丁香酚麻醉輔助加州鱸無(wú)水活運(yùn)的效果

王彩霞，白 嬋，熊光權(quán)，王炬光，李 寧，鉏曉艷，李海藍(lán)，廖 濤,

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064；2.武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430073）

加州鱸味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，屬于廣溫性名貴肉食水產(chǎn)品，2019年全國(guó)鱸魚養(yǎng)殖產(chǎn)量47.78萬(wàn) t，而廣東、江蘇和浙江三省的養(yǎng)殖產(chǎn)量即占全國(guó)產(chǎn)量的80%以上，為平衡鮮活加州鱸在我國(guó)的市場(chǎng)供需，將魚由養(yǎng)殖地成功運(yùn)輸?shù)较M(fèi)地具有重要的意義。就活魚運(yùn)輸而言，其目標(biāo)主要有兩個(gè)：第一，在運(yùn)輸期間和運(yùn)輸后保持魚鮮活，以確保滿足市場(chǎng)需求和部分市場(chǎng)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)采集；第二，盡可能經(jīng)濟(jì)安全地運(yùn)輸和貯存魚。為同時(shí)滿足上述需要，無(wú)水活運(yùn)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

20世紀(jì)90年代日本科學(xué)家最先開始研究無(wú)水活運(yùn)技術(shù)，并于1990年，利用無(wú)水活運(yùn)技術(shù)對(duì)低溫馴化至冬眠狀態(tài)的鯉魚、河豚、鯛魚進(jìn)行陸運(yùn)和空運(yùn)，運(yùn)輸時(shí)間均可長(zhǎng)達(dá)20 h以上，實(shí)驗(yàn)獲得成功[1]，之后無(wú)水活運(yùn)技術(shù)取得進(jìn)一步發(fā)展。Skudlarek等[2]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用緩慢降溫結(jié)合麻醉劑AQUI-S對(duì)羅氏沼蝦進(jìn)行預(yù)處理后，模擬無(wú)水?；钸\(yùn)輸?shù)牧_氏沼蝦運(yùn)輸32 h后存活率仍達(dá)96%，并發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸前緩慢降溫至低溫并結(jié)合適量麻醉劑預(yù)處理，運(yùn)輸中添加二氧化碳和氨氮吸收包等適當(dāng)?shù)奶幚韺?duì)保證運(yùn)輸?shù)某晒Ψ浅Ｖ匾?。白艷龍等[3]研究生態(tài)冰溫麻醉黃顙魚無(wú)水?；罴夹g(shù)，發(fā)現(xiàn)保活20 h存活率仍可達(dá)100%，同時(shí)通過(guò)檢測(cè)保活過(guò)程的血液生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)該過(guò)程對(duì)肝臟和腎臟均有一定損傷。李寧等[4]研究二氧化碳麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰后進(jìn)行無(wú)水?；睿；?～7 h時(shí)存活率達(dá)100%，延長(zhǎng)?；顣r(shí)間后存活率會(huì)驟然下降，結(jié)果也表明無(wú)水保活運(yùn)輸后的魚體內(nèi)粗蛋白和脂肪含量均會(huì)顯著降低，復(fù)蘇后短時(shí)間無(wú)法恢復(fù)到正常水平。

不同麻醉方式無(wú)水?；罱Y(jié)果存在差異，丁香酚是一種高效、低殘留、低毒害的麻醉劑[5-6]。目前，日本、澳大利亞、新西蘭等國(guó)明確規(guī)定丁香酚可作為合法漁用麻醉劑[7-8]，使用丁香酚將魚類麻醉至休眠狀態(tài)，以減緩長(zhǎng)途運(yùn)輸過(guò)程魚類強(qiáng)烈應(yīng)激反應(yīng)，達(dá)到提高存活率的運(yùn)輸目的。目前，丁香酚輔助運(yùn)魚主要應(yīng)用到有水活運(yùn)中[9]，使丁香酚輔助活魚運(yùn)輸應(yīng)用范圍受到限制。本實(shí)驗(yàn)開展丁香酚麻醉輔助加州鱸無(wú)水保活的研究，初步探究丁香酚麻醉加州鱸的較佳麻醉溫度、麻醉劑質(zhì)量濃度、?；顪囟?，比較在較佳保活條件下?；畈煌瑫r(shí)間后加州鱸血液指標(biāo)、肌肉指標(biāo)及丁香酚在魚體內(nèi)的殘留代謝規(guī)律，以期為丁香酚輔助應(yīng)用于加州鱸無(wú)水活運(yùn)過(guò)程提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用魚均購(gòu)于湖北嘉魚縣水產(chǎn)養(yǎng)殖市場(chǎng)，將購(gòu)買后的實(shí)驗(yàn)用魚放在提前曝氣的自來(lái)水中暫養(yǎng)2～3 d，挑選無(wú)外傷、鱗片完整、眼球明亮有光澤、體長(zhǎng)基本一致的健康加州鱸（（300±20）g）作為實(shí)驗(yàn)原材料。

谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）測(cè)定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamicpyruvic transaminase，GPT）測(cè)定試劑盒、尿素氮測(cè)定試劑盒、肌酐測(cè)定試劑盒、總蛋白測(cè)定試劑盒、白蛋白測(cè)定試劑盒、溶菌酶測(cè)定試劑盒、Na+/K+-ATP酶測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；皮質(zhì)醇測(cè)定試劑盒 武漢純度生物試劑盒；其他所有試劑均為分析純上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。丁香酚母液由丁香酚與無(wú)水乙醇按質(zhì)量比1∶9配制而成，備用。

自來(lái)水經(jīng)日光暴曬通氧曝氣2 d后用于實(shí)驗(yàn)。水溫14～16 ℃、溶氧量6～8 mg/L、pH 6～7。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT型高效液相色譜儀日本島津公司；LRH-250CL低溫生化培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器公司；3k15高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Sigma公司；FD5-Serious真空冷凍干燥機(jī)美國(guó)GOLD SIM儀器公司；SPARK酶標(biāo)儀瑞士TECAN儀器公司；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器公司；多功能pH計(jì)上海哈西分析儀器有限公司；Direct-Q?5UV超純水美國(guó)Millipore公司；TA.XT Plus物性測(cè)試儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；NMI20-025V-1核磁共振成像分析儀上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 麻醉溫度的確定

取健康加州鱸45 條，隨機(jī)分為3 組，每組15 條魚，分別置于3 個(gè)體積為60 L（50 cm×30 cm×40 cm）含30 L曝氣自來(lái)水的魚缸，溫度提前分別降低至10、15、25 ℃，開水空調(diào)控溫，暫養(yǎng)2 d，關(guān)閉魚缸水循環(huán)，加入一定量的丁香酚母液，使魚缸中丁香酚的質(zhì)量濃度為30 mg/L，在通氧量為7 mg/L條件下進(jìn)行麻醉，觀察并記錄加州鱸從開始麻醉到有緩慢且不規(guī)律的鰓呼吸頻率的時(shí)間[9]，記作入麻時(shí)間。直接撈出置于清水中進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇至可以正常游動(dòng)，且鰓呼吸頻率正常，記作清水中復(fù)蘇時(shí)間。

1.3.2 麻醉劑質(zhì)量濃度的確定

配制系列質(zhì)量濃度的丁香酚溶液（20、25、30、35、40 mg/L），將實(shí)驗(yàn)魚（每組15 條）放入不同質(zhì)量濃度的15 ℃丁香酚溶液中，開始計(jì)時(shí)，記錄入麻時(shí)間；進(jìn)入麻醉期后，繼續(xù)麻醉5 min至深度麻醉狀態(tài)[10]（對(duì)外界刺激無(wú)反應(yīng)、魚體漂?。?，撈出放入?；畛溲醮?，充入足量氧（保活袋沒有凹陷為止），置于生化培養(yǎng)箱中，設(shè)定溫度為3 ℃，模擬無(wú)水?；钸\(yùn)輸，保活10 h后，魚樣直接放入（16±2）℃曝氣的清水中復(fù)蘇，并記錄復(fù)蘇率，復(fù)蘇率為保活運(yùn)輸結(jié)束后于清水中復(fù)蘇30 min后可以正常游動(dòng)的魚數(shù)量與?；钸^(guò)程魚總數(shù)量的比值。

1.3.3 ?；顪囟鹊拇_定

確定較佳丁香酚麻醉質(zhì)量濃度后，將實(shí)驗(yàn)魚放入較佳質(zhì)量濃度麻醉劑中，進(jìn)行麻醉，當(dāng)魚進(jìn)入麻醉期后繼續(xù)麻醉5 min，將魚放進(jìn)?；畲?，充氧，此時(shí)設(shè)定不同保活溫度（1、3、5、7 ℃）進(jìn)行?；睿?0 h后進(jìn)行復(fù)蘇，觀察每組魚的復(fù)蘇情況，記錄復(fù)蘇率（實(shí)驗(yàn)中每組15 條魚）并取鰓組織測(cè)定鰓Na+/K+-ATP酶活力。

1.3.4 ?；顣r(shí)間的確定

1.3.4.1 樣品處理

實(shí)驗(yàn)組共分為4 個(gè)小組，每組樣品40 條，實(shí)驗(yàn)總樣品量為160 條。每組將40 條健康加州鱸魚放入15 ℃含30 mg/L丁香酚的藥液中，待其完全進(jìn)入麻醉狀態(tài)后繼續(xù)麻醉5 min，取出放入充氧袋中，每袋裝入3 條魚，封口充入純氧，置于3 ℃培養(yǎng)箱中?；?，分別保活10、13、16、19 h后，每個(gè)測(cè)試時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取5 條魚進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，隨機(jī)取20 條魚置于曝氣通氧的清水中進(jìn)行復(fù)蘇，觀察復(fù)蘇情況和暫養(yǎng)7 d后加州鱸的存活情況（存活率為復(fù)蘇暫養(yǎng)7 d后存活魚數(shù)量與清水中總復(fù)蘇魚數(shù)量的比值），均以養(yǎng)殖池中加州鱸為對(duì)照組。取背部肌肉于-40 ℃冷凍備用。

1.3.4.2 生理生化指標(biāo)測(cè)定

樣品前處理：采用靜脈取血方式采取血樣，4 ℃冰箱靜置4 h，然后4 ℃、3 500 r/min離心10 min制備血清，血清移入-40 ℃保存?zhèn)溆?。取魚鰓于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%生理鹽水中勻漿，隨后4 ℃、3 500 r/min離心10 min離心取上清液，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取不同?；顣r(shí)間后的樣品，測(cè)定血清中的皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度和鰓Na+/K+-ATP酶活力。

取麻醉后、不同時(shí)間?；詈?、?；詈髲?fù)蘇不同時(shí)間（12、24 h和7 d）的魚樣，測(cè)定其血清中GOT活力、GPT活力、尿素氮濃度、肌酐濃度、白蛋白質(zhì)量濃度、溶菌酶質(zhì)量濃度、皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度均采用相關(guān)試劑盒測(cè)定，以上酶活力結(jié)果均以蛋白質(zhì)量計(jì)，總蛋白質(zhì)量濃度按試劑盒說(shuō)明測(cè)定。

1.3.4.3 肌肉相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

以未經(jīng)任何處理的新鮮鱸魚為對(duì)照，取不同?；顣r(shí)間后的鱸魚肌肉，測(cè)定肌肉水分狀態(tài)、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)；取麻醉后、不同時(shí)間保活后、保活后復(fù)蘇不同時(shí)間（12、24 h和7 d）的鱸魚肌肉，測(cè)定其質(zhì)構(gòu)特性。

水分狀態(tài)測(cè)定：鱸魚背部肌肉固定質(zhì)量為4.5 g（精確至0.001 g）。采用NMI20-025V-1核磁共振成像分析儀進(jìn)行水分分布測(cè)定，共振頻率為20 MHz，磁體溫度為32 ℃。T2測(cè)試參數(shù)：TW＝3 000 ms、TE＝0.3 ms、NECH＝5 000、NS＝8。使用核磁共振分析測(cè)量軟件及CPMG序列采集樣品信號(hào)，采用SIRT算法迭代100 000 次進(jìn)行反演（每個(gè)樣品平行測(cè)定6 次）。

蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：稱取凍干魚粉0.1 g（精確至0.001 g）后，參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[11]中的凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。

質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定： 鱸魚背部肌肉切成2.0 cm×2.0 cm×1.0 cm小塊，將魚樣置于TA.XT Plus物性測(cè)試儀上，探頭類型為P36/R，測(cè)試前探頭下降距離為25 mm，測(cè)試速率為1 mm/s，測(cè)試后探頭回程速率為5 mm/s，測(cè)試時(shí)接觸力為5 g，壓縮2 次，每組樣品做6 個(gè)平行。

1.3.5 代謝殘留規(guī)律測(cè)定

采用王彩霞等[12]的方法，測(cè)定不同階段魚肌肉和肝臟組織中丁香酚的殘留量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。顯著性分析采用Duncan多重比較法，P＜0.05表示顯著性差異，圖表的繪制采用Origin 9.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 加州鱸無(wú)水保活較佳條件的確定

2.1.1 麻醉溫度

圖 1 不同溫度丁香酚溶液對(duì)加州鱸的麻醉效果Fig. 1 Anesthetic effect of eugenol solution at different temperatures on Micropterus salmoides

在麻醉階段，麻醉溫度直接影響魚類入麻時(shí)間。如圖1所示，隨麻醉溫度降低，入麻時(shí)間和復(fù)蘇時(shí)間均延長(zhǎng)。Marking等[13]指出在魚類麻醉運(yùn)輸過(guò)程，大多數(shù)漁業(yè)工作者希望將魚在麻醉液中保存足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以有助于處理一定數(shù)量的魚。但是麻醉時(shí)間的延長(zhǎng)將直接導(dǎo)致魚復(fù)蘇時(shí)間延長(zhǎng)。為了保證一定的經(jīng)濟(jì)效益，采用快速誘導(dǎo)麻醉和快速?gòu)?fù)蘇是可取的，即麻醉時(shí)間和復(fù)蘇時(shí)間均控制在5～10 min是較為理想的麻醉標(biāo)準(zhǔn)。本研究在15 ℃進(jìn)行麻醉魚處理時(shí)，符合上述標(biāo)準(zhǔn)，即15 ℃為較佳的麻醉溫度。

2.1.2 麻醉劑質(zhì)量濃度

圖 2 不同質(zhì)量濃度丁香酚溶液對(duì)加州鱸麻醉效果及復(fù)蘇率的影響Fig. 2 Effect of different concentrations of eugenol on anaesthesia and recovery rate of Micropterus salmoides

丁香酚用于魚類麻醉時(shí)，其麻醉效果因魚的種類、大小、魚齡等不同存在差異[13-14]。為確定加州鱸較佳麻醉劑質(zhì)量濃度，于15 ℃水溫下進(jìn)行不同麻醉劑質(zhì)量濃度探究，麻醉后進(jìn)行?；顚?shí)驗(yàn)，后觀察復(fù)蘇率，結(jié)果如圖2所示。麻醉過(guò)程加州鱸進(jìn)入麻醉狀態(tài)的時(shí)間隨丁香酚質(zhì)量濃度增大而縮短，即丁香酚質(zhì)量濃度與加州鱸平均完全麻醉所需時(shí)間呈負(fù)相關(guān)性，經(jīng)10 h?；顚?shí)驗(yàn)后，魚在低質(zhì)量濃度麻醉劑長(zhǎng)時(shí)間麻醉狀態(tài)下復(fù)蘇率均達(dá)不到100%，在較高質(zhì)量濃度麻醉劑短時(shí)間麻醉狀態(tài)下復(fù)蘇率均可達(dá)100%。Marking等[13]指出在魚類麻醉運(yùn)輸過(guò)程，麻醉時(shí)間控制在5～10 min被認(rèn)為是較為理想的麻醉標(biāo)準(zhǔn)。楊移斌等[15]發(fā)現(xiàn)丁香酚的質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，復(fù)蘇率反而下降。因此本實(shí)驗(yàn)選擇30 mg/L為丁香酚較佳麻醉劑質(zhì)量濃度。

2.1.3 保活溫度

圖 3 不同?；顪囟葘?duì)魚鰓Na＋ /K＋-ATP酶活力及復(fù)蘇率的影響Fig. 3 Effect of temperature during waterless live transportation on gill Na+/K+-ATPase activity and recovery rate

溫度對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物鰓Na+/K+-ATPase活力的影響主要通過(guò)影響生物膜結(jié)構(gòu)，從而影響膜上Na+/K+-ATP酶構(gòu)象的轉(zhuǎn)變過(guò)程以及酶對(duì)反應(yīng)離子和底物的親和力，進(jìn)一步影響鰓Na+/K+-ATP酶對(duì)血淋巴滲透壓的調(diào)節(jié)功能[16]。在無(wú)水?；钸^(guò)程中，保活溫度的設(shè)定對(duì)魚的存活率起至關(guān)重要的作用，如圖3所示，在1～7 ℃之間，隨保活溫度的升高，鰓Na+/K+-ATP酶活力先升高后降低，3 ℃?；顣r(shí)Na+/K+-ATP酶活力最高，與對(duì)照組基本一致，這是因?yàn)闇囟忍蜁r(shí)鰓細(xì)胞膜的酶動(dòng)力活性降低，磷脂狀態(tài)改變導(dǎo)致膜完整性喪失，鰓的滲透調(diào)節(jié)和呼吸作用均不發(fā)揮作用[17]，溫度太高麻醉狀態(tài)的魚代謝較快，ATP消耗較快，在無(wú)水條件下，魚呼吸不暢，鰓Na+/K+-ATP酶活力會(huì)逐漸降低。在不同?；顪囟认拢~的復(fù)蘇率也是先升高后降低，3 ℃保活10 h復(fù)蘇率可達(dá)100%。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇3 ℃作為較佳?；顪囟取?/p>

2.1.4 不同?；顣r(shí)間后加州鱸的存活情況

如圖4所示，在無(wú)水?；钸^(guò)程中，?；顣r(shí)間越長(zhǎng)，復(fù)蘇率越低。當(dāng)?；?0、13 h時(shí)復(fù)蘇率為100%，之后隨著?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)蘇率越來(lái)越低，當(dāng)?；?9 h時(shí)，復(fù)蘇率僅為67%。這可能是因?yàn)殡S著?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)，麻醉效果減弱，魚會(huì)出現(xiàn)蘇醒跡象，對(duì)?；畛溲醮械难鯕庀脑龃?，魚體排出的氨氮不斷增多，魚長(zhǎng)期處于缺氧且無(wú)水的環(huán)境下，魚體器官會(huì)隨著氨氮含量增高而中毒損傷，時(shí)間較長(zhǎng)后，損傷不斷加大，保活過(guò)程中就會(huì)使一部分魚死亡。對(duì)于復(fù)蘇后暫養(yǎng)7 d后的魚樣，保活10、13、16 h的實(shí)驗(yàn)組存活率均為100%，而?；?9 h的實(shí)驗(yàn)組存活率也達(dá)到87%，這充分保證了運(yùn)輸后有充分銷售的時(shí)間，以保證一定的經(jīng)濟(jì)效益，證明利用丁香酚麻醉輔助活魚運(yùn)輸是一種可行的運(yùn)輸方式。

圖 4 不同?；顣r(shí)間后加州鱸的存活情況Fig. 4 Survival rate of Micropterus salmoides after different live transportation times

2.2 不同保活時(shí)間后加州鱸生化指標(biāo)變化

2.2.1 皮質(zhì)醇和鰓Na+/K+-ATP酶活力變化

圖 5 不同?；顣r(shí)間后加州鱸魚鰓Na＋ /K＋-ATP酶活力及皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度變化Fig. 5 Changes in gill Na+/K+-ATPase activity and cortisol content in Micropterus salmoides after different live transportation times

在無(wú)水?；钸^(guò)程中，不利生長(zhǎng)環(huán)境會(huì)使魚類受到不同程度的應(yīng)激，這些應(yīng)激反應(yīng)會(huì)引起魚體生理機(jī)能改變。如圖5所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)無(wú)水?；畹聂~樣血清中皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度均顯著升高（P＜0.05），同時(shí)隨著保活時(shí)間的延長(zhǎng)，皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度顯著升高，這表明加州鱸在無(wú)水?；钸^(guò)程中做出了應(yīng)激響應(yīng)，促使機(jī)體應(yīng)對(duì)不利環(huán)境。Mi Hongbo等[18]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)丁香酚麻醉無(wú)水保活的鯉魚，?；?8 h后鯉魚血清皮質(zhì)醇濃度較新鮮魚明顯升高，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

加州鱸屬淡水魚，其生活的水體環(huán)境滲透壓遠(yuǎn)低于自身體液滲透壓，鰓Na+/K+-ATP酶是離子主動(dòng)運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵酶[19]。如圖5所示，隨著無(wú)水保活時(shí)間的延長(zhǎng)，鰓呼吸功能減弱，鰓Na+/K+-ATP酶活力顯著降低，鰓細(xì)胞膜受損嚴(yán)重，無(wú)法維持正常的滲透壓調(diào)節(jié)，加州鱸經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間無(wú)水?；詈笾糜谇逅畯?fù)蘇的過(guò)程，鰓Na+/K+-ATP酶活力較低，無(wú)法實(shí)現(xiàn)Na+/K+主動(dòng)運(yùn)輸，使細(xì)胞吸水脹破，這可能也是隨?；顣r(shí)間延長(zhǎng)復(fù)蘇率下降的一個(gè)主要原因。

2.2.2 不同?；顣r(shí)間對(duì)加州鱸肝臟的影響

正常肝臟細(xì)胞中GOT和GPT主要分布在線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，血清中活力極低。鱸魚經(jīng)藥物麻醉后，肝臟細(xì)胞在發(fā)揮解毒功能時(shí)，麻醉劑會(huì)誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞受到損傷，肝臟細(xì)胞膜發(fā)生破裂，GOT和GPT滲透到血液中，使血液中的GOT和GPT活力升高，即判斷肝臟細(xì)胞是否受損需同時(shí)結(jié)合血清中GOT和GPT的活力，若兩者含量均顯著升高，則說(shuō)明肝臟細(xì)胞受到損傷。

圖 6 不同?；顣r(shí)間后加州鱸血清中GOT（A）與GPT（B）活力變化Fig. 6 Changes in glutamic oxaloacetic transaminase (A) and glutamic-pyruvic transaminase (B) activities in serum of Micropterus salmoides after different live transportation times

如圖6所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)無(wú)水?；詈蟮募又蓣|血清中GOT和GPT活力均顯著升高（P＜0.05），經(jīng)曝氣清水復(fù)蘇后的魚樣血清中兩種酶活力依然會(huì)繼續(xù)升高，復(fù)蘇24 h后會(huì)逐漸下降，復(fù)蘇7 d后會(huì)降低到正?；盍?；同時(shí)隨?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)，GOT和GPT活力均有所升高，這說(shuō)明經(jīng)無(wú)水?；詈蟮募又蓣|肝臟會(huì)有一定損傷，隨保活時(shí)間延長(zhǎng)損傷會(huì)有所加重，經(jīng)過(guò)一周時(shí)間的暫養(yǎng)其受損肝臟細(xì)胞可以得到一定修復(fù)，這與Velisek等[20]研究的結(jié)果一致，其還發(fā)現(xiàn)30 mg/L丁香油麻醉虹鱒魚運(yùn)輸24 h后不會(huì)對(duì)虹鱒魚的肝臟細(xì)胞造成不可逆的損傷。

2.2.3 不同?；顣r(shí)間對(duì)加州鱸腎臟的影響

尿素、肌酐、尿酸濃度是反映腎功能代謝情況的重要指標(biāo)，尿素是氮化合物代謝的產(chǎn)物，尿素也是維持血液滲透壓的主要成分[21]，當(dāng)腎臟細(xì)胞受到損傷時(shí)，腎功能排泄廢物的功能會(huì)有所下降，血液中的尿素氮和肌酐濃度會(huì)有所升高。

圖 7 不同?；顣r(shí)間后加州鱸魚血清中肌酐（A）和尿素氮（B）濃度變化Fig. 7 Changes in serum creatinine (A) and urea nitrogen (B) levels in Micropterus salmoides after different live transportation times

如圖7所示，與對(duì)照組相比，保活后加州鱸血清中肌酐和尿素氮濃度均顯著升高（P＜0.05），保活后經(jīng)清水復(fù)蘇后的魚樣，尿素氮會(huì)迅速降低至正常水平，而肌酐濃度則緩慢降低，恢復(fù)7 d后魚樣血清中的肌酐含量仍顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明經(jīng)過(guò)無(wú)水保活運(yùn)輸加州鱸腎臟會(huì)發(fā)生實(shí)質(zhì)性的損傷，這與白艷龍等[22]研究的生態(tài)冰溫?；铧S顙魚的結(jié)果一致。隨?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)，?；詈篝~樣血清中肌酐和尿素氮的濃度均顯著升高（P＜0.05），這可能也是隨?；顣r(shí)間延長(zhǎng)復(fù)蘇率下降的一個(gè)重要原因。

2.2.4 不同?；顣r(shí)間對(duì)加州鱸免疫的影響

圖 8 不同保活時(shí)間后加州鱸魚血清中白蛋白（A）和溶菌酶（B）質(zhì)量濃度變化Fig. 8 Changes in albumin (A) and lysozyme (B) contents in serum of Micropterus salmoides after different live transportation times

白蛋白是血漿的主要蛋白質(zhì)，在脊椎動(dòng)物中，白蛋白占總血漿蛋白含量的52%～60%，在運(yùn)輸內(nèi)源性配體和異生素中起重要作用[23]。當(dāng)進(jìn)行無(wú)水保活運(yùn)輸時(shí)，外界不利環(huán)境脅迫會(huì)導(dǎo)致魚體血清中的白蛋白濃度明顯下降[24-25]。如圖8A所示，與對(duì)照組相比，?；詈蟮聂~樣血清中白蛋白質(zhì)量濃度均顯著降低（P＜0.05），經(jīng)清水復(fù)蘇后的魚樣需經(jīng)過(guò)24 h才基本可恢復(fù)到正常水平；同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨?；顣r(shí)間延長(zhǎng)，?；詈蟮聂~樣血清中白蛋白質(zhì)量濃度會(huì)顯著下降（P＜0.05），保活較長(zhǎng)一段時(shí)間后，魚體的恢復(fù)能力有所降低，這可能是隨?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)，魚的生命力有所降低，各器官損傷較為嚴(yán)重，無(wú)法恢復(fù)到正常水平。溶菌酶是水生動(dòng)物血淋巴細(xì)胞酶系統(tǒng)中的重要組成部分，廣泛存在于魚體的黏液、血清和某些淋巴組織中，其質(zhì)量濃度是衡量機(jī)體非特異性免疫狀態(tài)的指標(biāo)之一。如圖8B所示，保活后血清中溶菌酶的質(zhì)量濃度與對(duì)照組相比均顯著下降（P＜0.05），保活16 h的魚樣經(jīng)過(guò)24 h可恢復(fù)到正常水平，而保活19 h后的魚樣經(jīng)過(guò)7 d暫養(yǎng)有所恢復(fù)，其值仍然顯著低于正常水平；同時(shí)可發(fā)現(xiàn)隨保活時(shí)間延長(zhǎng)，血清中溶菌酶質(zhì)量濃度顯著降低，此結(jié)果與張玉晗等[26]研究保護(hù)液結(jié)合暫養(yǎng)工藝對(duì)花鱸無(wú)水活運(yùn)效果的影響中溶菌酶變化一致，這可能是低溫長(zhǎng)時(shí)間脅迫運(yùn)輸導(dǎo)致魚非特異性免疫系統(tǒng)遭到破壞，特異性免疫功能有所下降且無(wú)法恢復(fù)正常。

2.3 不同?；顣r(shí)間對(duì)加州鱸肌肉品質(zhì)的影響

2.3.1 不同保活時(shí)間加州鱸肌肉水分相對(duì)含量變化

圖 9 對(duì)照組加州鱸肌肉水分橫向弛豫時(shí)間分布Fig. 9 Transverse relaxation time distribution of Micropterus salmoides in the control group

如圖9所示，加州鱸肌肉橫向弛豫時(shí)間T2圖出現(xiàn)3 個(gè)峰，T21代表與大分子如蛋白質(zhì)、碳水化合物等緊密結(jié)合的結(jié)合水；T22代表肌纖維與膜之間不易流動(dòng)水；T23代表滯化水、細(xì)胞外間隙毛細(xì)管水等能自由流動(dòng)的水。不同T2區(qū)間的積分面積占總積分面積的比例可以表示各個(gè)區(qū)間氫質(zhì)子的相對(duì)含量。由表1可知，隨?；顣r(shí)間延長(zhǎng)，鱸魚肌肉中A總無(wú)顯著變化（P＞0.05），P21逐漸降低，P22呈升高趨勢(shì)，P23也有所降低，這可能是因?yàn)樵跓o(wú)水保活過(guò)程，加州鱸為了維持自身生命活動(dòng)，需要消耗體內(nèi)碳水化合物、蛋白質(zhì)等能量物質(zhì)來(lái)供能，此時(shí)與碳水化合物、蛋白質(zhì)等結(jié)合的水分就會(huì)游離出來(lái)；同時(shí)，在無(wú)水?；钸^(guò)程中，魚處于不利環(huán)境，體內(nèi)一部分細(xì)胞受損，造成細(xì)胞膜通透性變大進(jìn)而引起肌絲空間膨脹，吸水性增強(qiáng)，結(jié)合水轉(zhuǎn)換成不易流動(dòng)水，造成肉質(zhì)疏松口感變差，這與李春等[27]的研究結(jié)果相似。

表 1 加州鱸肌肉不同?；顣r(shí)間的弛豫特征中不同狀態(tài)水分相對(duì)含量的變化Table 1 Changes in relative moisture contents at different states in the relaxation characteristics of Micropterus salmoides after different live transportation times

2.3.2 不同?；顣r(shí)間后魚體內(nèi)總蛋白的變化

表 2 不同保活時(shí)間魚體內(nèi)總蛋白的變化Table 2 Changes in crude protein content in Micropterus salmoides after different live transportation times

由表2可知，無(wú)水?；钸^(guò)程魚體內(nèi)總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)發(fā)生變化。與對(duì)照組相比，加州鱸經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間無(wú)水?；钐幚?，其肌肉組織中總蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低，隨?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)，總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低，且降低速率加快，這可能是因?yàn)樵跓o(wú)水?；钸^(guò)程，?；钶^短時(shí)間時(shí)魚處于深度麻醉狀態(tài)，呼吸代謝頻率較弱，體內(nèi)氨基酸等能量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗相對(duì)較少，當(dāng)?；钶^長(zhǎng)時(shí)間后魚在?；詈笃谟刑K醒現(xiàn)象，魚體氧化應(yīng)激加強(qiáng)，肌原纖維蛋白可能被氧化；同時(shí)，?；顣r(shí)間延長(zhǎng)會(huì)使魚體內(nèi)氨基酸、蛋白質(zhì)消耗相對(duì)增多，導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)間無(wú)水保活后魚體內(nèi)總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所降低。

2.3.3 不同?；顣r(shí)間后加州鱸質(zhì)構(gòu)特性的變化情況

表 3 不同保活時(shí)間加州鱸背部組織質(zhì)構(gòu)特性的變化（n＝6）Table 3 Changes in texture properties of fish back tissue with different live transportation times (n= 6)

食品質(zhì)構(gòu)特性是衡量其食用品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，活魚處于不利環(huán)境發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)后，導(dǎo)致肉質(zhì)變差，這會(huì)直接影響魚的食用價(jià)值。由表3可知，在保活及復(fù)蘇過(guò)程，魚肉的硬度、黏附性、膠黏性及咀嚼性均會(huì)發(fā)生顯著變化（P＜0.05），其他指標(biāo)變化不顯著（P＞0.05）。其中，無(wú)水?；詈篝~肉的硬度、膠黏性、咀嚼性會(huì)顯著減小（P＜0.05），而黏附性會(huì)顯著增大（P＜0.05），這些變化對(duì)魚肉的品質(zhì)來(lái)說(shuō)是不利的，造成魚肉口感下降。同時(shí)可以看出，經(jīng)過(guò)短時(shí)間?；詈蟮聂~樣復(fù)蘇后，質(zhì)構(gòu)品質(zhì)變化明顯的指標(biāo)較易恢復(fù)到正常水平；而隨?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)蘇后的魚樣恢復(fù)能力下降，?；?9 h的魚樣要經(jīng)過(guò)48 h的恢復(fù)，變化顯著的指標(biāo)會(huì)有所恢復(fù)，這說(shuō)明經(jīng)過(guò)無(wú)水?；詈蟮聂~樣，需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的暫養(yǎng)方可恢復(fù)正常品質(zhì)。

2.4 不同?；顣r(shí)間后加州鱸體內(nèi)丁香酚在肌肉和肝臟組織中的代謝殘留規(guī)律

如圖10所示，保活階段，?；顣r(shí)間越長(zhǎng)，丁香酚在魚肌肉和肝臟中含量整體越高。同一時(shí)間段內(nèi)魚肝臟中的含量是肌肉中的1～3 倍，且經(jīng)過(guò)無(wú)水保活后丁香酚會(huì)在魚肝臟中富集，這可能是因?yàn)楦闻K屬于解毒器官，其他部位的丁香酚會(huì)聚集到肝臟中統(tǒng)一代謝，最終復(fù)蘇48 h后完全代謝；肌肉中的丁香酚經(jīng)過(guò)保活后含量會(huì)有所降低，經(jīng)過(guò)48 h可代謝到日本規(guī)定的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)（0.05 mg/kg）[26]，經(jīng)暫養(yǎng)7 d可完全代謝，這個(gè)結(jié)果與朱敏[28]的研究結(jié)果一致。因此建議丁香酚麻醉后的魚在上市銷售之前需要經(jīng)過(guò)暫養(yǎng)至少2 d，以保證消費(fèi)者的食用安全。

圖 10 丁香酚在加州鱸肝臟（A）和肌肉（B）中的消除情況（n＝ 3）Fig. 10 Elimination of eugenol in the liver (A) and muscle (B) of Micropterus salmoides during resuscitation (n = 3)

3 結(jié) 論

利用丁香酚麻醉加州鱸進(jìn)行無(wú)水?；钛芯?，通過(guò)探究丁香酚質(zhì)量濃度、麻醉溫度、保活溫度，確定于15 ℃、30 mg/L丁香酚溶液中將魚麻醉至深度麻醉狀態(tài)，包裝充純氧后置于3 ℃的生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行?；?，?；?0～13 h復(fù)蘇率可達(dá)100%，保活16～19 h復(fù)蘇率達(dá)67%以上，?；詈髲?fù)蘇的魚樣再轉(zhuǎn)入當(dāng)季暫養(yǎng)水溫中（（16±2）℃）恢復(fù)7 d后存活率可達(dá)87%以上。

與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)無(wú)水?；畹聂~樣血清中皮質(zhì)醇、GOT、GPT、肌酐、尿素氮水平均顯著升高（P＜0.05），鰓Na+/K+ATP活力和血清中白蛋白、溶菌酶水平隨?；顣r(shí)間延長(zhǎng)顯著降低（P＜0.05），這些血液指標(biāo)經(jīng)過(guò)復(fù)蘇暫養(yǎng)一段時(shí)間后基本可以恢復(fù)到正常水平；測(cè)定不同保活時(shí)間的肌肉品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)隨?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)合水會(huì)轉(zhuǎn)化成不易流動(dòng)水，造成肉質(zhì)疏松品質(zhì)變差，質(zhì)構(gòu)結(jié)果與之類似，但經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的暫養(yǎng)可恢復(fù)到正常水平；通過(guò)藥浴的方式丁香酚會(huì)富集到加州鱸體內(nèi)，但是加州鱸肌肉和肝臟對(duì)丁香酚的富集和代謝消除能力不同，肌肉組織經(jīng)過(guò)2 d后會(huì)代謝到日本規(guī)定的殘留限量標(biāo)準(zhǔn) （0.05 mg/kg）以下。