測量不確定度在食品檢驗中的應用及進展

翟洪穩(wěn)，范素芳，王 娟，曹梅榮，馬俊美，任曉偉，李 強，張 巖

（河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050091）

食品檢驗是保障食品安全的有效途徑。一直以來，食品安全受到高度重視，對檢測結果的精確度要求越來越高[1-2]。隨著食品檢驗領域的不斷發(fā)展，檢測技術水平逐步提升，食品檢測精確度大幅提高。但是食品檢驗工作需要復雜的測量程序，實驗過程中會受到諸多不確定因素的影響，使得檢測結果與真值之間出現(xiàn)一定的誤差[3-5]。為了更加客觀公正地表示分析結果，需要引入測量不確定度，以下簡稱不確定度。不確定度的定義為：表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結果相聯(lián)系的參數(shù)[6-7]。不確定度的數(shù)值可以直接體現(xiàn)檢測質量的高低，影響檢測結果的可靠性。尤其是在實際工作中，當測量值出現(xiàn)在限定值附近時，為確保數(shù)據(jù)的可信度，對檢測結果進行不確定度評價是不可或缺的。一份完整的定量分析結果應該由被測量值和被測量值分散性的值（即不確定度）組成，這既可增加檢測方法和結果的可信度，又便于不同實驗室分析結果進行對比，因此，食品檢測工作離不開對不確定度的評定[8-9]。食品檢驗人員必須合理地評定不確定度，確保檢測結果的權威與公正，從而更好地保障食品安全與質量。

1 食品檢驗中的不確定度

不確定度能夠為檢測結果提供更加科學的保障，正逐步被應用到食品安全檢測領域。近年來，分析檢測實驗室及研究人員高度重視不確定度評定，針對食品檢驗中的不確定度進行了深入分析。

1.1 食品化學分析檢測中的不確定度

化學分析檢測是食品檢測的重要手段，主要利用高效液相/氣相色譜法、高效液相/氣相色譜串聯(lián)質譜法、紫外掃描分光光度法及電感耦合等離子體質譜法，對食品中營養(yǎng)物質、重金屬、非法添加等進行準確定量。

在實際食品檢測中，高效液相色譜串聯(lián)質譜法對于痕量殘留分析有較為廣泛的應用，其不確定度也得到許多研究人員的關注。利用超高效液相色譜串聯(lián)質譜法，劉柱等分析了水產(chǎn)品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝物殘留量的不確定度[10]；李靜等測定了豆芽中植物生長調節(jié)劑殘留量的不確定度[11]；劉海山等分析了水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的不確定度[12]；華蕾等測定了雞肉中烏洛托品殘留量的不確定度[13]，其均依據(jù)其特定檢測方法建立了相應的數(shù)學模型，并對不確定度分量標準物質（包括標準物質的純度、標準溶液的配制以及標準曲線的擬合）、樣品處理過程（包括樣品稱量、提取）、重復性測定進行深入分析和量化，最終得出標準曲線擬合和溶液配制過程會產(chǎn)生較大不確定度的結論。黃偉蓉等對雞蛋中氯霉素殘留量的不確定度進行評定[14]；李菊穎等對大米中多菌靈殘留量的不確定度進行分析[15]；徐幸等在評估米線中烏洛托品的不確定度時[16]，進一步分析了由于測定儀器以及溫度變化導致的不確定度，但是缺少對于重復性測定的研究。研究人員對其他檢測手段的不確定度也進行了大量研究，如劉紫譞等利用火焰原子吸收光譜法測定嬰兒配方奶粉中鉀含量[17]；馬珊珊等采用電感耦合等離子體質譜法測定蟹味菇中鉛含量[18]。結果表明，標準曲線擬合及重復性測定均為不確定度的主要來源；因此，在操作過程中選擇適宜的質量濃度配制溶液，對樣品進行多次重復測定均可以使測定結果更準確。

1.2 食品微生物法檢測中的不確定度

微生物檢測已經(jīng)成為重要的食品安全評價指標，目前在食品安全國家標準中，微生物法檢測占很大的比例。與化學測量相比，微生物測量有其特殊性，如A類標準不確定度（重復測定）影響較大，但其不確定度來源與化學分析相同，主要來自稱量、校準以及環(huán)境因素的影響。

食品中菌落總數(shù)反映了食品被細菌污染的程度，菌落總數(shù)測定是判定其是否符合衛(wèi)生學要求的依據(jù)。袁平等建立了測定食品中菌落總數(shù)不確定度評定的數(shù)學模型，充分考慮不同情況下菌落總數(shù)的分析結果并且創(chuàng)新性地引入重復性因子與稀釋因子[19]。劉荔等對膨化食品中菌落總數(shù)的不確定度分量進行計算后得到合成不確定度，分析發(fā)現(xiàn)影響不確定度的主要因素是樣品重復性測定[20]。修宏宇對橙汁中菌落總數(shù)檢測結果進行不確定度分析，指出直接利用GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》中菌落總數(shù)的計算公式進行分析會導致不確定度分量的漏算[21]。在實際分析中，標準中的計算公式往往是一個簡化公式，計算時不可忽略稀釋因子對不確定度的影響。微生物法除了測定食品菌落總數(shù)等指標外，也可用于食品中營養(yǎng)元素的測定。商迎輝等分析了微生物法測定嬰幼兒配方食品中生物素的不確定度[22]；張施敬等分析了微生物法測定乳粉中泛酸質量分數(shù)的不確定度，發(fā)現(xiàn)微生物因素均為不確定度的主要來源，微生物培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性對降低不確定度非常重要[23]。

2 不確定度分類及評定步驟

2.1 不確定度分類

不確定度分為標準不確定度和擴展不確定度。標準不確定度包括3 類：1）A類標準不確定度。即利用統(tǒng)計方法對多次測量的結果進行計算后得到的不確定度，如重復性測定引入的不確定度。2）B類標準不確定度。即通過非統(tǒng)計方法得到的不確定度，如移取溶液過程中由移液槍引入的不確定度、稱量樣品過程中由天平引入的不確定度。3）合成標準不確定度。即當檢測結果利用若干其他值計算得到時，由其方差和協(xié)方差計算出的不確定度[24-28]。測量誤差與不確定度是極易混淆的兩個概念：測量誤差是檢測結果與實際值之間的差值，是一個數(shù)值，可能為正值，也可能為負值；不確定度代表檢測結果的分散性，是一個數(shù)值區(qū)間，實際值則在這個分散區(qū)間內，需要建立相應的數(shù)學模型，并通過數(shù)學公式進行分析，且不確定度的數(shù)值均為正值[24-26,29]。不確定度的大小并不會對誤差產(chǎn)生影響，不確定度評定相較于測量誤差更加科學可信。

2.2 食品檢驗中不確定度的評定步驟

食品檢驗中不確定度的評定步驟主要分為6 個部分（圖1）：1）明確食品中所需檢測項目的實驗原理和測定方法；2）根據(jù)實驗原理和檢測過程建立合理的數(shù)學模型；3）根據(jù)測定方法和數(shù)學模型找出不確定度來源；4）根據(jù)不確定度來源計算每一個標準不確定度分量，最終得出合成不確定度；5）確定包含因子，計算擴展不確定度；6）出具不確定度報告[30-34]。

圖 1 食品檢驗中不確定度評定步驟Fig. 1 Flow chart for measurement uncertainty evaluation in food inspection

3 食品檢驗中不確定度的來源

食品檢測（包括化學分析檢測與微生物法檢測）中使用的標準物質、儀器設備、環(huán)境變化等是影響檢測結果的關鍵因素，在考察方法不確定度時應重點考察；微生物法檢測還需要著重關注重復測定產(chǎn)生的不確定度。

3.1 標準物質引入的不確定度

食品檢驗定性定量分析均需要標準物質作為參照物，因此，標準物質數(shù)值是否準確會對分析檢測結果產(chǎn)生很大影響。

3.1.1 標準物質純度引入的不確定度

參照標準物質證書，假定標準物質純度為P，其引入的不確定度為B類標準不確定度，按照均勻分布計算，純度P引入的不確定度為相對不確定度為[35-36]。舒平等對氣相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用法測定核桃油中酚類抗氧化劑的不確定度進行評估，結果表明標準物質的純度為影響不確定度的主要因素之一，在實際檢測中應盡量選擇純度較高的標準物質[34]。景贊等分析了氣相色譜法測定甜面醬中脫氫乙酸的不確定度，發(fā)現(xiàn)不確定度主要來源包括標準物質純度，應針對其不同性質選擇購買質量穩(wěn)定的標準物質[37]。

3.1.2 繪制標準工作曲線引入的不確定度

對檢測結果進行定量時，需要繪制標準工作曲線，通常利用最小二乘法擬合校準曲線。假定擬合線性方程為：A＝aC+b，由標準曲線擬合引入的不確定度為；相對不確定度為式中：a為標準曲線的斜率；b為標準曲線的截距；為樣品的平均濃度；為標準溶液的平均濃度；n為標準曲線的測定次數(shù)；N為樣品的測定次數(shù)；Si為標準曲線的標準偏差；Ci為測定樣品的濃度；Ai為測定樣品的峰面積。

洪澤淳等分析了氣相色譜法測定蔬菜中16 種有機磷農(nóng)藥殘留量的不確定度，發(fā)現(xiàn)標準曲線擬合導致較大的不確定度，選擇合適的標準溶液濃度制作標準曲線能夠有效地降低曲線擬合引入的不確定度[38]。杜晶晶等對高效液相色譜法測定嬰幼兒食品和乳品中泛酸的不確定度進行評定[39]以及李珊等對超高效液相色譜法測定配制酒中糖精鈉的不確定度進行分析[40]均指出建立標準曲線會引入較大的不確定度，因此，在確保樣品定量準確度的情況下，可適量減少標準溶液的梯度濃度數(shù)量以降低不確定度，一般選擇3～5 個濃度的標準溶液進行標準曲線擬合。衛(wèi)星華等測定火鍋食品中5 種罌粟殼生物堿的不確定度，通過對由標準曲線引入的不確定度進行分析，發(fā)現(xiàn)采用內標法測定可以降低不同樣品基質引入的不確定度[41]。

3.2 儀器使用引入的不確定度

食品檢測過程中會使用到許多定量儀器（如測定儀器（高效液相色譜儀、紫外掃描分光光度計、酶標儀等）和移取儀器（移液器、移液槍等）），而儀器的性能、精度等均會對分析結果產(chǎn)生很大影響。

3.2.1 測定儀器引入的不確定度

測量儀器經(jīng)過校準檢定后，計量機構出具校準證書，假定不確定度為Q，屬于B類標準不確定度。按照均勻分布計算，其相對不確定度為陳均正利用高效液相色譜串聯(lián)質譜法測定動物源性食品中氯霉素，并對其不確定度進行分析，結果顯示儀器測量產(chǎn)生的不確定度在合成不確定度中占很大比例[42]。因此，嚴格做好儀器的定期校準和檢定、加強儀器維護，是降低不確定度的有效手段。

3.2.2 稱量、容量儀器引入的不確定度

食品檢測過程包括稱量、稀釋、定容等操作步驟，需要用到電子天平和容量瓶、移液器等玻璃量具，這些器具的使用是不確定度的主要來源之一，屬于B類標準不確定度。

稱量標準物質通常使用萬分之一天平，精確到0.1 mg，天平的最大允許誤差為δ。按照矩形分布計算，標準物質稱量過程引入的不確定度為相對不確定度為[43-44]。式中：m（標）為標準物質的質量。

參考JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》和JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》規(guī)定的最大允許誤差δ[45-46]。通過矩形分布計算，標準物質稀釋過程引入的不確定度式中：V（標）為標準物質的定容體積。劉佳等對氣相色譜-三重四極桿質譜法測定蔬菜中氟蟲腈殘留量的方法進行不確定度評估，得出不確定度主要來自于標準物質的配制以及樣品的稀釋[47]。內標物移取體積小，對移液器的精度要求更高，而且移取的有機溶劑易揮發(fā)，可采用活塞式移液器或帶濾芯的移液器槍頭進一步降低檢測結果不確定度。熊娟等對微生物法測定玉米粉中VB6的不確定度進行評估，測定結果顯示最主要不確定分量為微量移液槍容積偏差，所以需盡量減少微量溶液的移取偏差，且注意移液槍的定期維護與校準[48]。鄧豐研究了降血糖類保健食品中二甲雙胍含量的不確定度，發(fā)現(xiàn)配制標準溶液時，稀釋步驟和所用的量具越多不確定度越大，因此，應選用精度較高的玻璃量具，并通過減少溶液稀釋步驟來降低測量過程的不確定度[49]。

3.3 環(huán)境變化引入的不確定度

實驗室溫度在一定范圍內正常波動，定容時容量瓶等玻璃容器及溶劑溫度與校準時溫度通常不一致。容量瓶等玻璃容器的體積變化可忽略不計，但溶劑體積的膨脹會引入不確定度，屬于B類標準不確定度。假定實驗室溫度變化為ΔT/℃，溶劑的體積膨脹系數(shù)為α，按照均勻分布計算，溫度變化引入的不確定度為李雪等對食用油中苯并芘含量測定進行不確定度評定，分析得出溶液配制過程中環(huán)境溫度的變化會導致溶液體積膨脹，從而引入較大的不確定度，因此，測定過程中需特別注意環(huán)境溫度的影響[50]。

3.4 其他因素引入的不確定度

3.4.1 重復性測定引入的不確定度

食品檢測過程中會受到許多隨機因素的影響，如檢測設備的穩(wěn)定性、操作人員的熟練程度等，因此需要多次重復測量。由重復性測定引入的不確定度屬于A類標準不確定度，應用貝塞爾公式計算不確定度為，相對不確定度為式中：n為樣品的測定次數(shù)。寧霄等對采用超高效液相色譜串聯(lián)質譜法測定豬肉中3 種β-受體激動劑殘留量的不確定度進行分析，結果表明重復測定會引入較大的不確定度[52]。趙晶晶等對超高效液相色譜法測定玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量進行了不確定度評定，同樣指出重復性測定會對不確定度產(chǎn)生很大影響[53]。在實際檢測中，可通過增加標準溶液測定次數(shù)，增加平行樣品測定次數(shù)來減少不確定度。李丹琪等分析了發(fā)酵乳中乳酸菌總數(shù)的不確定度，但其忽略了B類標準不確定度的來源，只討論了重復性測定帶來的A類標準不確定度[54]，同時指出乳酸菌計數(shù)達到108，且數(shù)據(jù)的發(fā)散性大，不適于直接用貝塞爾公式計算，需取對數(shù)后進行不確定度計算。

樣品制備均勻性也是影響測定重復性的關鍵因素之一，應根據(jù)樣品實際情況充分考慮樣品非均勻性引入的不確定度。Forte等測定豬牛羊內臟樣品中的有毒重金屬，認為不確定度主要由樣品非均勻性導致，需根據(jù)不同樣品的屬性制定適合的樣品制備方法，保證測試樣品均勻的前提下，通過重復測定來確認結果的準確性[55]。毛永楊等對牛肝菌中無機汞、甲基汞、乙基汞測定過程中引入的不確定度進行評定，由于不同生長時期和不同組織部位對汞的富集能力不同，樣品非均勻性會產(chǎn)生較大的不確定度分量[56]。邵亮亮等對高效液相色譜法測定小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的不確定度進行評定，由于小麥不同籽粒不同部位感染程度不同，需分析樣品非均勻性對不確定度的影響[57]。在實驗中需要通過充分混勻樣品，加大樣品的制樣量來降低不確定度，以保障分析結果的可靠性。

3.4.2 回收率引入的不確定度

為確保檢測結果的準確性和可靠性，需要考慮樣品提取過程中的回收率。按A類標準不確定度應用貝塞爾公式計算，回收率引入的不確定度為式中：SR為標準偏差；n為測定次數(shù)。相對不確定度為為平均回收率。劉付英等對液相色譜-原子熒光聯(lián)用法測定糧食中無機砷含量的不確定度進行分析[58]；潘城等對高效液相色譜法測定蔬菜中異菌脲殘留量的不確定度進行分析[59]；侯美玲等對超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定蜂蜜中諾氟沙星殘留量的不確定度進行分析[60]，均發(fā)現(xiàn)樣品回收率是產(chǎn)生不確定度的主要因素之一，因此，在測定過程中需不斷優(yōu)化分析檢測方法，包括前處理過程與儀器方法等，盡量降低由回收率引入的不確定度。

4 不確定度評定在食品檢驗中的應用

不確定度評定在檢測結果合格性判定、實驗室質量控制、認證及新方法開發(fā)中均有重要應用。

4.1 運用不確定度對食品檢測結果進行合格性判定

食品檢測過程中，通常需要對檢測結果是否符合國家標準規(guī)定進行判定。當食品中分析物含量接近國家標準中規(guī)定的限量時，就需要借助不確定度對檢驗結果進行符合性判定。

如圖2所示，不確定度為U，規(guī)定上限為TL，規(guī)定下限為TU，上下限區(qū)間為T（即T＝TL-TU）；當不確定度與上下限一半（T/2）之比小于或等于1∶3時，可以忽略不確定度進行符合性判定。此時，區(qū)間（TL-U，TU+U）占區(qū)間T的66.7%。假定檢測結果X為正態(tài)分布，則X落在區(qū)間（TL，TU）內概率約為72%，即誤判風險為28%；若按X落在區(qū)間（TL-U，TU+U）判定為合格，那么合格概率等于擴展不確定度U的置信水平，誤判風險小于5%。

圖 2 不確定度和限量區(qū)間關系示意圖[61]Fig. 2 Schematic diagram of the relationship between uncertainty and limited range[61]

對食品檢驗機構來說，在以下情況中需要給出不確定度報告：一是當委托方提出特殊要求時，檢驗結果中提供不確定度報告；二是檢驗結果在限量值附近時，結果中應附有不確定度報告。在國家法規(guī)或標準中要求檢測報告進行合格性判定，但沒有明確是否考慮不確定度影響時，這種情況下承檢機構可能對判定結果承擔風險。

在食品檢測結果進行合格性判定時，考慮到不確定度影響會出現(xiàn)5 種不同情況（圖3）[62-64]：1）檢測結果及其不確定度全部落在標準規(guī)定限量之間（①②），則被判定結果為合格；2）檢測結果及其不確定度全部落在標準規(guī)定限量之外（⑨⑩），則被判定結果為不合格；3）檢測結果在標準規(guī)定限量之內（③④）（接近于標準規(guī)定的上限或者下限），但是不確定度區(qū)間的一部分超出標準規(guī)定的限量，這表明食品中該測量項目的合格概率大于不合格概率；4）測量結果不在標準規(guī)定限量之內（⑦⑧）（接近標準規(guī)定的上限或者下限），但是不確定度區(qū)間的一部分在規(guī)定限量之內，這種情況表明該檢測項目的不合格概率大于合格概率；5）測量結果剛好等于標準規(guī)定的上限或者下限（⑤⑥），不確定區(qū)間一半在限量之內一半在限量之外，這表明該檢測項目合格概率等于不合格概率。后面3 種情形下，均需進行重復測定，在給出判定結果時，必須充分考慮不確定度的各個來源對測量結果的影響[62-64]。對于單側限檢測，即限量值應不得大于規(guī)定上限或者不得小于規(guī)定下限，也分為以上5 種情況。

圖 3 食品檢測中符合性判定的5 種情況Fig. 3 Five cases of conformity assessment in food inspection

4.2 不確定度是實驗室質量控制的需要

不確定度在評價測量結果的準確性和可信性、實驗室質量控制、實驗室風險控制等方面均有非常重要的指導作用。一份包含不確定度的檢測報告，可以更加準確的對檢測結果進行判定。充分分析不確定度的來源，可以有效降低實驗過程中風險因素的影響，提高分析結果質量，保證測量結果的準確性[65-66]。Yenisoy-Karaka?等采用高分辨電感耦合等離子體質譜法測定番茄醬中的重金屬含量，通過分析其不確定度主要來源對該方法進行驗證，保證了方法的可靠性[67]。張言等按照GB 5009.185—2016《食品安全國家標準 食品中展青霉素的測定》測定果汁中展青霉素含量的同時對不確定度進行量化和合成，得出不確定度主要由溶液配制及標準曲線擬合產(chǎn)生，這為實驗室檢測展青霉素類似毒素的質量控制提供了思路[68]。

4.3 不確定度是實驗室認證的需要

針對同一檢測項目有多種食品檢測方法，標準來源不一致，不同實驗室間的檢測結果比對受到限制，因此尋找統(tǒng)一、科學的標準越來越受到關注。實驗室認證是指國家權威機構對實驗室有能力進行指定類型的校準和檢測所做的一種正式承認。只有獲得認證的實驗室出具的檢測報告，才可以得到其他實驗室的認可。通過認證的實驗室有能力對出具的測量結果提供不確定度評定，提高了測量結果的可靠性、可比性及可接受性[69-71]。此外，實驗室認證規(guī)則明確要求授權簽字人具備分析測量結果不確定度的能力。

4.4 不確定度是開發(fā)新檢測方法的需要

食品檢測領域需要不斷優(yōu)化檢測方法，使其準確性更高、操作性更便捷。而不確定度與特定的檢測方法有關，不同的檢測方法，其不確定度來源不同，需要建立特定的數(shù)學模型進行分析。因此，在開發(fā)新檢測方法時，不確定度是必須評定步驟。一方面，不確定度測定不但可以掌握其來源，還能在應用過程中對其進行有效控制，而且可以客觀、量化的展現(xiàn)新方法的優(yōu)勢；另一方面，方法驗證必須對檢測方法的準確度、精密度（包括重復性）、專屬性、檢測限、定量限、線性等進行確認。除專屬性以外，其他驗證內容均可通過不確定度進行驗證。Lee等建立了采用新型液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜法測定6 種異黃酮的方法，并分析了不確定度的各個來源，確保了方法的準確性[72]。Kim等開發(fā)了一種同時測定合成酚類抗氧化劑的方法，并分析其不確定度主要來源于標準曲線擬合以及標準溶液的配制過程，為檢測方法的進一步優(yōu)化提供了方向[73]。徐沖等利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測定面制品中鋁含量，針對不確定度的主要來源對測量方法進行改進，成功地提高了測量結果的準確性[74]。李國輝等采用酒精度快速測定儀測定飲料酒中酒精度，通過分析該方法的不確定度等指標，論證了該測定儀的可靠性[75]。

5 結 語

本文綜述了食品檢測過程中不確定度的來源、測定步驟及其應用，在食品安全檢測方法開發(fā)、檢測結果判定、實驗室質量控制等過程中均需要考慮不確定度的影響。食品檢測過程中標準物質、定量儀器的使用、樣品回收率均會引入較大的不確定度，環(huán)境變化對不確定度影響較??；此外，與化學分析法不同，微生物法檢測中重復性測定也是不確定度的主要來源之一。為保證檢測結果的準確性，應該將不確定度評價融入到食品檢測的整個過程中，從方法選擇、標準溶液配制、樣品制備及處理、儀器計量檢定、報告出具等方面統(tǒng)籌考慮不確定度的影響。