大小范圍主要分布在300~1 000 bp,密集分布于700~800 bp,且沒有發(fā)現(xiàn)空載體。由此說明,本實驗構(gòu)建的cDNA文庫完整性及覆蓋度較好,達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)cDNA文庫的要求,可用于后續(xù)的試驗。

    2.2 誘餌載體的構(gòu)建

    用T4連接酶連接,成功獲得誘餌載體pGBKT7-P2。經(jīng)測序結(jié)果顯示,重組載體讀碼框正確,無移碼突變(圖2)。將載體pGBKT7-P2與pGADT7轉(zhuǎn)入酵母Y2HGold細(xì)胞感受態(tài)中,涂布在兩種篩選培養(yǎng)基SD(-Trp/-Leu)和 SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal)中,30 ℃培養(yǎng)2~3 d觀察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化菌落都能在篩選培養(yǎng)基SD(-Trp/-Leu)板上正常生長,且與對照相比,生長速度無明顯差別。但在SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal)上均不能生長(圖3)。確定誘餌質(zhì)粒對酵母菌株沒有自激活能力和毒性,可以用與下一步篩選試驗。

    2.3 篩選與WYMV-P2互作寄主因子

    將誘餌載體pGBKT7-P2與本實驗構(gòu)建的文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至酵母感受態(tài)中后,從SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)固體篩選培養(yǎng)基上篩選與WYMV-P2互作的候選蛋白。經(jīng)PCR檢測后,共得到52個陽性克隆。經(jīng)NCBI在線工具預(yù)測后,發(fā)現(xiàn)得到的陽性克隆包含了18個蛋白,其功能如表2所示。為了說明P2寄主靶標(biāo)的功能與植物抗逆性密切相關(guān)的候選靶標(biāo)蛋白進(jìn)行了序列分析。序列分析表明,TaTOM75全長為1 146 bp,共編碼氨基酸382個,有一個Major intrinsic protein(MIP)結(jié)構(gòu)域;TaRS31全長2 742 bp,編碼914個氨基酸,包含兩個RNA recognition motif(RRM)結(jié)構(gòu)域,分別位于第1到32位,及第55位到123位氨基酸;TaLIP為1 275 bp,編碼425個氨基酸,Pfam預(yù)測第95到312位為PAP fibrillin結(jié)構(gòu)域;Ta14-3-3的ORF長度為789 bp,其蛋白序列包含一個典型的14-3-3蛋白結(jié)構(gòu)域;TaTIFY-10A編碼全長序列為1 012 bp,其蛋白序列第86位到第119位氨基酸為TIFY家族結(jié)構(gòu)域,且在第152到177位是Divergent CCT基序(CCT2);TaUBPA2c為1 701 bp,編碼567個氨基酸,包含一個典型的RNA recognition motif(MMR)結(jié)構(gòu)域。TaBOI的ORF區(qū)為1 021 bp,編碼340個氨基酸。TaBAG6全長為2 775 bp,編碼925個氨基酸,這兩個蛋白均為E3泛素化相關(guān)蛋白。為了進(jìn)一步驗證酵母雙雜交的準(zhǔn)確性,我們隨機(jī)選擇了兩個蛋白TaTIFY與Ta14-3-3,并將其ORF區(qū)在小麥cDNA中克隆并構(gòu)建在pGADT7形成靶標(biāo)載體pGADT7-TaTIFY及pGADT7-Ta14-3-3。隨后分別將pGADT7-TaTIFY、pGADT7-Ta14-3-3與誘餌載體P2-pGBKT7共轉(zhuǎn)至酵母感受態(tài)中。

    M,DL8000 對照;1~47,重組子。M, DL8000 DNA marker; 1-47, Recombinants.圖1 四十七個單克隆的PCR檢測Fig.1 Picture of 47 clones

    M,DL8000;泳道1~2,NdeⅠ/PstⅠ雙酶切pGBKT7-P2;泳道3~4,NdeⅠ/PstⅠ雙酶切pGBKT7。M, DL8000; Lane 1-2, pGBKT7-P2 enzyme digestion by NdeⅠ/PstⅠ; Lane 3-4, pGBKT7 enzyme digestion by NdeⅠ/PstⅠ.圖2 酵母重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.2 Double digestion patterns of recombinant plasmid

    A,模式圖,pGADT7-RECT與pGBKT7-Lam互作為陰性對照,pGADT7-RECT與pGBKT7-53互作為陽性對照,pGBKT7-P2與pGBKT7互作為自激活驗證;B,SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基;C,SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal培養(yǎng)基。A, Mode pattern, pGADT7-RECT interact with pGBKT7-Lam served as negative control, pGADT7-RECT interact with pGBKT7-53 served as positive control, pGBKT7-P2 interact with pGBKT7 served as auto-activation tests; B, SD/-Trp/-Leu medium; C, SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal medium.圖3 pGBKT7-P2、pGBKT7載體自激活驗證及毒性驗證Fig.3 Autoactivation and toxicity testing of pGBKT7-P2 or pGBKT7

    將靶標(biāo)載體和誘餌載體共轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母感受態(tài)均能生長在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)上,并且在加了X-α-Gal的缺陷培養(yǎng)基培養(yǎng)時酵母菌落變藍(lán)明顯,由此說明,TaTIFY、Ta14-3-3與P2在酵母體內(nèi)存在互作關(guān)系(圖4)。為進(jìn)一步說明互作強(qiáng)弱,我們在培養(yǎng)基SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)挑選了單克隆,并用無菌水做了梯度稀釋。結(jié)果表明,含有TaTIFY與P2及Ta14-3-3與P2的酵母細(xì)胞在稀釋至10-3倍時,仍能在篩選培養(yǎng)基SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal)上正常生長,與陽性對照基本一致(圖5)。

    表2 P2-pGBKT7為誘餌篩選到的互作基因信息

    圖4 利用酵母雙雜交檢測pGBKT7-P2與TaTIFY10A-pGADT7、Ta14-3-3-pGADT7相互作用Fig.4 Interaction analysis among pGBKT7-P2 and TaTIFY10A-pGADT7 or Ta14-3-3-pGADT7 in the yeast two-hybrid system

    由此說明,TaTIFY、Ta14-3-3與P2存在較強(qiáng)的互作能力。

    3 討論

    病毒與植物因子互作在病毒侵染過程中有著十分重要的功能[20]。因此,在病毒侵染植物的過程中,探索病毒蛋白與寄主因子互作機(jī)制尤為關(guān)鍵[21]。研究表明,病毒的運(yùn)動蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生結(jié)構(gòu)關(guān)系十分密切[22]。小麥黃花葉病毒P2通過參與重排寄主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng),從而促進(jìn)病毒基因組在宿主的復(fù)制[23]。因此,通過探索與P2互作的蛋白,對研究WYMV的致病機(jī)理至關(guān)重要。

    酵母雙雜交技術(shù)是當(dāng)今最為普遍的一種科研技術(shù),不僅在研究蛋白間的互作和判定未知蛋白信息等方面有著重要的應(yīng)用,而且操作方便快捷,試驗結(jié)果可靠[24]。Oruetxebarria等[22]利用酵母雙雜交技術(shù),發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制酶Nib(nuclear inclusion protein B,Nib)與植物Rb有關(guān)的蛋白不存在互作關(guān)系,推測病毒RNA復(fù)制酶可能通過這些植物蛋白調(diào)控病毒RNA復(fù)制。Kong等[25]在擬南芥文庫中,以病毒復(fù)制蛋白AL1為誘餌進(jìn)行酵母雙雜交試驗,結(jié)果顯示,AL1能與組蛋白H3(histone 3)、驅(qū)動蛋白(kinesin)和一個激酶(kinase)相互作用并發(fā)揮功能。本實驗利用GATE-WAY克隆技術(shù),成功地構(gòu)建了小麥cDNA文庫,不但能保證文庫的質(zhì)量,而且操作的方法簡單、實用性高[26]。并且,本實驗將P2基因構(gòu)建到誘餌載體pGBKT7,在小麥的cDNA文庫進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)了18個與P2蛋白互作的候選寄主因子。其中大部分靶標(biāo)已證實與植物的抗逆或生長發(fā)育相關(guān)。擬南芥AtUBPA2c參與了水楊酸信號通路,并可調(diào)控抗病相關(guān)基因的表達(dá)[27];14-3-3能夠調(diào)控細(xì)胞周期組織、植物的新陳代謝、蛋白質(zhì)運(yùn)輸和激素信號傳導(dǎo)等多種生理過程,在植株生長發(fā)育和逆境響應(yīng)過程中表現(xiàn)關(guān)鍵作用[28];擬南芥TIFY家族蛋白JAZ7通過調(diào)節(jié)植物的光合作用、氧化還原反應(yīng)等參與植物的抗旱過程[29];TaBOI屬于RING型E3泛素化連接酶。研究表明,E3泛素化連接酶在植物抗病過程中發(fā)揮重要作用[30]。擬南芥E3泛素化連接酶ATL2和ATL4基因能夠被幾丁質(zhì)等病程相關(guān)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)[31];在水稻中抑制E3泛素化連接酶XA21結(jié)合蛋白(XA21-binding protein 3,XB3)的表達(dá)導(dǎo)致植株對Xanthomonasoryzaepv.Oryzae表現(xiàn)敏感[32]。本研究中,我們篩選發(fā)現(xiàn)WYMV-P2可以與大量的小麥蛋白存在相互作用,推測P2可能通過與候選因子在植物體內(nèi)發(fā)生互作,干擾了該蛋白介導(dǎo)的信號通路反應(yīng),從而促進(jìn)了WYMV的侵染。但是,P2與候選靶標(biāo)的互作關(guān)系還需要更多的實驗加以證實,如雙分子熒光實驗、GST-Pull down實驗等。此外,為了深入揭示P2如何影響寄主靶標(biāo)蛋白的功能,我們還需要對候選蛋白的功能及其對病毒侵染的影響進(jìn)行研究??傊?,本研究通過酵母雙雜交技術(shù)篩選出與WYMV-P2發(fā)生互作的小麥候選寄主因子,從中挖掘重要的小麥抗病相關(guān)基因并用于培育小麥抗病材料對小麥黃花葉病毒病的可持續(xù)控制具有重要作用。

    pGADT7-RECT與pGBKT7-Lam互作為陰性對照;pGADT7-RECT與pGBKT7-53互作為陽性對照;A,SD/-Trp/-Le培養(yǎng)基和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His培養(yǎng)基;B,SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal培養(yǎng)基。pGADT7-RECT interact with pGBKT7-Lam served as negative control; pGADT7-RECT interact with pGBKT7-53 served as positive control; A, SD/-Trp/-Leu medium and SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His medium; B, SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal medium.圖5 WYMV-P2與TaTIFY 10A-pGADT7、Ta14-3-3-pGADT7在酵母互作驗證Fig.5 Interaction of WYMV-P2 with and TaTIFY10A-pGADT7/Ta14-3-3-pGADT7 in a yeast two-hybrid analysis

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