酵母雙雜交篩選與小麥黃花葉病毒P2互作的寄主因子

韓曉蕾，高仕祺，張 帆，羊 健，劉 芃，姜鴻明，李林志，*

(1.煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 煙臺(tái) 265500； 2.煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 265500； 3.寧波大學(xué)/農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315000)

小麥黃花葉病是嚴(yán)重威脅我國小麥生產(chǎn)的主要土傳病害之一，主要是由小麥黃花葉病毒(wheat yellow mosaic virus，WYMV)引起，并以禾谷多粘菌(Ploymyxagraminis)為介體進(jìn)行傳播。根據(jù)調(diào)查，小麥黃花葉病在我國分布廣泛，已遍及長江流域各省份以及河南、陜西等省。據(jù)統(tǒng)計(jì)，該病害可導(dǎo)致小麥減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重的時(shí)候達(dá)70%～80%，并呈逐年蔓延趨勢(shì)。1927年，首先在日本鑒定得到WYMV基因組序列。隨后，我國河南、江蘇、四川等地區(qū)的WYMV分離物基因組序列也被相繼報(bào)道[1]。WYMV病毒粒子呈彎曲線狀且基因組由兩條單鏈正義RNA組成[2]。RNA1包含了7 635個(gè)核苷酸，共編碼8個(gè)蛋白，分別命名為：P3、7K、CI(細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含體蛋白，cytoplasmic inclusion)、14K、VPg、NIa(細(xì)胞核內(nèi)含體蛋白a，nuclear inclusion a)、NIb(細(xì)胞核內(nèi)含體蛋白，nuclear inclusion b)和CP(外殼蛋白，coat protein)[3-5]。其中，P3可以通過+2移碼產(chǎn)生P3 N端部分蛋白P3N-PIPO(N-terminal portion of P3 protein)[6]。RNA2共編碼核苷酸3 651個(gè)，編碼約100 ku的多聚蛋白，被切割后生成兩個(gè)成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白P1蛋白與P2蛋白[7-9]。研究表明，WYMV中的7K和14K蛋白具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，推測(cè)與病毒復(fù)制、胞間運(yùn)動(dòng)相關(guān)[10]；HC-Pro為馬鈴薯Y病毒屬成員，研究發(fā)現(xiàn)與P1的蛋白結(jié)構(gòu)十分相像，可能與RNA沉默抑制的活性有關(guān)[11]；VPg具備NLS(核定位信號(hào)，nuclear localization signal)和NES(核穿梭信號(hào)，nuclear export signal)，推測(cè)VPg具有病毒長距離移動(dòng)及復(fù)制功能[12]。

病毒不但基因組簡單，被編碼的蛋白少。而且病毒的復(fù)制、病毒粒子組裝和侵染等都需要借助于寄主的代謝系統(tǒng)完成[13]。目前，篩選蛋白間互作的方法眾多，其中酵母雙雜交技術(shù)已被普遍應(yīng)用于各類生物的蛋白質(zhì)互作試驗(yàn)中。因此，利用該技術(shù)篩選病毒蛋白的互作靶標(biāo)對(duì)研究病毒的致病機(jī)制至關(guān)重要[14-15]。Zhao等[16]以番茄花葉病毒(tomato mosaic tobamovirus，ToMV)運(yùn)動(dòng)蛋白(movement protein，MP)為誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選本氏煙cDNA文庫，分離得到寄主互作因子核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基(Rubisco small subunit，RbCS)。該基因沉默后，病毒在系統(tǒng)葉中的侵染受到限制，表明RbCS參與了病毒運(yùn)動(dòng)過程。Kong等[17]利用酵母雙雜交系統(tǒng)，以水稻條紋病毒(rice stripe virus，RSV)病害特異性蛋白(disease-specific protein，SP)為誘餌，篩選水稻cDNA文庫，得到一個(gè)放氧復(fù)合體蛋白(oxygen-evolving complex，OEC)。進(jìn)一步研究表明，SP通過改變OEC的亞細(xì)胞定位和葉綠體的結(jié)構(gòu)功能，從而增強(qiáng)了病毒癥狀的形成。前期報(bào)道表明，P2蛋白具有重排細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并形成聚集結(jié)構(gòu)的能力，同時(shí)能夠與P1、P3、Nia-Pro及VPg互作，并將其招募至聚集結(jié)構(gòu)中，與WYMV的復(fù)制密切相關(guān)[18]。目前，關(guān)于WYMV-P2在病毒與寄主分子相互作用中起到哪些具體功能和機(jī)制仍知之甚少。且對(duì)于WYMV編碼的蛋白與寄主因子互作機(jī)制研究相對(duì)較少。我們主要運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)篩選出與P2互作的候選寄主因子，為研究WYMV致病機(jī)理奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為小麥品種揚(yáng)麥158，cDNA保存于-80 ℃冰箱備用。大腸埃希菌(Escherichiacoli)感受態(tài)Mac1-T1 Competent Cell、DH5α農(nóng)桿菌感受態(tài)。DH10B、Y187購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥cDNA構(gòu)建

文庫是利用Clontech Mate&Plate TM Library Construction方法進(jìn)行構(gòu)建。并運(yùn)用Trizol方法[19]，提取總的小麥RNA并融解在RNase-free H2O中，用超微量分光光度計(jì)儀器測(cè)量RNA的純度與濃度。分離純化后，根據(jù)Fast Track MAG mRNA Isolation Kit說明書中的方法獲得mRNA。然后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。初級(jí)文庫的構(gòu)建是通過Clone-Miner方法進(jìn)行。把提取到的初級(jí)文庫質(zhì)粒稀釋成300 ng·μL-1后，在酵母載體pGADT7-DEST進(jìn)行LR重組反應(yīng)試驗(yàn)，電轉(zhuǎn)化于DH10B感受態(tài)細(xì)胞后，成功獲得可以用于酵母雙雜交的小麥cDNA文庫。把提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)至Y187感受態(tài)細(xì)胞中，獲得小麥cDNA酵母文庫。用1.5 mL離心管分裝備用。

1.2.2 文庫質(zhì)量的測(cè)定

取10 μL酵母文庫大腸埃希菌甘油菌，利用無菌水以100倍比例稀釋，用104、106和108的菌液100 μL涂布在LB瓊脂平板上(Amp+)，并計(jì)算菌落生成個(gè)數(shù)。根據(jù)公式計(jì)算文庫滴度：文庫滴度=平板的克隆數(shù)×稀釋的倍數(shù)×103/涂板體積。將cDNA文庫質(zhì)粒用大腸埃希菌感受態(tài)Mac1-T1中轉(zhuǎn)化后，取100 μL均勻涂布在LB瓊脂平板上(Amp+)，從中隨機(jī)挑選單克隆，利用pGADT7通用載體引物對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)插入片段大小。利用公式：文庫重組率=(反應(yīng)個(gè)數(shù)/反應(yīng)總數(shù))×100%，計(jì)算重組率。

1.2.3 Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備

運(yùn)用Clontech Matchmaker TM Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual 說明書方法進(jìn)行。從-80 ℃冰凍保存的Y2HGold酵母細(xì)胞在YPDA瓊脂平板上進(jìn)行劃線，放置30 ℃培養(yǎng)箱3 d后，在YPDA瓊脂平板上挑取新鮮的單克隆菌落至3 mL的YPDA液體培養(yǎng)基中，于30℃搖床以250 r·min-1振蕩8～12 h。吸取5 μL至50 mLYPDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃以250 r·min-1搖至D值為0.4～0.6；5 000 r·min-1離心收集菌體，用ddH2O洗滌酵母細(xì)胞后，以1.5 mL的1.1×TE/LiAc重懸菌液，最終形成酵母感受態(tài)并用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 重組誘餌載體pGBKT7-P2的構(gòu)建

以侵染小麥黃花葉病毒的小麥cDNA為擴(kuò)增模板擴(kuò)出目的片段；擴(kuò)增產(chǎn)物及pGBKT7-T載體用BamHⅠ和SmaⅠ在37 ℃條件下酶切4 h后，用T4連接酶4 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Mac1-T1大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞中。此后用pGBKT7通用引物對(duì)單克隆進(jìn)行檢測(cè)，并用含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基對(duì)陽性單克隆進(jìn)行擴(kuò)培，質(zhì)粒提取后送杭州有康生物公司進(jìn)行測(cè)序。將重組的質(zhì)粒pGBKT7-P2、空載體pGADT7，轉(zhuǎn)入到Y(jié)2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在兩種營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上。倒置在30 ℃培養(yǎng)箱，孵育2～3 d后觀察菌落生長情況，并判斷誘餌質(zhì)粒pGBKT7-P2是否有自激活能力和毒性。

1.2.5 小麥cDNA文庫篩選

將15 μg的cDNA文庫質(zhì)粒和2 μg誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-P2共同轉(zhuǎn)至酵母感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布在兩種篩選培養(yǎng)基SD(-Trp/-Leu)和SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)平板上，30 ℃孵育，篩選陽性克隆。提取生長正常的單克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中，測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)后，獲得候選靶標(biāo)的基因全長。將其中兩個(gè)基因Ta14-3-3與TaTIFY的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)構(gòu)建至pGADT7中(引物見表1)，獲得靶標(biāo)載體pGADT7-Ta14-3-3及pGADT7-TaTIFY。將靶標(biāo)載體分別與pGBKT7-P2共轉(zhuǎn)至酵母感受態(tài)細(xì)胞中，并在缺陷型培養(yǎng)基SD(-Leu/-Trp)和SD(-Leu/-Trp/-His/-Ade)中進(jìn)行培養(yǎng)，驗(yàn)證互作結(jié)果。

表1 酵母重組質(zhì)粒構(gòu)建引物

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥cDNA文庫的構(gòu)建及檢測(cè)

小麥文庫構(gòu)建完成后，通過文庫滴度計(jì)算公式，得到小麥cDNA文庫滴度大于1.0×108CFU·mL-1，庫容量算得為3.2×107CFU，重組率大于96%。文庫質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化后，隨機(jī)挑選平板上生長狀態(tài)良好的47個(gè)單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。圖1顯示，插入片段大小范圍主要分布在300～1 000 bp，密集分布于700～800 bp，且沒有發(fā)現(xiàn)空載體。由此說明，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的cDNA文庫完整性及覆蓋度較好，達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)cDNA文庫的要求，可用于后續(xù)的試驗(yàn)。

2.2 誘餌載體的構(gòu)建

用T4連接酶連接，成功獲得誘餌載體pGBKT7-P2。經(jīng)測(cè)序結(jié)果顯示，重組載體讀碼框正確，無移碼突變(圖2)。將載體pGBKT7-P2與pGADT7轉(zhuǎn)入酵母Y2HGold細(xì)胞感受態(tài)中，涂布在兩種篩選培養(yǎng)基SD(-Trp/-Leu)和 SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal)中，30 ℃培養(yǎng)2～3 d觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化菌落都能在篩選培養(yǎng)基SD(-Trp/-Leu)板上正常生長，且與對(duì)照相比，生長速度無明顯差別。但在SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal)上均不能生長(圖3)。確定誘餌質(zhì)粒對(duì)酵母菌株沒有自激活能力和毒性，可以用與下一步篩選試驗(yàn)。

2.3 篩選與WYMV-P2互作寄主因子

將誘餌載體pGBKT7-P2與本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至酵母感受態(tài)中后，從SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)固體篩選培養(yǎng)基上篩選與WYMV-P2互作的候選蛋白。經(jīng)PCR檢測(cè)后，共得到52個(gè)陽性克隆。經(jīng)NCBI在線工具預(yù)測(cè)后，發(fā)現(xiàn)得到的陽性克隆包含了18個(gè)蛋白，其功能如表2所示。為了說明P2寄主靶標(biāo)的功能與植物抗逆性密切相關(guān)的候選靶標(biāo)蛋白進(jìn)行了序列分析。序列分析表明，TaTOM75全長為1 146 bp，共編碼氨基酸382個(gè)，有一個(gè)Major intrinsic protein(MIP)結(jié)構(gòu)域；TaRS31全長2 742 bp，編碼914個(gè)氨基酸，包含兩個(gè)RNA recognition motif(RRM)結(jié)構(gòu)域，分別位于第1到32位，及第55位到123位氨基酸；TaLIP為1 275 bp，編碼425個(gè)氨基酸，Pfam預(yù)測(cè)第95到312位為PAP fibrillin結(jié)構(gòu)域；Ta14-3-3的ORF長度為789 bp，其蛋白序列包含一個(gè)典型的14-3-3蛋白結(jié)構(gòu)域；TaTIFY-10A編碼全長序列為1 012 bp，其蛋白序列第86位到第119位氨基酸為TIFY家族結(jié)構(gòu)域，且在第152到177位是Divergent CCT基序(CCT2)；TaUBPA2c為1 701 bp，編碼567個(gè)氨基酸，包含一個(gè)典型的RNA recognition motif(MMR)結(jié)構(gòu)域。TaBOI的ORF區(qū)為1 021 bp，編碼340個(gè)氨基酸。TaBAG6全長為2 775 bp，編碼925個(gè)氨基酸，這兩個(gè)蛋白均為E3泛素化相關(guān)蛋白。為了進(jìn)一步驗(yàn)證酵母雙雜交的準(zhǔn)確性，我們隨機(jī)選擇了兩個(gè)蛋白TaTIFY與Ta14-3-3，并將其ORF區(qū)在小麥cDNA中克隆并構(gòu)建在pGADT7形成靶標(biāo)載體pGADT7-TaTIFY及pGADT7-Ta14-3-3。隨后分別將pGADT7-TaTIFY、pGADT7-Ta14-3-3與誘餌載體P2-pGBKT7共轉(zhuǎn)至酵母感受態(tài)中。

M，DL8000 對(duì)照；1～47，重組子。M， DL8000 DNA marker; 1-47， Recombinants.圖1 四十七個(gè)單克隆的PCR檢測(cè)Fig.1 Picture of 47 clones

M，DL8000；泳道1～2，NdeⅠ/PstⅠ雙酶切pGBKT7-P2；泳道3～4，NdeⅠ/PstⅠ雙酶切pGBKT7。M， DL8000; Lane 1-2， pGBKT7-P2 enzyme digestion by NdeⅠ/PstⅠ; Lane 3-4， pGBKT7 enzyme digestion by NdeⅠ/PstⅠ.圖2 酵母重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.2 Double digestion patterns of recombinant plasmid

A，模式圖，pGADT7-RECT與pGBKT7-Lam互作為陰性對(duì)照，pGADT7-RECT與pGBKT7-53互作為陽性對(duì)照，pGBKT7-P2與pGBKT7互作為自激活驗(yàn)證；B，SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基；C，SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal培養(yǎng)基。A， Mode pattern， pGADT7-RECT interact with pGBKT7-Lam served as negative control， pGADT7-RECT interact with pGBKT7-53 served as positive control， pGBKT7-P2 interact with pGBKT7 served as auto-activation tests; B， SD/-Trp/-Leu medium; C， SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal medium.圖3 pGBKT7-P2、pGBKT7載體自激活驗(yàn)證及毒性驗(yàn)證Fig.3 Autoactivation and toxicity testing of pGBKT7-P2 or pGBKT7

將靶標(biāo)載體和誘餌載體共轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母感受態(tài)均能生長在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)上，并且在加了X-α-Gal的缺陷培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)酵母菌落變藍(lán)明顯，由此說明，TaTIFY、Ta14-3-3與P2在酵母體內(nèi)存在互作關(guān)系(圖4)。為進(jìn)一步說明互作強(qiáng)弱，我們?cè)谂囵B(yǎng)基SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)挑選了單克隆，并用無菌水做了梯度稀釋。結(jié)果表明，含有TaTIFY與P2及Ta14-3-3與P2的酵母細(xì)胞在稀釋至10-3倍時(shí)，仍能在篩選培養(yǎng)基SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal)上正常生長，與陽性對(duì)照基本一致(圖5)。

表2 P2-pGBKT7為誘餌篩選到的互作基因信息

圖4 利用酵母雙雜交檢測(cè)pGBKT7-P2與TaTIFY10A-pGADT7、Ta14-3-3-pGADT7相互作用Fig.4 Interaction analysis among pGBKT7-P2 and TaTIFY10A-pGADT7 or Ta14-3-3-pGADT7 in the yeast two-hybrid system

由此說明，TaTIFY、Ta14-3-3與P2存在較強(qiáng)的互作能力。

3 討論

病毒與植物因子互作在病毒侵染過程中有著十分重要的功能[20]。因此，在病毒侵染植物的過程中，探索病毒蛋白與寄主因子互作機(jī)制尤為關(guān)鍵[21]。研究表明，病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生結(jié)構(gòu)關(guān)系十分密切[22]。小麥黃花葉病毒P2通過參與重排寄主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而促進(jìn)病毒基因組在宿主的復(fù)制[23]。因此，通過探索與P2互作的蛋白，對(duì)研究WYMV的致病機(jī)理至關(guān)重要。

酵母雙雜交技術(shù)是當(dāng)今最為普遍的一種科研技術(shù)，不僅在研究蛋白間的互作和判定未知蛋白信息等方面有著重要的應(yīng)用，而且操作方便快捷，試驗(yàn)結(jié)果可靠[24]。Oruetxebarria等[22]利用酵母雙雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制酶Nib(nuclear inclusion protein B，Nib)與植物Rb有關(guān)的蛋白不存在互作關(guān)系，推測(cè)病毒RNA復(fù)制酶可能通過這些植物蛋白調(diào)控病毒RNA復(fù)制。Kong等[25]在擬南芥文庫中，以病毒復(fù)制蛋白AL1為誘餌進(jìn)行酵母雙雜交試驗(yàn)，結(jié)果顯示，AL1能與組蛋白H3(histone 3)、驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin)和一個(gè)激酶(kinase)相互作用并發(fā)揮功能。本實(shí)驗(yàn)利用GATE-WAY克隆技術(shù)，成功地構(gòu)建了小麥cDNA文庫，不但能保證文庫的質(zhì)量，而且操作的方法簡單、實(shí)用性高[26]。并且，本實(shí)驗(yàn)將P2基因構(gòu)建到誘餌載體pGBKT7，在小麥的cDNA文庫進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了18個(gè)與P2蛋白互作的候選寄主因子。其中大部分靶標(biāo)已證實(shí)與植物的抗逆或生長發(fā)育相關(guān)。擬南芥AtUBPA2c參與了水楊酸信號(hào)通路，并可調(diào)控抗病相關(guān)基因的表達(dá)[27]；14-3-3能夠調(diào)控細(xì)胞周期組織、植物的新陳代謝、蛋白質(zhì)運(yùn)輸和激素信號(hào)傳導(dǎo)等多種生理過程，在植株生長發(fā)育和逆境響應(yīng)過程中表現(xiàn)關(guān)鍵作用[28]；擬南芥TIFY家族蛋白JAZ7通過調(diào)節(jié)植物的光合作用、氧化還原反應(yīng)等參與植物的抗旱過程[29]；TaBOI屬于RING型E3泛素化連接酶。研究表明，E3泛素化連接酶在植物抗病過程中發(fā)揮重要作用[30]。擬南芥E3泛素化連接酶ATL2和ATL4基因能夠被幾丁質(zhì)等病程相關(guān)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)[31]；在水稻中抑制E3泛素化連接酶XA21結(jié)合蛋白(XA21-binding protein 3，XB3)的表達(dá)導(dǎo)致植株對(duì)Xanthomonasoryzaepv.Oryzae表現(xiàn)敏感[32]。本研究中，我們篩選發(fā)現(xiàn)WYMV-P2可以與大量的小麥蛋白存在相互作用，推測(cè)P2可能通過與候選因子在植物體內(nèi)發(fā)生互作，干擾了該蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路反應(yīng)，從而促進(jìn)了WYMV的侵染。但是，P2與候選靶標(biāo)的互作關(guān)系還需要更多的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)，如雙分子熒光實(shí)驗(yàn)、GST-Pull down實(shí)驗(yàn)等。此外，為了深入揭示P2如何影響寄主靶標(biāo)蛋白的功能，我們還需要對(duì)候選蛋白的功能及其對(duì)病毒侵染的影響進(jìn)行研究?？傊狙芯客ㄟ^酵母雙雜交技術(shù)篩選出與WYMV-P2發(fā)生互作的小麥候選寄主因子，從中挖掘重要的小麥抗病相關(guān)基因并用于培育小麥抗病材料對(duì)小麥黃花葉病毒病的可持續(xù)控制具有重要作用。

pGADT7-RECT與pGBKT7-Lam互作為陰性對(duì)照；pGADT7-RECT與pGBKT7-53互作為陽性對(duì)照；A，SD/-Trp/-Le培養(yǎng)基和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His培養(yǎng)基；B，SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal培養(yǎng)基。pGADT7-RECT interact with pGBKT7-Lam served as negative control; pGADT7-RECT interact with pGBKT7-53 served as positive control; A， SD/-Trp/-Leu medium and SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His medium; B， SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal medium.圖5 WYMV-P2與TaTIFY 10A-pGADT7、Ta14-3-3-pGADT7在酵母互作驗(yàn)證Fig.5 Interaction of WYMV-P2 with and TaTIFY10A-pGADT7/Ta14-3-3-pGADT7 in a yeast two-hybrid analysis