乳酸菌生物膜形成調(diào)控及在食品中的應(yīng)用研究進(jìn)展

朱寒劍，李雷兵，鄭 心，李 琴，穆 楊，徐 寧，胡 勇，吳 茜，柳志杰，李 瑋，汪 超，周夢(mèng)舟

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，釀造食品湖北省工程研究中心，湖北 武漢 430068）

早在幾個(gè)世紀(jì)以前，就有科學(xué)家通過(guò)顯微鏡在人的牙菌斑等表面觀察到了細(xì)菌形成的層膜狀結(jié)構(gòu)，這就是細(xì)菌的生物膜。生物膜是指依附于有生命或無(wú)生命物體表面且被胞外大分子包裹的有組織的細(xì)菌群體，也被稱為生物被膜[1-2]。生物膜是大多數(shù)細(xì)菌普遍存在的一種生存方式，其可能存在于醫(yī)療器械、病理組織、食品工業(yè)原料、食品機(jī)械和管道表面等地方。事實(shí)上絕大多數(shù)細(xì)菌都是以生物膜的形式生長(zhǎng)，而不是以浮游狀態(tài)生長(zhǎng)[3-4]。生物膜由細(xì)菌細(xì)胞、胞外聚合物和其他顆粒物的水合混合物構(gòu)成[5]。生物膜是細(xì)菌抵御各種環(huán)境脅迫的一種有效方式，當(dāng)細(xì)菌遇到極端環(huán)境（溫度、pH值、滲透壓、金屬離子、抗生素和其他微生物等）威脅時(shí)就會(huì)聚集形成生物膜[6-7]。同時(shí)細(xì)菌生物膜的細(xì)胞之間可以通過(guò)群體感應(yīng)進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)交流，從而調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的獲取和轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞之間的雜交以及細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和代謝產(chǎn)物的生成，使生物膜成為一個(gè)類似多細(xì)胞生物的群體[8-9]。

1 乳酸菌生物膜的形成

乳酸菌是一類可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)乳酸的無(wú)芽孢革蘭氏陽(yáng)性菌，是一種公認(rèn)的食用安全益生菌，具有降低腸道pH值、調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制有害菌生長(zhǎng)、防治乳糖不耐癥等多種功效，還是制作酸奶、泡菜等生活中常見(jiàn)發(fā)酵食品的重要菌株[10-12]。和大多數(shù)細(xì)菌一樣，乳酸菌在一些環(huán)境中也能產(chǎn)生生物膜，但目前關(guān)于生物膜的研究主要集中在致病菌方面，而對(duì)乳酸菌這樣的益生菌生物膜研究較少，但實(shí)際上不論是在腸道還是在發(fā)酵食品中，乳酸菌大多是以生物膜方式生存，因此加強(qiáng)對(duì)乳酸菌生物膜的研究很有必要[13-14]。

1.1 乳酸菌生物膜組成

乳酸菌生物膜的組成成分和其他細(xì)菌類似，主要包括菌體和胞外聚合物，而胞外聚合物又由各種生物大分子（蛋白質(zhì)、胞外多糖、脂質(zhì)、DNA（eDNA）等）構(gòu)成[15]。在結(jié)構(gòu)上細(xì)胞只占生物膜的小部分空間，通常為5%～35%。而胞外聚合物填充在生物膜細(xì)胞之間，占生物膜中的大部分空間。胞外聚合物直接提供了乳酸菌生物膜的胞外環(huán)境和生存條件，將細(xì)胞與外界環(huán)境分隔開(kāi)，也為生物膜提供了機(jī)械穩(wěn)定性，保護(hù)了生物膜中的乳酸菌。這也是形成生物膜后乳酸菌抵御外界不良環(huán)境能力增強(qiáng)的原因之一[16]。此外，生物膜的成分，尤其是胞外聚合物和生物膜的代謝表現(xiàn)密不可分。如多糖可以結(jié)合大量水分，提高機(jī)械穩(wěn)定性，改善蛋白質(zhì)和酶的調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)eDNA與信息交流基因轉(zhuǎn)移。胞外聚合物對(duì)細(xì)菌與細(xì)菌之間以及細(xì)菌與外界物質(zhì)交換也起著重要作用，如海綿狀的胞外聚合物可以更高效地吸附捕獲營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，作為細(xì)菌之間的介質(zhì)可以運(yùn)送養(yǎng)料、排出代謝廢物，為細(xì)菌之間及細(xì)菌與外界的信息交流提供便利，如基因的轉(zhuǎn)移、信號(hào)分子的轉(zhuǎn)移和釋放等，這些都是生物膜為了適應(yīng)不良環(huán)境而采取的一些策略?？傊锬さ臉?gòu)成成分和它的各種功能及代謝表現(xiàn)息息相關(guān)[17-19]。

1.2 乳酸菌生物膜的形成過(guò)程

目前，關(guān)于乳酸菌生物膜形成的詳細(xì)過(guò)程還不是十分明確，但是對(duì)枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌等典型革蘭氏陽(yáng)性菌的研究都表明生物膜形成的大致步驟是相同的[20-21]。一般革蘭氏陽(yáng)性菌生物膜的形成過(guò)程可以分為4 個(gè)階段[22-24]。第一步是細(xì)菌的黏附和定植階段，細(xì)菌在與某些物體表面接觸后會(huì)黏附在其表面，開(kāi)始形成生物膜，有鞭毛的細(xì)菌是通過(guò)鞭毛的運(yùn)動(dòng)聚集在一起的，而乳酸菌大多數(shù)都沒(méi)有鞭毛，所以乳酸菌可能是通過(guò)沉降等方式聚集黏附在一起。但這時(shí)附著的細(xì)胞僅有少量的胞外聚合物包裹，還未進(jìn)入細(xì)胞膜的形成過(guò)程，而這些黏附的細(xì)胞也還可以重新進(jìn)入浮游狀態(tài)，此時(shí)黏附過(guò)程是可逆的。第二個(gè)階段是細(xì)菌的生長(zhǎng)階段，隨著黏附和定植的細(xì)菌數(shù)量不斷增加，一些與生物膜形成相關(guān)的基因開(kāi)始調(diào)整表達(dá)，細(xì)菌開(kāi)始大量生長(zhǎng)、繁殖并分泌大量胞外聚合物將細(xì)菌黏合起來(lái)，同時(shí)使細(xì)菌在物體表面黏合得更加牢固，這個(gè)黏附是不可逆的。第三階段是生物膜的生長(zhǎng)成熟階段，在經(jīng)歷不可逆的黏附階段之后生物膜進(jìn)一步生長(zhǎng)進(jìn)入成熟期，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡可以觀察到成熟的生物膜是由細(xì)菌堆積成類似蘑菇狀或堆狀的微菌落組成，菌落之間有水通道，可以運(yùn)送養(yǎng)料排出廢物。最后一個(gè)階段是細(xì)菌的播散階段，成熟的生物膜通過(guò)蔓延、部分脫落或釋放出浮游細(xì)菌等方式進(jìn)行擴(kuò)展。釋放出來(lái)的浮游細(xì)菌可重新定植于物體表面，再次經(jīng)歷這4 個(gè)階段形成新的生物膜。細(xì)菌生物膜的形成過(guò)程可用圖1表示。

圖 1 細(xì)菌生物膜形成動(dòng)態(tài)過(guò)程[22-24]Fig. 1 Schematic of the dynamic formation process of lactic acid bacteria biofilm[22-24]

1.3 影響乳酸菌生物膜形成的因素

1.3.1 培養(yǎng)基組分

影響乳酸菌生物膜形成的因素可用圖2表示。培養(yǎng)基組分尤其是作為能量來(lái)源的碳源對(duì)乳酸菌生物膜的形成有重要作用，在乳酸菌培養(yǎng)基（MRS）中缺乏碳源的時(shí)候就會(huì)形成大量的生物膜，研究表明，在培養(yǎng)基中無(wú)葡萄糖時(shí)乳酸菌幾乎不生長(zhǎng)，也不形成生物膜，但是向培養(yǎng)基中添加葡萄糖等碳源后就會(huì)形成生物膜，且隨著葡萄糖濃度的增加生物膜量逐漸減少，但當(dāng)葡萄糖濃度超過(guò)一定值之后又會(huì)促進(jìn)生物膜的產(chǎn)生。乳糖、果糖、蔗糖等其他碳源都有類似的效果，不過(guò)不同的碳源對(duì)不同乳酸菌生物膜形成能力的影響均有不同[25-26]。同時(shí)MRS中吐溫-80的缺乏也會(huì)促進(jìn)生物膜的形成[27]。

圖 2 影響乳酸菌生物膜形成的因素Fig. 2 Factors affecting the formation of lactic acid bacteria biofilm

1.3.2 金屬離子和鹽濃度

不同金屬離子對(duì)生物膜的形成也有影響，如Mn2+、Fe3+、Mg2+和Na+在一定濃度下會(huì)對(duì)生物膜形成起到促進(jìn)作用，其原因是這些離子能夠促進(jìn)或直接參與某些蛋白質(zhì)和酶的合成，從而增強(qiáng)乳酸菌生物膜的黏附性和穩(wěn)定性。而Cu2+、Cu+、Al3+、Ca2+、Pb+和Zn+等金屬離子則會(huì)對(duì)生物膜的形成起到抑制作用。一般乳酸菌只有在鹽添加量為4%～8%范圍內(nèi)能形成生物膜，超過(guò)這個(gè)范圍其生物膜形成能力被抑制或完全不能形成[25,28]。

1.3.3 非生物表面

除此之外，非生物的表面因?yàn)槭巧锬じ街妮d體，所以對(duì)生物膜的產(chǎn)生也起重要作用，這個(gè)影響主要是在細(xì)菌的黏附和定植階段[29]。因此，材料的類型、粗糙度、涂層、電荷、自由能、硬度等因素都會(huì)影響生物膜的形成[30]。一般來(lái)說(shuō)，表面不規(guī)則可以提供更大的表面積使細(xì)菌定植，其中不規(guī)則的凹面空間，使微生物能夠找到有利的和具有保護(hù)性的微環(huán)境[31-32]。而且，不規(guī)則的表面阻礙了表面的清潔，因此有利于營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和微生物的積累[33]。表面涂層的不同，如不銹鋼、陶瓷、聚苯乙烯、聚四氟乙烯等對(duì)生物膜生成的影響也不盡相同。表面電荷會(huì)影響細(xì)菌與材料的結(jié)合。一般來(lái)說(shuō)，帶正電的表面會(huì)促進(jìn)與細(xì)菌的相互作用和生物膜的形成[34]。此外，表面能與表面反應(yīng)性直接相關(guān)，疏水性或親水性會(huì)影響細(xì)菌與表面的相互作用，這取決于細(xì)菌種別[35]。金屬材料可提供高自由能、帶負(fù)電荷的親水表面，聚四氟乙烯可提供低自由能、帶負(fù)電荷的疏水表面[36]。因此，相對(duì)于其他疏水性表面（聚四氟乙烯、尼龍、丁腈橡膠和氟化聚合物），提供高自由表面能的不銹鋼和玻璃表面相對(duì)親水，通常有助于形成大量細(xì)菌的生物膜。

1.3.4 其他因素

乳酸菌只有在適宜的pH值下才能以浮游狀態(tài)生存，pH值過(guò)高和過(guò)低都會(huì)促進(jìn)生物膜的產(chǎn)生[14]。一般來(lái)說(shuō)最適合乳酸菌形成生物膜的pH值范圍為5.5～6.8，而當(dāng)pH值不在3.8～6.8范圍內(nèi)時(shí)，生物膜的形成能力會(huì)被極大地抑制[37]。當(dāng)乳酸菌受到抗生素的脅迫時(shí)也可能形成生物膜來(lái)抵御，有研究表明在生物膜狀態(tài)下的乳酸菌比浮游的乳酸菌對(duì)抗生素有更高的耐受性[38]。乳酸菌在遇到有害細(xì)菌時(shí)可以形成生物膜來(lái)共同應(yīng)對(duì)，甚至可以抑制有害菌的生長(zhǎng)[39]。

2 乳酸菌生物膜形成的調(diào)控機(jī)制

目前關(guān)于乳酸菌生物膜形成的調(diào)控機(jī)制研究相對(duì)較少。但可以確定的是，乳酸菌從浮游態(tài)到聚集形成生物膜的各個(gè)步驟中涉及到的調(diào)控機(jī)制是非常復(fù)雜的，不論是在乳酸菌的黏附還是生長(zhǎng)或成熟期，都伴隨著大量的基因表達(dá)和信號(hào)分子的傳遞以調(diào)控生物膜的形成[23,40]。Sun Linlin等[41]基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法研究了植物乳桿菌J26（Lactobacillus plantarumJ26）形成的生物膜特征，并試圖闡明其潛在的代謝途徑。結(jié)果表明，浮游狀態(tài)和生物膜狀態(tài)下的乳酸菌有1 051 個(gè)基因表達(dá)差異顯著，其中513 個(gè)基因被上調(diào)，而538 個(gè)基因被下調(diào)，這些基因與代謝、氨基酸合成、應(yīng)激反應(yīng)、酶合成和群體感應(yīng)密切相關(guān)。

2.1 群體感應(yīng)

在一個(gè)細(xì)菌群體中，細(xì)菌之間可以通過(guò)某些小分子作為信號(hào)分子進(jìn)行交流，這種小分子物質(zhì)被稱為“自誘導(dǎo)物質(zhì)”（autoinducer，AI）。群體感應(yīng)是細(xì)菌之間通過(guò)自誘導(dǎo)的信號(hào)分子進(jìn)行相互交流，調(diào)控自身不同基因表達(dá)并調(diào)控群體行為的一種現(xiàn)象。群體感應(yīng)涉及到細(xì)菌的多種功能，如孢子的形成、DNA轉(zhuǎn)移、抗生素生成、生物發(fā)光性等，當(dāng)然生物膜的形成也受到群體感應(yīng)的調(diào)控[42-43]。根據(jù)信號(hào)分子的不同，群體感應(yīng)通常分為3 種：第一種是以酰基高絲氨酸內(nèi)酯類物質(zhì)作為信號(hào)分子，存在于革蘭氏陰性菌中[8]；第二種是以經(jīng)過(guò)修飾的寡肽類物質(zhì)作為信號(hào)分子，存在于革蘭氏陽(yáng)性菌中[44]；第三種是以AI-2作為信號(hào)分子，既存在于革蘭氏陽(yáng)性菌中也存在于革蘭氏陰性菌中，乳酸菌的群體感應(yīng)就受到AI-2信號(hào)分子的調(diào)節(jié)[45]。目前研究比較多的是乳酸菌生物膜的形成受到群體感應(yīng)的調(diào)控[46]。

2.1.1 群體感應(yīng)與抗逆性

外界環(huán)境變化會(huì)觸發(fā)乳酸菌的群體感應(yīng)從而調(diào)控生物膜的形成，并增強(qiáng)抗逆性。luxS/AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)可以調(diào)控生物膜的形成。luxS是控制AI-2產(chǎn)生的一個(gè)重要基因。在鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）和嗜酸乳桿菌中（Lactobacillus acidophilus），luxS的缺失會(huì)導(dǎo)致生物膜形成能力的下降，且外源添加AI-2或其前體分子可以促進(jìn)生物膜的形成，在副植物乳桿菌中l(wèi)uxS的過(guò)表達(dá)會(huì)增加AI-2的產(chǎn)生并提高菌株的耐熱性、膽汁鹽抗性以及促進(jìn)生物膜的形成，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膜蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的多個(gè)基因受luxS調(diào)控，這可能是乳酸菌抗逆性和生物膜形成能力提高的原因[47]。但在羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）中，這個(gè)結(jié)果似乎是相反的，有研究人員用1 株羅伊氏乳桿菌構(gòu)建了不產(chǎn)自誘導(dǎo)分子AI-2的luxS突變體，與野生型相比，不論是在體外還是體內(nèi)突變體的生物膜厚度都更厚，且外源添加的AI-2也不能使生物膜恢復(fù)到野生型的狀態(tài)[48]。這些研究都表明，luxS/AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)在不同細(xì)菌生物膜的形成中發(fā)揮的作用是不同的，即使是在乳酸菌中發(fā)揮的作用也不盡相同，可能促進(jìn)生物膜的形成，也可能抑制生物膜的形成，不過(guò)可以確定的是luxS/AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)確實(shí)參與了生物膜的形成（圖3）。乳酸菌在遇到有害菌時(shí)也會(huì)刺激luxS的表達(dá)。在嗜酸乳桿菌與單核細(xì)胞增生性李斯特菌共培養(yǎng)時(shí)，嗜酸乳桿菌luxS基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，而單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）的生長(zhǎng)明顯被抑制，這與生物膜的形成可以增強(qiáng)乳酸菌的抗菌性可能有關(guān)[13,49]。

2.1.2 群體感應(yīng)與黏附性

細(xì)菌的黏附性也是生物膜形成的一個(gè)重要因素，細(xì)菌的黏附能力增強(qiáng)其形成生物膜的能力也隨之增強(qiáng)。群體感應(yīng)能通過(guò)影響乳酸菌的黏附性來(lái)調(diào)控生物膜的形成。Jia Fangfang等[50]敲除植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumKLDS1.0391）的luxS后，其對(duì)酸和膽汁鹽的耐受性明顯降低，且對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力明顯降低，結(jié)合上文“l(fā)uxS的缺失會(huì)影響生物膜的形成”，推測(cè)luxS/AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)可能影響乳酸菌的黏附性從而調(diào)控生物膜。肽介導(dǎo)的輔助基因調(diào)節(jié)器（accessory gene regulator，Agr）系統(tǒng)也是一個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng)，由一個(gè)包含4 個(gè)基因的操縱子（agrBDCA）組成[51]。在植物乳桿菌WCFS1中，lamACD操縱子編碼lamA基因，該操縱子是與金黃色葡萄球菌Agr系統(tǒng)同源的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，lamA與編碼表面多糖、細(xì)胞膜蛋白和糖的利用有關(guān)，因此能控制植物乳桿菌的黏附性，影響生物膜的形成（圖3）[52-53]。Perez-Ibarreche等[54]對(duì)清酒乳桿菌（Lactobacillus sakeiCRL1862）的研究結(jié)果表明，CRL1862中對(duì)黏附起最重要調(diào)控作用的基因是srtA2，srtA1和srtA2能夠通過(guò)識(shí)別LPXTG序列將大量功能不同的蛋白質(zhì)錨定在細(xì)胞壁上，從而增加乳酸菌的黏附性（圖3）。這與Call等[55]的報(bào)道類似，乳酸菌需要兩種SrtA酶才能與結(jié)腸上皮細(xì)胞系產(chǎn)生結(jié)合，而某些酶的失活并不會(huì)影響?zhàn)じ健５@些黏附基因是否受到群體感應(yīng)的調(diào)控尚不明確。

圖 3 各種因素對(duì)乳酸菌生物膜的調(diào)控機(jī)制Fig. 3 Regulatory effects of various factors on lactic acid bacteria biofilm

2.2 非群體感應(yīng)因素

除luxS外，乳酸菌生物膜的形成還受到許多基因的調(diào)控。環(huán)境因素的改變會(huì)影響某些基因的表達(dá)，從而影響生物膜的形成，其機(jī)制可用圖3概括表示。Bove等[56]的研究表明，在植物乳桿菌WCFS1（Lactobacillus plantarumWCFS1）中，ftsH發(fā)生突變使FtsH蛋白酶缺失，F(xiàn)tsH蛋白是一種ATP依賴性金屬蛋白酶，其缺失會(huì)導(dǎo)致突變體耐熱和耐鹽性能變差，且形成生物膜能力降低。相反的，過(guò)量表達(dá)的FtsH可以使植物乳桿菌的耐熱和耐鹽性能增強(qiáng)，且生物膜形成能力也相應(yīng)增強(qiáng)。因此，ftsH可以調(diào)控生物膜的形成以抵御外界不良環(huán)境，增強(qiáng)細(xì)菌的抗逆性。Muscariello等[57]在植物乳桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)了flmA、flmB和flmC3 個(gè)基因，并通過(guò)分離攜帶相應(yīng)基因零突變的菌株，研究了flmA、flmB和flmC在生物膜形成中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3 個(gè)基因編碼的Flm蛋白參與了生物膜的形成。flmA、flmB、flmC蛋白的氨基酸序列與變形鏈球菌生物膜調(diào)節(jié)蛋白（biofilm regulatory protein A，BrpA）的同源性較高，BrpA被認(rèn)為是變形鏈球菌生物膜發(fā)育的調(diào)節(jié)因子[58]。此外，通過(guò)轉(zhuǎn)錄研究表明，flmA、flmB和flmC的表達(dá)受到分解代謝控制蛋白A（catabolite control protein A，CcpA）的調(diào)控，CcpA激活了flmA的表達(dá)，抑制了flmB和flmC的表達(dá)。CcpA是碳分解代謝抑制的中介調(diào)節(jié)因子，也被證明是革蘭氏陽(yáng)性菌中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子[59]。碳源對(duì)生物膜的形成有著重要作用，因此CcpA介導(dǎo)的生物膜形成機(jī)制可能受到碳源的影響，當(dāng)碳源缺乏的時(shí)候，乳酸菌可以通過(guò)CcpA促進(jìn)生物膜的形成，而當(dāng)碳源過(guò)量時(shí)則抑制生物膜的形成。許多研究表明，乳酸菌在遇到抗生素脅迫時(shí)同樣會(huì)形成生物膜以抵御抗生素的脅迫。George等[60]研究發(fā)現(xiàn)亞抑制濃度的慶大霉素會(huì)促進(jìn)lamBDCA操縱子的表達(dá)，調(diào)控乳酸菌的黏附性，從而促使植物乳桿菌MCC3011（Lactobacillus plantarumMCC3011）產(chǎn)生生物膜。生物膜的形成一方面可以使抗生素更加難以侵入細(xì)菌；另一方面也可以促進(jìn)細(xì)菌間耐藥基因的轉(zhuǎn)移，這也是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的原因之一[61]。

3 乳酸菌生物膜在食品中的應(yīng)用

目前關(guān)于生物膜的研究多集中在生物膜的負(fù)面影響方面，如在臨床上，生物膜的形成給消毒帶來(lái)了困難；在醫(yī)療器械上形成的生物膜也會(huì)污染器械；許多疾病的發(fā)生也與生物膜的形成有關(guān)，如牙周病、慢性中耳炎、尿路感染等[62]。在食品領(lǐng)域，生物膜的形成同樣會(huì)污染食品生產(chǎn)管道或食品加工設(shè)備，因其難以殺滅甚至?xí)廴臼称吩?，給食品安全帶來(lái)了隱患[63-64]。乳酸菌作為一種益生菌存在于許多食品中，但某些條件下產(chǎn)生的生物膜依然會(huì)導(dǎo)致食品變質(zhì)。據(jù)報(bào)道，許多乳酸菌菌種產(chǎn)生的生物膜會(huì)影響肉、奶酪、清酒、啤酒和沙拉的品質(zhì)，如果糖乳桿菌（Lactobacillus fructivorans）會(huì)使蛋黃醬和味噌變質(zhì)，醋酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）會(huì)導(dǎo)致食醋變質(zhì)，植物乳桿菌亞種（Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum）可導(dǎo)致非常常見(jiàn)的食品生產(chǎn)廠污染和泡菜腐敗[65-66]。但是從另一個(gè)角度看，乳酸菌作為一種益生菌，形成生物膜后抗逆性強(qiáng)，其抑菌特點(diǎn)也可以作為一種獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在某些情況下，乳酸菌生物膜可能會(huì)提高食品的品質(zhì)，因?yàn)槠洚a(chǎn)生的某些物質(zhì)（如某些奶酪中的乳酸菌生物膜產(chǎn)生的醛類和酮類物質(zhì)）會(huì)改變食品原始的香氣和質(zhì)地[67-68]。如果能利用好成膜的乳酸菌，其在食品工業(yè)中的潛力同樣是巨大的[69]。

3.1 乳酸菌生物膜的抑菌作用

目前對(duì)乳酸菌生物膜應(yīng)用研究較多的是其抑菌方面，乳酸菌的成膜能使乳酸菌對(duì)多種與其產(chǎn)生拮抗作用的病原菌產(chǎn)生抑制。有研究表明，乳酸菌生物膜能控制單核細(xì)胞增生李斯特菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）和大腸桿菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）的生長(zhǎng)[70]。這使其可能應(yīng)用于食品工業(yè)中以抑制有害菌的生長(zhǎng)，如使用L. sakeiCRL1862作為一種環(huán)保型衛(wèi)生劑，可以減少或抑制用于肉類加工設(shè)施非生物表面上的單核細(xì)胞增生李斯特菌生物膜，避免即食食品在加工中受到污染，最終提高食品的安全性[54]。Speranza等[71]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）和彎曲乳桿菌（Lactobacillus brevis）都能形成生物膜，用乳酸菌生物膜發(fā)酵的干酪中也含有優(yōu)質(zhì)生物膜，且這些干酪中的生物膜能有效抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長(zhǎng)。Jalilsood等[72]的研究顯示，植物乳桿菌AP21能夠與幾種病原性和食物腐敗細(xì)菌（如腸炎沙門(mén)氏菌（Salmonella enteritidis）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）和嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila））結(jié)合，并抑制這幾種細(xì)菌的生長(zhǎng)。使用植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）混菌發(fā)酵也可以得到類似的抑菌效果，且該聯(lián)用處理似乎還具有獨(dú)特的抗炎特性[73]。這些都說(shuō)明乳酸菌生物膜在食源性病原體的控制和預(yù)防食物腐敗方面有著巨大的應(yīng)用潛力。

3.2 乳酸菌生物膜在發(fā)酵方面的應(yīng)用

3.2.1 發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用

雖然在食品和食品加工廠形成的生物膜通常會(huì)污染產(chǎn)品、損壞設(shè)備[74]，但在某些發(fā)酵過(guò)程中，生物膜也有可能會(huì)有利于食品技術(shù)的發(fā)展。例如，在傳統(tǒng)奶酪的生產(chǎn)中，意大利拉古薩諾（Ragusano）和法國(guó)薩勒（French Salers）奶酪都是用生牛奶制成的，而用于發(fā)酵和成熟的木桶中就有豐富的微生物生物膜，這些生物膜主要由嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、乳酸菌、乳球菌、腸球菌和亮色單體菌組成。在該情況下，生物膜是人們希望產(chǎn)生的，而且對(duì)奶酪的獨(dú)特風(fēng)味起著重要的作用[75-77]。Hu Mengxin等[78]在靜電紡絲納米纖維膜上培養(yǎng)出了植物乳桿菌的生物膜，并且發(fā)現(xiàn)與浮游乳酸菌相比，納米纖維膜上的乳酸菌生物膜有著優(yōu)良的胃腸道抵抗能力，在體外消化3 h后存活細(xì)胞數(shù)量反而增加。使用含有植物乳桿菌生物膜的納米纖維膜作為發(fā)酵劑發(fā)酵所生產(chǎn)酸奶顯示出了優(yōu)良的發(fā)酵性能，該生物膜發(fā)酵劑能夠縮短發(fā)酵時(shí)間，并且使酸奶在貨架期內(nèi)益生菌的存活率更高。該生物膜發(fā)酵劑在發(fā)酵過(guò)程中可以源源不斷地釋放出乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，有著很好的可重復(fù)利用性。

3.2.2 醋酸飲料中的應(yīng)用

因?yàn)槿樗峋锬?duì)酸和醇等不良環(huán)境的耐受性較強(qiáng)，所以生物膜發(fā)酵潛力更大，可以在更加廣泛的環(huán)境下進(jìn)行發(fā)酵[79]，如可以在更低的pH值或更高的乙醇濃度下進(jìn)行發(fā)酵。混菌發(fā)酵具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在醋酸發(fā)酵的過(guò)程中添加乳酸菌混菌發(fā)酵可能使醋的風(fēng)味和品質(zhì)更好[80]。但浮游狀態(tài)的乳酸菌不一定能耐受醋酸發(fā)酵的環(huán)境，而成膜的乳酸菌則有可能耐受這個(gè)環(huán)境，并參與混菌發(fā)酵。同理，在酵母發(fā)酵過(guò)程中，浮游的乳酸菌對(duì)乙醇的耐受性很差，但是生物膜狀態(tài)的乳酸菌則可以耐受更高濃度的乙醇，從而使乳酸菌參與酵母的混菌發(fā)酵[81]。如在米醋發(fā)酵過(guò)程中分離得到的一株植物乳桿菌和酵母菌以及醋酸菌都能形成良好的生物膜，并且能高效地產(chǎn)生乙醇和乙酸，對(duì)乙醇和pH值都有良好的耐受性，有望在發(fā)酵和釀造中應(yīng)用[82]。

3.2.3 其他方面的應(yīng)用

Rangaswamy等[83]利用德氏乳桿菌（Lactobacillusdelbrueckii）在網(wǎng)狀聚氨醋泡沫材料上形成的生物膜來(lái)發(fā)酵產(chǎn)乳酸，結(jié)果表明乳酸的生產(chǎn)速率有了明顯的提高，在很長(zhǎng)一段時(shí)間容積生產(chǎn)率可以達(dá)到5 g/（L·h）。上述發(fā)酵系統(tǒng)具有產(chǎn)率高、連續(xù)性好且穩(wěn)定的特點(diǎn)，可長(zhǎng)時(shí)間保持較高的產(chǎn)率。此外，乳酸菌生物膜還可以改善最終發(fā)酵產(chǎn)品的性能并延長(zhǎng)其保質(zhì)期，如在發(fā)酵橄欖中接種戊糖乳桿菌B281（Lactobacillus pentosusB281），乳酸菌在橄欖表面和發(fā)酵設(shè)備表面形成生物膜并大量繁殖，最終改善產(chǎn)品的理化特性和感官特性[84]。在發(fā)酵香腸中的清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）也有助于改善產(chǎn)品質(zhì)量[85]。

4 結(jié) 語(yǔ)

乳酸菌生物膜廣泛存在于生物和非生物表面，目前對(duì)于乳酸菌生物膜的結(jié)構(gòu)、成分和形成過(guò)程已經(jīng)有了比較成熟的認(rèn)識(shí)，但對(duì)于乳酸菌生物膜的調(diào)控機(jī)制并不是十分明確。由于乳酸菌生物膜在形成過(guò)程中涉及到許多基因的表達(dá)和多種機(jī)制的調(diào)控，不同的乳酸菌形成生物膜的方式不同，即使是同一種乳酸菌，在不同環(huán)境下形成生物膜的方式也可能不同，這些都給生物膜調(diào)控機(jī)制的研究帶來(lái)了困難。由于涉及基因眾多且調(diào)控復(fù)雜，因此可以考慮通過(guò)基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等手段揭示其中的機(jī)制，最新的一些研究也已經(jīng)開(kāi)始從這些方面出發(fā)進(jìn)行探索，這對(duì)乳酸菌生物膜的利用至關(guān)重要。除此以外，如何利用好乳酸菌生物膜對(duì)不良環(huán)境耐受性強(qiáng)等特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出更加獨(dú)特的發(fā)酵產(chǎn)品、縮短發(fā)酵時(shí)間、提高發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量及延長(zhǎng)發(fā)酵產(chǎn)品的貨架期，以及利用乳酸菌生物膜對(duì)有害菌的抑制作用這一特性，控制病原菌和腐敗微生物的生長(zhǎng)，從而減少食物中毒、產(chǎn)品變質(zhì)和化學(xué)試劑的使用，將是乳酸菌生物膜工業(yè)化與產(chǎn)業(yè)化的主要應(yīng)用方向。