降尿酸肽對(duì)高尿酸血癥的作用及研究進(jìn)展

駱賢亮，劉 滔，錢忠英，馮鳳琴

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058）

高尿酸血癥是嘌呤代謝混亂或尿酸排泄減少所致的一種代謝疾病，已成為繼高血壓、高血糖、高血脂之后的第四大健康風(fēng)險(xiǎn)因素[1]?，F(xiàn)今，多數(shù)上班族長(zhǎng)期攝入富含嘌呤的食物（如肉類、海鮮、內(nèi)臟、啤酒等[2-3]），且存在久坐不運(yùn)動(dòng)的習(xí)慣，這些情況會(huì)導(dǎo)致尿酸排泄減少，尿酸水平不斷升高，從而引發(fā)高尿酸血癥及并發(fā)的痛風(fēng)、高血壓、腎病、心血管疾病等多種代謝綜合征疾病[4-5]。經(jīng)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，全球范圍內(nèi)高尿酸血癥的發(fā)病率和患病率呈逐年上升趨勢(shì)并趨于年輕化，2015—2016年，中國(guó)高尿酸血癥的總患病率為15.85%，男性和女性患病率分別為24.35%和6.15%；美國(guó)總患病率為20.1%，其中男性和女性患病率分別為20.2%和22.0%[6-8]，高尿酸血癥已逐漸成為威脅人類健康的主要疾病，因此，對(duì)該疾病的防治與研究日益重要。

目前臨床上用于治療高尿酸血癥的降尿酸藥可分為兩類：黃嘌呤氧化酶（enzyme xanthine oxidase，XOD）抑制劑（例如別嘌呤醇和非布司他）和排尿酸藥物（例如丙磺舒和苯溴馬?。?。其中別嘌呤醇是世界公認(rèn)的降尿酸標(biāo)準(zhǔn)藥物，具有一定的治療效果，但別嘌呤醇會(huì)引起胃腸道不適、皮疹和腎毒性等不良反應(yīng)[9-10]，同時(shí)還會(huì)引起別嘌呤醇超敏綜合征過敏反應(yīng)，可能危及生命，極大限制了其臨床應(yīng)用。因此，尋找更有效和安全的替代療法來降低血清尿酸鹽水平對(duì)控制高尿酸血癥具有重要意義[11]。

食源性生物活性肽是指食物蛋白質(zhì)來源的氨基酸序列片段，通常包含2～20 個(gè)氨基酸[12]。研究表明，生物活性肽在降血壓[13]、降尿酸[14]、抗炎[15]、抗菌[16]、降低膽固醇[14]等疾病防治中具有顯著的功效。與易引起諸多不良反應(yīng)的化學(xué)合成藥物相比，生物活性肽具有高生物活性、低毒性和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，因此生物活性肽的研究也受到越來越多的關(guān)注[12,17-18]。在中國(guó)知網(wǎng)、Web of Science、ScienceDirect和PubMed 4 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入關(guān)鍵詞“降尿酸肽”“XOD抑制肽”“uric acid-loweringpeptide”“anti-hyperuricemic peptide”“xanthine oxidase inhibitor peptide”等進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)降尿酸肽的研究從2017年開始逐年增多，且自2017年后最相關(guān)研究達(dá)20余篇。研究證明，降尿酸肽能很好地與XOD結(jié)合并抑制其活性，下調(diào)高尿酸血癥小鼠的血尿酸水平，具有不可估量的應(yīng)用前景。本文首先簡(jiǎn)要闡述了高尿酸血癥的發(fā)病機(jī)理及其研究模型的構(gòu)建，隨后簡(jiǎn)述了食物來源降尿酸肽的制備及體外活性，并討論降尿酸肽可能的分子機(jī)制，最后概述目前降尿酸肽研究存在的問題及未來的研究方向，為降尿酸肽的研究、開發(fā)及其在高尿酸血癥臨床應(yīng)用提供參考。

1 高尿酸血癥發(fā)病機(jī)理與防治

1.1 尿酸的合成與排泄

尿酸是一種有機(jī)弱酸，為嘌呤代謝的終產(chǎn)物。如圖1[19]所示，嘌呤腺苷酸經(jīng)一系列酶的催化，依次經(jīng)過次黃苷、次黃嘌呤和黃嘌呤等中間產(chǎn)物，最終氧化得到尿酸。人體內(nèi)有80%的尿酸是由內(nèi)源性嘌呤代謝產(chǎn)生，20%則來自食物中的核苷酸[20]。腎臟是尿酸排泄的主要器官，約有2/3～3/4的尿酸由腎臟排泄。由于尿酸是帶負(fù)電荷的極性分子，不能穿過細(xì)胞膜[21]，目前研究認(rèn)為腎臟中相關(guān)尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員（organic anion transporter，OAT）、尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（urate anion transporter 1，URAT1）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9（glucose transporter 9，GLUT9）等，參與了尿酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、重吸收和再分泌，在維持體內(nèi)尿酸穩(wěn)態(tài)中起到關(guān)鍵作用[21]；因此，尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也是促尿酸排泄藥物的主要作用靶點(diǎn)[22-23]。

圖 1 尿酸代謝機(jī)理圖[19]Fig. 1 Mechanism of uric acid metabolism[19]

1.2 尿酸代謝混亂與高尿酸血癥的形成

高尿酸血癥主要是由于尿酸產(chǎn)生（如富含嘌呤的食物）與排泄（如腎功能降低）之間的不平衡造成的[21]。也就是說，嘌呤代謝異?；蚰蛩崤判箷r(shí)，體內(nèi)尿酸、尿酸前體（次黃嘌呤和黃嘌呤）水平增加引起的血尿酸水平升高會(huì)導(dǎo)致高尿酸血癥，臨床的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：在正常嘌呤飲食狀態(tài)下，非同日兩次空腹的血尿酸水平，男性高于420 μmol/L（0.7 mg/L）或女性高于357 μmol/L（0.6 mg/L）[24-26]。長(zhǎng)期的高尿酸血癥會(huì)使尿酸鹽結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)腔及軟組織，促使血小板凝集，誘發(fā)高血壓、高血脂、痛風(fēng)及胰島素抵抗等一系列代謝綜合征疾病[27-28]。

1.3 高尿酸血癥疾病的防治

控制高尿酸血癥的形成主要通過控制飲食、調(diào)節(jié)生活方式以及藥物輔助治療。在飲食方面，由于食物中的嘌呤類型及含量都存在差異，所以對(duì)尿酸的影響也不同[29]。根據(jù)日本高尿酸血癥和痛風(fēng)營(yíng)養(yǎng)療法治療指南的建議，每天飲食中嘌呤應(yīng)少于400 mg[30]。因此，患有痛風(fēng)的人應(yīng)避免食用內(nèi)臟、甜面包、高果糖玉米糖漿、甜味飲料和酒精，尤其在痛風(fēng)發(fā)作頻繁時(shí)應(yīng)完全避免飲酒，同時(shí)應(yīng)限制肉類及肉類產(chǎn)品、海鮮、食用糖、甜味飲料和食用鹽的攝入量，鼓勵(lì)食用低脂或脫脂的乳制品和蔬菜[31]。此外，食物嘌呤含量還會(huì)隨著食品加工、烹飪和貯存而變化[3]。Ren Zhongyu等[32]研究發(fā)現(xiàn)，生魚片和烤魚的攝入與血尿酸水平成正相關(guān)，而水煮魚和炸魚則沒有顯著差異，因此高尿酸血癥患者也應(yīng)注意日常飲食的烹飪方式。通過飲食干預(yù)高尿酸血癥是長(zhǎng)期的過程，需要患者管理與控制自身飲食習(xí)慣。另外，由于飲食習(xí)慣只能在長(zhǎng)期干預(yù)下起作用，因此當(dāng)尿酸代謝混亂且危害到身體其他器官時(shí)，需要外源藥物介導(dǎo)治療。目前用于臨床治療的降尿酸藥物主要是尿酸生成抑制劑和促尿酸排泄制劑，包括西藥和中藥，但實(shí)際只有少數(shù)幾種藥物起到治療效果，且同時(shí)還伴隨許多副作用和不良反應(yīng)[33]。因此，開發(fā)食源性、綠色安全高效的降尿酸功能食品輔助治療高尿酸血癥是未來研究的新方向。

2 高尿酸血癥研究模型的構(gòu)建

高尿酸血癥動(dòng)物模型的造模方法主要有以下4 種：增加尿酸前體物質(zhì)如黃嘌呤、次黃嘌呤[34]等，促進(jìn)尿酸生成；抑制腎臟排泄尿酸，如乙胺丁醇[35]；抑制尿酸酶活性，如氧嗪酸鉀[36]；誘導(dǎo)機(jī)體代謝混亂致高尿酸血癥發(fā)生，如酵母浸粉[37]、果糖[38]等。本文主要對(duì)兩種常用的造模方法（氧嗪酸鉀和酵母浸粉）進(jìn)行概述。

2.1 氧嗪酸鉀誘導(dǎo)構(gòu)建高尿酸血癥動(dòng)物模型

氧嗪酸鉀即尿酸酶抑制劑，是目前最常用的高尿酸血癥建模藥物。朱祥祥等[39]對(duì)比不同造模因素，發(fā)現(xiàn)連續(xù)造模7 d后，250 mg/kgmb氧嗪酸鉀、300 mg/kgmb次黃嘌呤+250 mg/kgmb氧嗪酸鉀均可使小鼠血清尿酸水平顯著升高，成功誘導(dǎo)高尿酸血癥模型，且后者效果更佳。XOD抑制劑別嘌呤醇是治療高尿酸血癥的臨床藥物，通常選擇其作為陽性對(duì)照組。構(gòu)建模型時(shí)一般可通過灌胃或注射氧嗪酸鉀形成急性和非急性兩種高尿酸血癥模型，具體的模型構(gòu)建需根據(jù)樣本特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行。

2.1.1 氧嗪酸鉀非急性模型的構(gòu)建

如圖2A所示，非急性模型是先給受試動(dòng)物灌胃或飼料給予氧嗪酸鉀，當(dāng)血尿酸濃度達(dá)到110 μmol/L時(shí)，視為造模成功。造模成功后開始正式灌胃實(shí)驗(yàn)樣品，實(shí)驗(yàn)周期一般為7～30 d不等，具體給藥時(shí)間根據(jù)藥物的不同做相應(yīng)調(diào)整。實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)給予造模劑可使動(dòng)物血清中尿酸持續(xù)保持在高于正常的水平，可能會(huì)誘導(dǎo)慢性腎病的發(fā)生[40]。Yang Fei等[41]給模型組每日灌胃氧嗪酸鉀溶液600 mg/kgmb，對(duì)照組給予相同體積的羧甲基纖維素鈉溶液。實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間點(diǎn)設(shè)置為7、14、21 d和28 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從大鼠眼眶后靜脈收集血液樣品，發(fā)現(xiàn)第7天模型組的尿酸水平較對(duì)照組明顯增加，雖然隨時(shí)間的延長(zhǎng)模型鼠尿酸水平有所降低，但仍高于對(duì)照組。Long Hongyan等[42]探究甘草素在預(yù)防高尿酸血癥及其對(duì)腎臟的保護(hù)作用時(shí)，首先灌胃大鼠氧嗪酸鉀溶液250 mg/kgmb，并于1 h后灌胃實(shí)驗(yàn)樣品（甘草素和別嘌呤醇），實(shí)驗(yàn)維持7 d。該模型簡(jiǎn)單方便，但每日灌胃兩次對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠造成的機(jī)械傷害較大。同樣，Wang Huijuan等[43]為研究中藥瀉濁方對(duì)高尿酸血癥性腎病的治療機(jī)制，采用了與文獻(xiàn)[42]基本相同的造模方法，但實(shí)驗(yàn)周期延長(zhǎng)至3 周。Lu Xiaohui等[4]研究了羥基積雪草苷對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和高尿酸血癥的治療作用，實(shí)驗(yàn)以ICR小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，每天灌胃一次300 mg/kgmb尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀，連續(xù)7 d造模后每天一次給予小鼠受試樣品及陽性對(duì)照別嘌呤醇溶液（持續(xù)2 周），實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M的血清尿酸水平明顯高于對(duì)照組，且出現(xiàn)腎小管萎縮、間質(zhì)性炎癥和腎小管上皮細(xì)胞積液等腎臟損傷現(xiàn)象。對(duì)于非急性模型，需要注意的一點(diǎn)是，如果每日間隔12 h持續(xù)給予造模劑，可能會(huì)引起動(dòng)物血尿酸不斷升高[44]，促使腎衰竭，造成動(dòng)物死亡。因此，正式實(shí)驗(yàn)前建議先做造模劑劑量及給藥時(shí)間篩選的預(yù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 氧嗪酸鉀急性模型的構(gòu)建

如圖2B所示，急性模型是先對(duì)模型鼠進(jìn)行受試樣品干預(yù)，周期一般為7～30 d，干預(yù)后在腹腔注射或灌胃造模劑誘導(dǎo)急性高尿酸血癥。一次性給藥后大鼠血尿酸在造模后12 h內(nèi)基本高于正常水平，Chau等[45]在研究巖藻低聚糖時(shí)，先灌胃實(shí)驗(yàn)樣品干預(yù)SD大鼠21 d，再于第21天干預(yù)后1 h，通過灌胃劑量為300 mg/kgmb的氧嗪酸鉀和次黃嘌呤誘導(dǎo)急性高尿酸血癥模型，對(duì)照組灌胃羧甲基纖維素鈉溶液，并于24 h內(nèi)收集尿液樣本。第22天進(jìn)行與第21天同樣的處理后，收集尿液樣本，處死小鼠收集血清及組織，測(cè)定尿酸濃度、血尿素氮和肌酐含量。該造模方式下，體內(nèi)高尿酸水平在6 h達(dá)到最高峰，并且4 h時(shí)的尿酸水平與0 h相比有極顯著差異，因此研究者選用4 h作為誘導(dǎo)期。Wan Yin等[46]以咖啡酸為樣品，實(shí)驗(yàn)分為模型組、正常對(duì)照組（生理鹽水）、別嘌呤醇組（5 mg/kgmb）以及低、中、高劑量咖啡酸組（含量分別為20、50 mg/kgmb和100 mg/kgmb），連續(xù)灌胃實(shí)驗(yàn)樣品7 d后，在灌胃給藥1 h后進(jìn)行腹膜內(nèi)注射氧嗪酸鉀以誘導(dǎo)高尿酸血癥，并于建模1 h后進(jìn)行最后一次給藥，處死實(shí)驗(yàn)鼠。該建模方法發(fā)現(xiàn)模型組的尿酸水平高達(dá)354.66 μmol/L，較正常對(duì)照組（150.50 μmol/L）顯著增加。

圖 2 氧嗪酸鉀誘導(dǎo)高尿酸血癥動(dòng)物模型構(gòu)建Fig. 2 Construction of animal models of hyperuricemia induced by potassium oxonate

2.2 酵母浸粉誘導(dǎo)構(gòu)建高尿酸血癥動(dòng)物模型

酵母浸粉中含有豐富的蛋白質(zhì)、核苷酸和B族維生素，在體內(nèi)能水解產(chǎn)生嘌呤堿類、嘧啶堿類和磷酸，大量攝入酵母浸粉會(huì)干擾機(jī)體正常的嘌呤代謝，表現(xiàn)為XOD活性和尿酸含量升高，研究表明酵母浸膏和酵母浸粉均能很好地構(gòu)建高尿酸血癥模型[37,47]。張灝[48]以飼料喂食的方式，給予對(duì)照組動(dòng)物喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料，其余各模型組均喂食含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%酵母浸粉的高尿酸血癥標(biāo)準(zhǔn)飼料，實(shí)驗(yàn)組在模型組飼料的基礎(chǔ)上，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的海參皂苷、0.3%的海參多糖以及0.02%的海參腦苷脂。持續(xù)喂食14 d，發(fā)現(xiàn)在第9天時(shí)，模型組小鼠體內(nèi)血尿酸水平顯著高于對(duì)照組。同樣，Zhang Yuan等[49]也在其模型組的飼料中加入酵母作為高嘌呤飲食，但其樣品的攝入方式是灌胃。Pan Libin等[50]通過給予大鼠含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%酵母粉和0.15%腺嘌呤的飲食6 周，發(fā)現(xiàn)模型組血漿尿酸、肌酐和血尿素氮的水平顯著增加，且模型組左腎指數(shù)（臟器質(zhì)量與體質(zhì)量比）高于對(duì)照組，說明酵母飲食能有效建立高尿酸血癥誘導(dǎo)的腎臟疾病模型。酵母浸粉作為造模飼料，具有安全和機(jī)械傷害小等優(yōu)點(diǎn)，但造模耗時(shí)較長(zhǎng)，模型不穩(wěn)定，有一定的局限性。此外，還有研究表明，除了酵母浸粉，長(zhǎng)期攝入高果糖也會(huì)提高體內(nèi)血尿酸水平，使腎尿酸排泄值降低，在時(shí)間允許的情況下，也可以利用果糖構(gòu)建高尿酸血癥動(dòng)物模型[38,51-52]。

表 1 降尿酸肽的制備方法及其活性功能Table 1 Preparation and activity of uric acid-lowering peptide

3 降尿酸肽的制備與結(jié)構(gòu)、活性功能及作用機(jī)制

3.1 降尿酸肽的制備與結(jié)構(gòu)

化學(xué)合成藥物具有內(nèi)在的毒副作用，能夠引起腎臟或肝臟功能受損、肌肉萎縮和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。降尿酸肽作為有效安全的替代物，近些年對(duì)其研發(fā)逐漸增多。研究發(fā)現(xiàn)，底物和制備方法不同會(huì)影響生物活性肽的含量和特性。目前，常用酶解法從蛋白質(zhì)中獲得生物活性肽，因?yàn)槊阜ㄔ谒?、釋放和獲得目標(biāo)肽段方面更具可控性[53]。近幾年，關(guān)于食源性降尿酸肽的制備方法及其活性功能的相關(guān)研究見表1。大量研究發(fā)現(xiàn)，降尿酸肽的活性與其分子質(zhì)量有很大的關(guān)系。盛周煌[56]利用5 000 Da和3 000 Da的超濾膜對(duì)羅非魚皮膠原蛋白酶解液進(jìn)行分離，截留了分子質(zhì)量高于5 000 Da、3 000～5 000 Da和低于3 000 Da的3 種組分，發(fā)現(xiàn)低于3 000 Da組分的XOD抑制率最佳。同樣，鄒琳[57]發(fā)現(xiàn)鰹魚酶解原液XOD的半最大抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為14.88 mg/mL，其中高于3 000 Da的組分僅占0.17%，超過95%的組分分子質(zhì)量低于1 000 Da，進(jìn)一步膜分離純化后，分子質(zhì)量在600～1 000 Da的組分XOD抑制活性最高（IC50為9.18 mg/mL）。不同來源降尿酸肽的氨基酸序列不同，XOD抑制率也存在差異（表1）。Nongonierma等[61]發(fā)現(xiàn)含有Trp的二肽具有XOD抑制活性，其中Val-Trp和Trp-Val的抑制率分別為37.2%和36.7%，單獨(dú)分析Val和Trp的抑制率時(shí)，發(fā)現(xiàn)Val的XOD抑制率只有5.3%，而Trp則高達(dá)70.3%。這提示在制備降尿酸肽時(shí)，應(yīng)結(jié)合肽的空間結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量、氨基酸組成等進(jìn)行綜合分析，將有助于找到抑制XOD活性最佳的肽段。

3.2 降尿酸肽與XOD的分子對(duì)接及構(gòu)效關(guān)系

圖 3 XOD與抑制劑別嘌呤醇（A）、色氨酸（B）、PGACSN（C）、WML（D）分子對(duì)接二維可視化圖[57,61,64]Fig. 3 Two-dimensional visualization of molecular docking of xanthine oxidase with inhibitors allopurinol (A), tryptophan (B),PGACSN (C) and WML (D)[57,61,64]

XOD也稱黃嘌呤氧化還原酶，是一種限速酶，廣泛存在于肝、腸、血清和乳腺中，可催化尿酸的產(chǎn)生并同時(shí)產(chǎn)生活性氧[62]，因此，抑制XOD的活性對(duì)于高尿酸血癥和氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的治療至關(guān)重要。經(jīng)大量研究表明，降尿酸肽通過與XOD特異性結(jié)合抑制其活性，從而抑制尿酸的合成。He Weiwei等[14]通過堿性蛋白酶水解金槍魚肉獲得混合肽TPH，TPH中包含12 個(gè)二肽和三肽，能有效抑制XOD。其中含苯丙氨酸（Phe）的肽比含色氨酸（Trp）的肽能更有效地抑制XOD活性，苯丙氨酸-組氨酸（Phe-His）具有最強(qiáng)的XOD抑制活性（IC50＝25.7 mmol）。分子對(duì)接研究揭示了XOD中兩個(gè)氫鍵及其與Phe-914的一個(gè)π-π堆積相互作用是活性肽起到抑制作用的關(guān)鍵點(diǎn)。此外，Li Qingyong等[63]研究發(fā)現(xiàn)含有Trp的核桃蛋白肽能夠有效抑制XOD活性，且抑制活性隨著Trp的數(shù)量增加而增強(qiáng)。與別嘌呤醇相似[61]，Trp能與XOD中心鉬蝶呤周圍的關(guān)鍵殘基谷氨酸（Glu）-802、亮氨酸（Leu）-873、絲氨酸（Ser）-876、精氨酸（Arg）-880、Phe-914、Phe-1009、蘇氨酸（Thr）-1010、纈氨酸（Val）-1011、Leu-1014、丙氨酸（Ala）-1078、Ala-1079等有效結(jié)合和作用（圖3A、B）。因此，含Trp的肽具有較高的XOD抑制活性和抗氧化能力，此結(jié)果與He Weiwei等[14]的研究結(jié)果一樣。Li Yujuan等[64]分別評(píng)估魚水解物、脫酚核桃水解物和大豆水解物的降尿酸功效，發(fā)現(xiàn)魚水解物中有兩種肽與XOD有結(jié)合位點(diǎn)，其中疏水肽WML較親水肽PGACSN更容易進(jìn)入XOD的活性位點(diǎn)，且使XOD的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，這可能是疏水相互作用所致（圖3C、D）。Itsuki等[60]通過消化酶從鯊魚軟骨中提取有效成分，利用無載體兩性電解質(zhì)等電聚焦和反相液相色譜分離出活性肽。在最終純化的堿性蛋白酶消化物中共鑒定出18 種肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酪氨酸（Tyr）-Leu-Asp-天冬氨酸（Asn）-Tyr和Ser-脯氨酸（Pro）-Pro-Tyr-Trp-Pro-Tyr肽段降低了血清尿酸水平，與前文提及的肽相似，可能通過疏水基團(tuán)起到重要作用。Nongonierma等[61]測(cè)定的12 種二肽中，含Trp的Val-Trp肽及其反向肽Trp-Val均表現(xiàn)出XOD抑制活性，主要是Trp殘基起作用。Trp、Val-Trp和Trp-Val 3 種肽的XOD抑制活力IC50沒有顯著差異，但比別嘌呤醇高約200 倍。Trp、Val-Trp和Trp-Val屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，而別嘌醇是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。Li Qingyong等[65]采用Sephadex G-15凝膠過濾和反相高效液相色譜法從脫酚胡桃粕水解產(chǎn)物中分離純化出兩種新的降尿酸肽，分別為WPPKN（640.8 Da）和ADIYTE（710.7 Da）。WPPKN和ADIYTE均表現(xiàn)出較高的體外XOD抑制活性，IC50分別為（17.75±0.12）mg/mL和（19.01±0.23）mg/mL。根據(jù)分子模擬的結(jié)果，WPPKN進(jìn)入疏水通道，甚至阻礙了黃嘌呤和XOD之間的相互作用，而ADIYTE在B鏈的表面阻止底物進(jìn)入疏水通道。從前文來看，生物活性肽起XOD抑制作用的原因可能是通過π-π堆積作用、疏水作用及與XOD周圍殘基有效結(jié)合，抑制XOD與底物黃嘌呤和次黃嘌呤結(jié)合，特別地，含有Trp氨基酸殘基的活性肽抑制能力較強(qiáng)。同時(shí)也說明降尿酸肽的XOD抑制活性受氨基酸種類、數(shù)目及基團(tuán)位置的影響[66]。因此，研究活性肽的XOD抑制活性構(gòu)效關(guān)系對(duì)開發(fā)降尿酸活性肽有著不可忽視的作用。

3.3 降尿酸肽體內(nèi)活性評(píng)價(jià)及作用機(jī)制

尿酸是嘌呤代謝的最終產(chǎn)物，體內(nèi)XOD活性升高通常與尿酸水平呈正相關(guān)。研究表明，尿酸還可以與體內(nèi)O2-、H2O2和OH-反應(yīng)，從而引起氧化應(yīng)激和腎功能受損[67]?，F(xiàn)有的降尿酸藥物會(huì)引起諸多不良反應(yīng)，因此，開發(fā)新型安全高效的替代品具有積極意義。大量研究表明，活性肽具有較好的體外抑制XOD活性，近年來食源性活性肽降尿酸作用及其體內(nèi)作用機(jī)制的研究也越來越受關(guān)注。Itsuki等[59]采用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液萃取分離鯊魚軟骨蛋白水解消化液中的活性肽，灌胃活性肽28 d后，發(fā)現(xiàn)鯊魚軟骨活性肽能顯著降低高尿酸血癥大鼠的血尿酸水平，且具有劑量依賴性?；钚噪娘@著降低了血清中XOD的活性，盡管該活性肽在體外未表現(xiàn)出XOD抑制活性。說明活性肽進(jìn)入體內(nèi)后，在消化、吸收和代謝的過程中可能被轉(zhuǎn)化為具有XOD抑制活性的小肽。Liu Yang等[68]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外XOD抑制實(shí)驗(yàn)研究金槍魚蛋白水解物（tuna protein hydrolysate，TPH）及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（TPH-M）和胃腸道消化產(chǎn)物（TPH-D）3 種樣品的抗高尿酸血癥活性。在體外XOD抑制活性實(shí)驗(yàn)中，TPH和TPH-D的抗高尿酸活沒有顯著差異，表明經(jīng)胃腸道消化后TPH的XOD抑制活性不會(huì)降低。此外，TPH、TPH-M和TPH-D均可以在體內(nèi)有效抑制XOD活性并下調(diào)XODmRNA的表達(dá)，這表明抗高尿酸血癥作用的機(jī)制與XOD活性及XODmRNA的表達(dá)有關(guān)。Liu Naixin等[58]從大米提取物中鑒定出一種新型肽RDP1（AAAAGAKAR、785.91 Da），研究證明RDP1（最低有效含量為10 μg/kgmb）能顯著降低大鼠血尿酸和肌酐，減輕高尿酸血癥性腎病，其通過占據(jù)XOD與黃嘌呤的結(jié)合位點(diǎn)來抑制尿酸的形成。更有研究發(fā)現(xiàn)，鰹魚肽能顯著降低模型鼠的血清尿酸水平（（95.4±27.4）μmol/L），甚至低于別嘌呤醇組（（114.3±53.0）μmol/L），而大豆肽則沒有表現(xiàn)出抗高尿酸血癥活性[64]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，金槍魚寡肽（TMOP）能夠減輕高尿酸血癥和腎臟炎癥，改變尿酸代謝途徑，抑制NLRP3炎性小體的活性和Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號(hào)通路的表達(dá)，并抑制p65-NF-κB的磷酸化。此外，研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)TMOP處理的小鼠糞菌也具有抗高尿酸的作用[69]。與Han Jiaojiao 等[69]的研究結(jié)果相似，Wan Haitao等[70]從兩種不同品種的海參中提取寡肽。結(jié)果表明，兩種寡肽均能下調(diào)促炎因子和上調(diào)抗炎因子的表達(dá)，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，促使尿酸鹽吸收和分泌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄恢復(fù)正常水平，同時(shí)還增加了乳桿菌等有益菌的豐度。綜上，目前對(duì)降尿酸肽的作用機(jī)制已有初步研究，但主要集中于其對(duì)XOD活性的抑制及對(duì)相關(guān)表型的影響，在體內(nèi)的確切作用機(jī)制尚未可知，將來可以通過腸道菌群、尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及相關(guān)信號(hào)通路等途徑做進(jìn)一步的探究，為明確降尿酸肽的體內(nèi)作用機(jī)制提供充足的科學(xué)依據(jù)。

3.4 降尿酸肽研究遇到的問題及展望

現(xiàn)有研究表明部分降尿酸肽雖然沒有顯著性的體外XOD抑制活性，但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中卻能明顯降低高尿酸血癥動(dòng)物的尿酸[54]，因此，目前對(duì)降尿酸肽經(jīng)體內(nèi)消化酶消化吸收后發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)和形式尚不明確。

針對(duì)上述問題，今后研究需重點(diǎn)關(guān)注以下3 個(gè)方面：1）提高對(duì)降尿酸肽的綜合性研究。在體外研究降尿酸肽的結(jié)構(gòu)與功能的同時(shí)，探索其經(jīng)胃腸道消化后，活性肽的存在形式及其在體內(nèi)的作用機(jī)理。2）利用包埋、微膠囊等技術(shù)，制造傳遞降尿酸肽的遞送系統(tǒng)，避免活性肽被水解，提高其生物利用率。如Zhang Xiaopei等[71]利用非共價(jià)鍵相互作用，使單體和交聯(lián)劑在蛋白質(zhì)分子周圍聚集形成網(wǎng)絡(luò)薄殼，形成尿酸氧化酶納米膠囊。該技術(shù)不僅可確保有效的酶促反應(yīng)，把尿酸鹽分子有效轉(zhuǎn)運(yùn)至膠囊核心與尿酸氧化酶充分反應(yīng)，還能延長(zhǎng)納米膠囊在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，從而為高尿酸血癥和慢性痛風(fēng)提供有效的治療方法。3）活性肽對(duì)高尿酸血癥模型鼠尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響。丁坤等[72]發(fā)現(xiàn)祛濕滌濁湯能顯著下調(diào)URAT1和GLUT9的表達(dá)，上調(diào)OAT1、ABCG2和八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1水平，降低高尿酸血癥大鼠的血尿酸水平，說明祛濕滌濁湯可能是通過抑制XOD的活性及調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)來發(fā)揮抗高尿酸血癥作用。但目前尚不明確降尿酸肽是否影響尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和功能，可結(jié)合前人研究結(jié)果從該方面展開深入研究。

4 結(jié) 語

高尿酸血癥不僅能引起腎臟受損，同時(shí)還可能誘發(fā)心臟病、糖尿病、高血脂等疾病，嚴(yán)重影響人類健康。目前臨床治療的藥物對(duì)人體有明顯的副作用，因此開發(fā)綠色、安全、有效的替代物顯得尤為重要?；钚噪膶儆谑吃葱曰钚晕镔|(zhì)，大量研究證實(shí)其具有易吸收、安全和高生物活性等特性。近年來，國(guó)內(nèi)外許多研究顯示，降尿酸肽可能通過π-π堆積作用、疏水作用及與XOD周圍殘基有效結(jié)合起到XOD抑制作用，且含Trp氨基酸殘基的活性肽抑制能力較強(qiáng)。此外，降尿酸肽還能顯著降低高尿酸血癥模型鼠的血清肌酐和尿素氮水平，抑制XOD活性以及保護(hù)腎臟，表明降尿酸肽在高尿酸血癥中具有良好的應(yīng)用前景。但目前對(duì)降尿酸肽的研究主要集中在制備、結(jié)構(gòu)分析、體外XOD抑制活性（包括分子對(duì)接）及簡(jiǎn)單的體內(nèi)降尿酸方面，雖有一些個(gè)別的人體試食效果研究，但缺乏充足的臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)，對(duì)機(jī)體確切的作用機(jī)制也不清楚，需進(jìn)一步深入研究并開展臨床應(yīng)用實(shí)驗(yàn)，從而為降尿酸肽的應(yīng)用提供扎實(shí)有力的科學(xué)依據(jù)。