常溫貯藏期間雞蛋清流變特性和蛋白質(zhì)成分的變化

楊曉盼，劉麗莉，黃正迪，李媛媛，郝威銘，張孟軍，史勝娟

(河南科技大學 食品與生物工程學院，食品加工與安全國家級教學示范中心，食品原料河南省工程技術(shù)研究中心，食品加工與質(zhì)量安全控制河南省國際聯(lián)合實驗室，河南 洛陽 471023)

雞蛋在常溫貯藏條件下品質(zhì)劣變迅速，在劣變過程中，蛋清蛋白出現(xiàn)逐漸變稀的現(xiàn)象(蛋清稀化現(xiàn)象)[1]。關(guān)于雞蛋貯藏期間品質(zhì)變化的報道有很多。于濱等[2]研究發(fā)現(xiàn)，雞蛋的品質(zhì)變化動力學級數(shù)與禽蛋品種無關(guān)，不同種類禽蛋在貯藏過程中的品質(zhì)變化規(guī)律基本相似。李紅等[3]研究發(fā)現(xiàn)，蛋清稀化現(xiàn)象與禽蛋的貯藏條件、貯藏時間等密切相關(guān)。王曉翠等[4]、方軍[5]認為，在貯藏過程中蛋白質(zhì)的變化可能與蛋清稀化有關(guān)。Drabik等[6]研究發(fā)現(xiàn)，雞蛋在貯藏過程中濃蛋白隨著貯藏時間的延長逐漸轉(zhuǎn)化為低黏度狀態(tài)；而Wang等[7]發(fā)現(xiàn)，全蛋液在冷藏條件下，蛋白粒徑和功能特性逐漸降低。這些研究主要報道了禽蛋貯藏過程中蛋清蛋白理化特性和功能特性的變化情況，關(guān)于蛋清流變特性的研究報道較少。

蛋白質(zhì)在降解過程中，空間結(jié)構(gòu)打開，分子間作用力與疏水基團發(fā)生變化，進而影響蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，可能會促使溶液里的蛋白質(zhì)間三維結(jié)構(gòu)形成或降解，進而影響其黏度與功能特性[8-10]。蛋清中含有多種蛋白質(zhì)，是個復雜的蛋白質(zhì)系統(tǒng)，其中的蛋白質(zhì)發(fā)生變化時會互相影響，從而產(chǎn)生一系列復雜的變化。蛋白含量發(fā)生變化時，可能會對蛋清的加工特性和流變特性產(chǎn)生影響，但在本研究檢索范圍內(nèi)未見這方面的深入報道。

本研究以雞蛋清為原料，探究其在貯藏期間蛋清內(nèi)幾種主要蛋白質(zhì)及其流變特性的變化，探索上述變化與蛋清稀化的關(guān)系，旨在為探明蛋清稀化的機理提供理論基礎，從而為延緩蛋清稀化提供理論支撐，助推我國禽蛋深加工產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋、大豆油，購自河南省洛陽市某超市。

溶壁微球菌、溶菌酶標品，生工生物工程(上海)股份有限公司；濃鹽酸(分析純)，洛陽昊華化學試劑有限公司；氯化鈉(分析純)，江蘇強盛功能化學股份有限公司；氫氧化鈉(分析純)，西隴化工股份有限公司；醋酸鈉(分析純)、磷酸二氫鈉(分析純)，天津市德恩化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉(分析純)，天津市光復科技發(fā)展有限公司；乙酸(分析純)，萊陽市康德化工有限公司；酒石酸鉀鈉(分析純)、五水硫酸銅(分析純)，天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

H1650型高速離心機，湘儀集團；TDZ5-BP型高速冷凍離心機，長沙湘銳離心機有限公司；85-2A型數(shù)顯恒溫測速磁力攪拌器，常州榮華儀器制造有限公司；DHR-2型流變儀，美國沃特世(Waters)公司；DSC1型差示掃描量熱儀，瑞士Mettler-Toledo公司；UV-1100型紫外分光光度計，上海美普達儀器有限公司；LGJ-10D型冷凍干燥機，上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州朗越儀器制造有限公司；DH-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 試驗方法

將所有雞蛋放置于(25±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中貯藏，28 d以后，雞蛋出現(xiàn)散黃現(xiàn)象，無法測定，故測試時長設置為28 d。其間，每隔4 d取樣，即分別于貯藏0、4、8、12、16、20、24、28 d時，每次隨機挑選出3枚雞蛋，外殼洗凈消毒，除去蛋黃，分離蛋清，測定貯藏過程中蛋清的各項指標變化，每個樣品重復測定3次。

1.4 測定指標

1.4.1 主要蛋白質(zhì)的測定

卵黏蛋白含量參照劉美玉等[11]的方法進行測定，S-卵白蛋白含量參照黃群[12]的方法進行測定，蛋清溶菌酶含量與活力參照王晶[13]的方法進行測定。

1.4.2 功能特性的測定

參照李弓中等[14]的方法，起泡性與泡沫穩(wěn)定性采用機械攪打法進行測定，乳化性與乳化穩(wěn)定性采用濁度法進行測定。

1.4.3 差式掃描量熱分析(DSC)

用差示掃描量熱儀測定蛋清的熱變性溫度，測定溫度范圍為25～140 ℃，升溫速率10 ℃·min-1，每次樣品用量2～3 mg，氮氣流速60 mL·min-1。

1.4.4 蛋清流變特性的測定

參照王雪瑩等[15]和Panaite等[16]的方法，略做修改，測定蛋清的流變特性。測試前，將樣品在室溫(25 ℃)下放置1 h。將樣品置于流變儀感應板上，使用C平板進行測定，板間距為1 000 nm，平板邊緣過量樣品用塑料刮鏟除去。設定靜態(tài)流變學參數(shù)(剪切速率范圍0.01～1 000 s-1)，繪制剪切速率與表觀黏度的關(guān)系圖。設定動態(tài)頻率掃描參數(shù)：固定振蕩應變0.3%，頻率變化范圍0.01～300 rad·s-1，測定蛋清儲能模量(G′)和損耗模量(G″)的變化規(guī)律。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù)。運用DPS 7.05軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，對有顯著(P<0.05)差異的，采用SNK法進行多重比較。采用Origin 8.5軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏期間蛋清主要蛋白質(zhì)含量與溶菌酶活性變化

如表1所示，在貯藏期間，蛋清中的卵白蛋白逐漸轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定形式，即卵白蛋白由N-構(gòu)型向S-構(gòu)型轉(zhuǎn)化[17]。由于轉(zhuǎn)化過程不可逆，S-卵白蛋白的含量隨貯藏時間延長而顯著(P<0.05)增加，至28 d，S-卵白蛋白的含量高達(92.99±0.81)%。對貯藏時間與S-卵白蛋白的含量進行相關(guān)性分析，在本試驗設置的25 ℃貯藏條件下，蛋清中S-卵白蛋白含量與貯藏時間的相關(guān)系數(shù)為0.957 7，相關(guān)性達到顯著水平(P<0.05)，與付丹丹等[18]的研究結(jié)果一致。

隨著雞蛋貯藏時間的延長，蛋清中的卵黏蛋白含量顯著(P<0.05)降低。這可能與雞蛋貯藏過程中pH變化導致卵黏蛋白結(jié)構(gòu)降解有關(guān)[11]。隨著貯藏過程中卵黏蛋白的降解，濃蛋白會逐漸轉(zhuǎn)化為稀蛋白。

蛋清中的溶菌酶一部分以游離形式存在，一部分與卵黏蛋白作用形成卵黏蛋白-溶菌酶復合體。在貯藏初期，蛋清中的溶菌酶含量有明顯升高趨勢，但隨后其活力逐漸降低。這可能是因為，在貯藏初期，隨著蛋清濃蛋白的稀化，卵黏蛋白-溶菌酶復合體逐漸分解，一部分溶菌酶被釋放出來，導致其含量略有升高[3]。同時，蛋黃中的部分溶菌酶也透過蛋黃膜進入蛋清。但隨著貯藏時間的延長，溶菌酶變性速度加快，導致溶菌酶含量降低。隨著蛋清卵黏蛋白-溶菌酶復合體逐漸解離出新的溶菌酶，貯藏后期蛋清中的溶菌酶活力產(chǎn)生一定的提高。由此推測，溶菌酶含量的變化也可能是導致蛋清稀化的原因之一[19]。

表1 貯藏期間蛋清中主要蛋白質(zhì)含量與溶菌酶活性的變化

2.2 貯藏期間蛋清的功能特性變化

由表2可以看出，在貯藏過程中，蛋清的起泡性和乳化性表現(xiàn)出顯著(P<0.05)的先增高后降低的趨勢，而泡沫穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性均隨著貯藏時間的延長顯著(P<0.05)降低。貯藏過程中，蛋清蛋白逐漸分解，折疊蛋白的疏水基團逐漸暴露出來[14]。這就導致貯藏初期蛋清的起泡性和乳化性均有一定提高。隨著貯藏時間繼續(xù)延長，蛋清中的濃蛋白進一步分解，可能導致蛋清蛋白間的相互作用減弱，二硫鍵、氫鍵等減少[12]，從而影響蛋清的起泡性和乳化性。

從表1和表2的結(jié)果推測，蛋清的功能特性與其主要蛋白質(zhì)的含量可能具有相關(guān)性。將蛋清中的卵黏蛋白、S-卵白蛋白、溶菌酶含量分別與蛋清的起泡性、泡沫穩(wěn)定性、乳化性、乳化穩(wěn)定性進行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示。蛋清的起泡性、泡沫穩(wěn)定性、乳化穩(wěn)定性與S-卵白蛋白含量呈極顯著(P<0.01)負相關(guān)，與卵黏蛋白含量呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)。

2.3 貯藏期間蛋清的差示掃描量熱分析

DSC熱流圖可以反映物質(zhì)熱轉(zhuǎn)變的溫度變化與焓變。蛋清中卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵白蛋白在水中的變性溫度分別為61.0 ℃和84.0 ℃，但由于液體蛋清的成分復雜，DSC峰范圍寬，影響單一蛋白的變性峰，導致無法清晰判斷出蛋白質(zhì)的變性峰。如圖1所示，在貯藏過程中，蛋清的熱焓值呈現(xiàn)出逐漸增高的趨勢。這可能是因為蛋清的熱流圖出現(xiàn)重疊峰，導致蛋清焓變受到影響[20]。在貯藏后期，熱焓值增高的原因可能是，S-卵白蛋白的熱穩(wěn)定性更高[18]，卵白蛋白由N型轉(zhuǎn)變?yōu)镾型后，蛋清中S-卵白蛋白含量的上升導致蛋清整體的熱變性溫度升高，焓值增大。在圖1的100～110 ℃之間出現(xiàn)一個峰，這可能是由蛋清中的S-卵白蛋白熱變性引起的。隨著貯藏時間延長，蛋清的熱轉(zhuǎn)變溫度逐漸增大?？赡艿脑蚴?，蛋清中濃蛋白減少，卵黃膜變得脆弱，無法徹底隔絕蛋清與蛋黃，導致蛋黃中的部分物質(zhì)進入蛋清，使得蛋清體系更加復雜，從而逐漸影響峰值。這與趙金紅等[21]的研究一致。另外，貯藏過程中蛋清中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與聚集狀態(tài)發(fā)生改變，導致其熱穩(wěn)定性降低，也會影響蛋清的熱焓值變化[22]。

表2 貯藏期間蛋清的功能特性變化

表3 蛋清中蛋白質(zhì)含量與蛋清功能特性的相關(guān)性

圖1 貯藏期間蛋清的熱變性溫度與熱焓值變化Fig.1 Changes in thermal denaturation temperature and enthalpy value of albumin during storage

2.4 貯藏期間蛋清的流變特性變化

蛋清為非牛頓假塑性流體，隨著剪切速率增加，其表觀黏度逐漸降低，呈現(xiàn)明顯的剪切稀化現(xiàn)象[23]。貯藏期間，蛋清表觀黏度的變化主要體現(xiàn)在剪切速率為0～10 s-1時。如圖2所示，蛋清的表觀黏度在貯藏初期上升，之后隨貯藏時間的延長而逐漸下降。蛋清的表觀黏度在第8天達到最大。在貯藏初期，雞蛋品質(zhì)保持較好，表觀黏度減小程度較弱。同時，雞蛋通過蛋殼在與外界氣體交換的過程中失水，而水分對表觀黏度的影響在此時占主要作用，這就使得蛋清液在貯藏初期呈現(xiàn)出黏度上升的現(xiàn)象。到了貯藏后期，蛋清的表觀黏度下降較快。主要原因可能是，蛋清中的濃蛋白減少，蛋白質(zhì)含量發(fā)生變化，蛋清、蛋白的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)變得稀疏。同時，卵黏蛋白在貯藏期間的逐漸分解引起分子間的聚集狀態(tài)減弱，對蛋清的表觀黏度變化也產(chǎn)生了一定的影響。此外，卵黏蛋白-溶菌酶復合體的解離也在一定程度上影響了蛋清的黏度。卵白蛋白在貯藏過程中結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水基團逐漸暴露，可能影響蛋白質(zhì)間的結(jié)構(gòu)，使分子間二硫鍵強度逐漸減弱[24-25]，表觀黏度下降。

圖2 貯藏期間蛋清的表觀黏度變化Fig.2 Viscosity changes of albumin during storage

G′為儲能模量(彈性模量)，即蛋清液隨剪切頻率改變而產(chǎn)生變形的能力[26]；G″為損耗模量(黏性模量)，即剪切頻率發(fā)生改變時蛋清液的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或蛋白分子聚集狀態(tài)發(fā)生改變消耗的能量[27-28]。從圖3可以看出，蛋清液的流變特性隨剪切力的改變發(fā)生明顯的改變，說明貯藏時間對蛋清液的流變特性影響較大。當剪切的角頻率在0～50 rad·s-1時，蛋清液存在一定的線性黏彈區(qū)，主要表現(xiàn)出彈性為主的特性，說明蛋清液的內(nèi)部結(jié)構(gòu)未被剪切力破壞或破壞程度較小[27]。當剪切的角頻率超過100 rad·s-1后，前12 d的G′是逐漸增大的，但12 d后G′呈現(xiàn)減小趨勢。G′隨著貯藏時間的延長而逐漸下降，說明蛋清的凝膠性能逐漸減弱[23，28]，這與表觀黏度的變化規(guī)律一致?？赡苁且驗镚′與大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂肪等的固體彈性行為有關(guān)[29]，隨著貯藏后期蛋清中蛋白質(zhì)含量的巨大變化，G′亦相應變化。

G″隨著貯藏時間的延長逐漸降低。在貯藏前期，不同溫度條件下的G′均大于G″，表現(xiàn)為流體的彈性性質(zhì)[30]；在貯藏后期，G″均大于G′，蛋清表現(xiàn)出黏性特征[29]。在貯藏過程中，蛋清的彈性特征轉(zhuǎn)變?yōu)轲ば蕴卣?，表明蛋清的蛋白含量與結(jié)構(gòu)逐漸變化，出現(xiàn)稀化現(xiàn)象[31]。蛋清在貯藏過程中，彈性特征和黏性特征都逐漸減小，說明其流動性增加，即黏度降低，這與表觀黏度的研究結(jié)果相符。

圖3 貯藏期間蛋清流變特性的變化Fig.3 Rheological properties of albumin during storage

3 結(jié)論

本研究表明，蛋清中的蛋白質(zhì)在貯藏過程中會發(fā)生明顯變化，濃蛋白隨著貯藏時間的延長逐漸變稀，直到完全水化。在這一過程中，隨著濃蛋白的逐漸減少，卵黏蛋白、卵白蛋白和溶菌酶含量均發(fā)生顯著(P<0.05)變化，說明蛋清中蛋白質(zhì)的含量變化對蛋清稀化有一定影響。同時，蛋清的功能特性隨著蛋白含量的變化顯著(P<0.05)降低。由于蛋清體系較為復雜，故而蛋清的差示掃描量熱分析發(fā)生較大變化。蛋清的表觀黏度也逐漸降低，蛋清由主要表現(xiàn)彈性特征轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕憩F(xiàn)黏性特征。這些變化表明，貯藏期間蛋清的蛋白質(zhì)成分變化與其功能特性和流變特性的變化具有一定的關(guān)聯(lián)性。蛋清的稀化受到蛋白質(zhì)含量變化的影響，蛋白質(zhì)的變化會影響蛋清的功能特性，蛋清流變特性的變化可用來表征蛋清稀化的程度。這些變化產(chǎn)生的原因可能是，蛋白質(zhì)的變化使蛋清中的蛋白聚集狀態(tài)和網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)間的相互作用。今后可嘗試從蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與相互作用變化視角進一步研究蛋清的稀化現(xiàn)象。