無水?；顣r間對斑點叉尾鮰血液生化和肌肉品質的影響

李寧，白嬋，熊光權，張金木，王炬光，張程，耿勝榮，王彩霞，廖濤

（1.華中農業(yè)大學水產學院，湖北武漢 430070）（2.湖北省農業(yè)科學院農產品加工與核農技術研究所/湖北省農產品輻照工程技術研究中心，湖北武漢 430064）（3.丹江口市博奧水產品有限責任公司，湖北丹江口 442700）

斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus），屬鯰形目、鮰科，簡稱鮰魚，原產于美國，是一種溫水性魚類。具有生長周期短、高脂肪、高蛋白、豐富的氨基酸等特點，且肌間無刺，表面無鱗，深受各國漁業(yè)、消費者和加工企業(yè)喜歡。經過多年的養(yǎng)殖嘗試，我國現(xiàn)已具備了一定的規(guī)模，已經在南方大范圍養(yǎng)殖[1]。隨著生活水平的快速提高，人們更加注重食品質量和品質，味道鮮美的魚類更受人們的青睞。我國地域遼闊，如何實現(xiàn)鮮活的魚類低成本、遠距離的運輸已成為水產業(yè)十分關注的問題[2]。

低溫無水?；钸\輸是通過使用休眠技術減緩魚的應激反應和代謝速率，從而達到延長保活時間和提高運輸效率的一種冷鏈物流技術[3]。它是一種低成本、高效的綠色保活方法，無水保活運輸技術應用范圍比較廣泛，可用于魚、蝦、蟹、貝等?；钸\輸[4]。閩浙地區(qū)采用梯度降溫、充氧的方法運輸活鰻，時間長達24～33 h，存活率95%以上[5]。Ibraz等[6]采用碳酸休眠法無水?；铞a魚15 h，周翠平[7]等對二氧化碳麻醉羅非魚的無水?；钭髁搜芯?，結果表明采用二氧化碳麻醉無水?；钐幚淼牧_非魚的風味較好。范興[8]等人研究羅非魚和金昌魚的無水保活，結果表明采用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）麻醉的金昌魚可以離水運輸6 h，復蘇率100%。Jamie等[9]麻醉鱘魚在最佳條件下無水?；羁梢赃_到36 h，恢復24 h后的存活率可以達到96%。

目前魚用麻醉劑很多，包括 MS-222、丁香酚、CO2、喹哪啶、美托味酯等近30種。但許多麻醉劑存在安全隱患，沒有國家許可。而CO2沒有藥物消退期，對操作者和環(huán)境無危害[10]，經CO2麻醉運輸?shù)氖秤敏~可直接在市場銷售[11]，是FDA允許使用的麻醉劑[12]，因而CO2麻醉運輸具有極高的經濟和研究價值。目前，雖然有關無水?；钸\輸?shù)南嚓P研究較多，但系統(tǒng)分析二氧化碳?；钋昂髮︳~體生化指標和品質的研究較少。本文探索了CO2休眠斑點叉尾鮰無水保活所需的較佳條件，并分析了不同保活時間對鮰魚血液生化指標和魚肉品質的影響，旨在揭示斑點叉尾鮰不同?；顣r間下的新陳代謝情況，以探索出較為合適的運輸時間，可以為提高淡水魚無水保活運輸?shù)拇婊盥?、降低運輸成本提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品及儀器

實驗用斑點叉尾鮰的體重：430.5±35.5 g，體長：33.4±2.5 cm，全部購買于湖北省武漢市白沙洲農副產品大市場。實驗時挑選體重相當，外表健康、活動力正常的斑點叉尾鮰。

1.1.1 試劑

二氧化碳，工業(yè)純，購自武漢子晗工業(yè)氣體有限公司；硼酸，硫酸，氫氧化鈉，鹽酸，硫酸銅等試劑均為分析純，購自上海國藥集團化學試劑有限公司。肌糖原試劑盒，谷草轉氨酶試劑盒，尿素氮試劑盒，乳酸脫氫酶，肌酐試劑盒，丙酮酸激酶均買自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器

LRH-250CL低溫生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器公司；3k15高速冷凍離心機，美國 Sigma公司；FD5-Serious真空冷凍干燥機，GOLD SIM儀器公司；SPARK酶標儀，瑞士TECAN儀器公司；K9860全自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器公司；哈西多功能 pH計，上海哈西分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

（1）實驗選取停食48 h的健康有活力的斑點叉尾鮰，通過優(yōu)化二氧化碳休眠條件，得出最佳的麻醉液溫度、濃度和保活溫度。（2）在最佳的條件下進行休眠和保活鮰魚，探索出不同?；顣r間（5、7、9、11和13 h）的存活率以及?；顣r間對鮰魚血液生化指標和肌肉品質的影響，并分別測定麻醉前（設為對照組）、?；钜约皬吞K后（置于清水中24 h）各生化指標的變化，設定3個平行組，每個平行10尾魚。

1.2.2 不 同麻醉液溫度對斑點叉尾鮰 存活時間的影響

試驗組設置6個麻醉液溫度，分別為2、4、6、8、10和12 ℃各組通入二氧化碳使鮰魚進入深度休眠后放入?；畲⒊淙爰冄?，放入6 ℃培養(yǎng)箱中，記錄不同?；顣r間下的存活率。

1.2.3 不 同二氧化碳濃度對斑點叉尾鮰 復蘇率的影響

試驗組設置6個濃度，分別為400、450、500、550、600、650 mg/L，每組浸浴15 min后放入?；畲谐淙爰冄?，于6 ℃生化培養(yǎng)箱中?；睿? h后取出放入清水中，觀察存活數(shù)并記錄各組的存活率。

1.2.4 不 同?；顪囟葘Π唿c叉尾鮰 復蘇率的影響。

將斑點叉尾鮰放入CO2濃度為550 mg/L的水溶液中，浸浴15 min后將魚裝進?；畲淙爰冄?，每組分別放入0、2、4、6、8和12 ℃的培養(yǎng)箱中，5 h后取出放入清水中，觀察存活數(shù)并記錄存活率。

存活率（%）=復蘇24 h后存活魚的數(shù)量/初始魚尾數(shù)量×100%

1.2.5 不 同保活時間下對斑點叉尾鮰 復蘇率的影響

將鮰魚放入二氧化碳麻醉液550 mg/L，水溫6 ℃的玻璃缸中，浸浴時間15 min，鮰魚進入深度休眠后，然后將魚取出放入保活袋充入純氧，每組10尾魚，于6 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中分別保活5、7、9、11、13 h后取出放入清水中，記錄24 h后的存活率。

1.2.6 保 活時間對鮰 魚血液生化指標的影響

在最佳的實驗條件下對魚進行麻醉，每組魚進行尾部靜脈抽血，大約取5 mL注入離心管中，在4 ℃下靜止2 h，用離心機離心10 min，離心力為1780 g，取上清液置于-20 ℃冰箱中備用。本實驗中血液生化指標均使用試劑盒測定。

1.2.7 ?；顣r間對魚肉品質指標的影響

持水力：參考李念文等[13]方法進行測定；取 5 g魚肉塊（W1），放入雙層濾紙之間，裝入離心管中，在離心力1664 g下離心10 min。離心完畢后立即對樣品進行稱量（W2），重復3次，取平均值。

pH：取絞碎均勻的魚肉樣品5 g于錐形瓶中，加入45 g蒸餾水，充分混勻靜止30 min，取上清液測定[14]。

蛋白質的測定參照GB/T 5009.5-2016[15]的凱氏定氮法進行測定；

脂肪的測定參照GB/T 5009.6-2016[16]中的索氏抽提法進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均平行測定 3次，結果用平均值±標準差（SD）表示。使用MS Excell 2010軟件對數(shù)據(jù)進行整理，用SAS.V8對各組數(shù)據(jù)間的差異顯著性進行分析（p＜0.05）；使用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 較佳麻醉液溫度的確定

圖1 不同麻醉液溫度對存活率的影響Fig.1 Effects of different anesthetic temperatures on survival rate

不同麻醉液溫度下對斑點叉尾鮰存活率的影響結果見圖 1，結果表明，隨著?；顣r間的延長，存活率顯著下降，水溫從2 ℃增加到10 ℃增加，存活率先增加后降低，當水溫是6 ℃時，?；? h后的存活率為100%，?；? h的存活率為75%，遠遠高于其它組。與其它麻醉液溫度相比，最佳麻醉液水溫是6 ℃。

2.2 鮰魚無水保活較佳CO2濃度的確定

圖2 不同二氧化碳濃度對存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of carbon dioxide on survival rate

不同濃度的CO2麻醉液對斑點叉尾鮰存活率的影響結果見圖 2。隨著二氧化碳濃度的升高，?；?5 h后，存活率先增加后降低，CO2濃度為400、450 mg/L時，存活率為80%和95%；CO2濃度為500、550 mg/L時，存活率為100%；而當麻醉液濃度為600、650 mg/L時，存活率分別為88%和65%，所以從?；顣r間和存活率來看，較佳CO2濃度范圍為500～550 mg/L。

2.3 鮰魚無水?；钶^佳溫度的確定

CO2麻醉斑點叉尾鮰無水?；钪?，?；顪囟仁怯绊戸t魚存活率的一個重要因素。當保活溫度為0～8 ℃，?；顣r間可以達到5 h，但溫度達到10 ℃時，只能?；? h左右就蘇醒了，當溫度升到15 ℃時，半小時內全部蘇醒。將保活后的魚置于清水中24 h，0 ℃的存活率為10%，2 ℃的存活率為30%，4～8 ℃之間存活率為95%以上。說明在4～8 ℃條件下，鮰魚保活的存活率較高。

究其原因，溫度升高時，二氧化碳氣體揮發(fā)的快，麻醉減弱，容易蘇醒，最終?；顣r間減短，Peters等[17]人發(fā)現(xiàn)鯰魚在隨著溫度的升高，無水?；顣r間越短，所以當溫度大于8 ℃時，保活時間變短。當溫度降低時，由于鮰魚耐低溫性較差，低溫會對魚體造成不可逆的損傷[21]。因此，選擇最佳的?；顪囟葘︳~的?；钸\輸十分有意義，能延長魚的?；顣r間。

2.4 不同的?；顣r間對鮰魚存活率的影響

在較佳的麻醉和?；顥l件下，模擬鮰魚的無水?；钸\輸，得出不同保活時間下的存活率。隨著?；顣r間的延長存活率逐漸下降，9 h時存活率仍為95%；達到11 h后存活率驟減為45%，?；?3 h后存活率僅為20%。在此條件下最長無水?；铛t魚的時間是9 h左右，基本能滿足省內運輸。

二氧化碳麻醉鮰魚后，會影響魚體的呼吸代謝過程，導致魚體內二氧化碳排不出，氧氣無法與血紅蛋白結合[18]，當魚體離水時間過長時，會對腎臟、肝臟等器官造成不可逆的損傷，死亡率增大，選擇合適的保活時間對存活率至關重要。

2.5 ?；顣r間對鮰魚的血液生化指標的影響

2.5.1 鮰魚血液中谷草轉氨酶（GOT）活力的變化

GOT主要存在于肝臟內，通常GOT含量在魚體內保持比較低的范圍，但當魚體受到強烈刺激時，GOT會從肝臟釋放到血液中，故GOT含量的變化可作為肝臟受損程度的檢測指標[19]。在不同的?；顣r間下變化如下圖，隨著?；顣r間的延長，GOT活性增高，分別比?；钋霸龈?0.23%、60.56%、90.44%、160.45%。在清水中復蘇24 h后，GOT含量明顯下降，?；?h的基本恢復到對照組的水平，但?；?1 h后，與對照組值差異顯著（p＜0.05），是復蘇組中活性最高的。Harikrishnan等[20]認為強烈的應激和疾病環(huán)境會造成魚體腎臟、肝臟的破壞，可能導致腎臟中谷丙轉氨酶（GPT）和 GOT的活性增加。周傳鵬等[21]認為應激會導致魚類肝臟受損，伴隨著血清中 GOT和谷丙轉氨酶活性的增加，他們的結論與本試驗的結果一致。

圖3 ?；顣r間對谷草轉氨酶的影響Fig.3 The effect of keep alive time on transaminase of gluten grass

2.5.2 ?；顣r間對乳酸脫氫酶（LDH）活性的影響

圖4 ?；顣r間對乳酸脫氫酶的影響Fig.4 Effect of keep alive time on lactate dehydrogenase

乳酸脫氫酶是一種糖酵解酶，在缺氧條件下能夠將丙酮酸轉化成乳酸，當機體受到外界某種應激，乳酸脫氫酶活力會升高[22]。如圖4所示，?；?、7、9和11 h后血清中乳酸脫氫酶含量都顯著高于未處理前的值（p＜0.05），分別上升 30.53%、32.33%、37.38%和58.40%，?；顣r間達到11 h時，乳酸脫氫酶含量驟增。清水中復蘇24 h后，?；?、7、9 h基本恢復麻醉前的水平。這與聶小寶等[19]人研究的低溫無水狀態(tài)下LDH的變化趨勢一致。

2.5.3 保活時間對尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）的影響

血液中的肌酐和尿素氮含量都反映了腎臟功能的好壞。當腎功能受到損害時，血液中尿素氮和肌酐含量會升高。不同?；顣r間對尿素氮和肌酐的影響結果如圖5和圖6所示，無水?；顣r間越長，鮰魚血液中尿素氮和肌酐濃度越高，?；?、7、9和11 h后的尿素氮濃度分別比麻醉前高33.38%、39.67%、46.23%、76.85%，表明?；钸^程中鮰魚的代謝物沒有被有效地排出體外，導致魚體的尿素氮和肌酐含量升高，并且對魚體的腎臟造成損傷；清水中復蘇24 h后，保活5、7、9 h后尿素氮和肌酐的活性和麻醉前無顯著性差異（p＞0.05），而?；?1 h，復蘇后體內肌酐含量比麻醉前高40.05 mmol/L，說明無水?；? h對鮰魚腎臟功能造成的損傷可恢復到對照水平，可將保活 5～9 h視為最佳?；顣r間。這與低溫?；顖F頭魴中尿素氮的變化趨勢是一致的[18]，隨著?；顣r間的延長，尿素氮濃度越高，超過一定限度時，魚會死亡。劉偉東[23]等人對大菱鲆低溫無水?；畹难芯堪l(fā)現(xiàn)，在?；钸^程中，大菱鲆的肌酐含量是增加的，低溫無氧環(huán)境對大菱鲆腎臟功能會造成損傷，與本文實驗結果一致。

圖5 保活時間對尿素氮的影響Fig.5 Effect of keep alive time on urea nitrogen

圖6 保活時間對肌酐活性的影響Fig.6 Effect of keep alive time on creatinine activity

2.5.4 ?；顣r間對丙酮酸激酶（Pk）的影響

丙酮酸激酶又稱磷酸丙酮酸激酶，是糖代謝系統(tǒng)中催化三磷酸腺苷（ATP）反應的酶。它能使磷酸烯醇丙酮酸和二磷酸腺苷（ADP）合成ATP和丙酮酸，這是糖轉化過程中的限速酶之一，對新陳代謝進行調節(jié)，起到保護機體的作用[24]。如下圖7所示，且隨著無水保活時間的延長，鮰魚血液中的丙酮酸激酶活性逐漸上升，?；?、7、9和11 h后比麻醉前分別增加了42.22、48.57、45.74和63.87 U/L。無水?；钸^程中，?；顪囟? ℃遠低于室溫，鮰魚通過糖酵解過程為抵御寒冷提供大量能量，因此在進行無水保活后，鮰魚體內的丙酮酸激酶活性遠遠高于麻醉前。這表明無水保活時間越長，鮰魚所需要的能量越多，在休眠狀態(tài)下通過糖酵解所獲得的能量就越多。在復蘇24 h后，鮰魚血液中丙酮酸激酶的活性回落。

圖7 ?；顣r間對丙酮酸激酶活性的影響Fig.7 The effect of keep alive time on the activity of pyruvate kinase

綜上所述，魚類血液生理生化指標與低溫無水?；顣r間長短密切相關，而血液生理生化指標的變化可以反映機體的代謝和生理狀況。正常狀態(tài)下，血液中GOT活性較低，只有當組織細胞發(fā)生破壞和損害時，才會引起血液內轉氨酶活性增強。本研究發(fā)現(xiàn)，當?；顣r間達到11 h時，鮰魚體內GOT活性驟然升高，說明低溫無水?；顣r間過長對鮰魚的肝臟產生了一定的損傷，并進一步影響了腎臟和心肌細胞的代謝，導致血清中BUN和Cr活性的增加。在無水休眠狀態(tài)下，無氧呼吸造成鮰魚體內乳酸含量升高，進而也會影響代謝廢物排不出體外。這些可能都是無水?；钸^程中魚體死亡的原因。相似結果在羅非魚（Oreochromis niloticus）[25]和大菱鲆(Scophthalmus maximus)[11]均有報道。

2.6 保活時間對斑點叉尾鮰肌肉營養(yǎng)成分的影響

2.6.1 ?；顣r間對肌糖原的影響

肌糖原是用來維持機體新陳代謝，是魚體能量的主要來源，主要存在于肝臟和肌肉中。在無氧呼吸的狀態(tài)下，肌糖原會被分解用于身體機能的運轉。由圖8可見，低溫?；顝? h到7 h時，肌糖原的含量變化不顯著；當?；?9～11 h時，肌糖原的含量降低顯著（p＜0.05）。低溫休眠狀態(tài)，新陳代謝緩慢，糖原分解速度慢，隨著?；顣r間延長，CO2揮發(fā)，休眠減弱，新陳代謝加快導致糖原分解速度加快，所以5～7 h下降緩慢，9～11 h下降顯著。清水中復蘇24 h后，肌糖原含量還在持續(xù)降低，因為在整個實驗中，實驗魚體均未進食，為了維持正常的生命活動，魚體消耗肌糖原，解決自身的供能問題[26]。周翠平[7]羅非魚的二氧化碳麻醉?；钪邪l(fā)現(xiàn)，低溫無水保活時，肌糖原含量

2.6.2 ?；顣r間對肌肉pH、持水性、粗脂肪、蛋白質含量的影響下降，當糖原含量的消耗超過耐受程度時，羅非魚會大量死亡，與本試驗結論一致。

圖8 ?；顣r間對肌糖原的影響Fig.8 Effect of keep alive time on muscle glycogen

表1 ?；顣r間對鮰魚蛋白質、粗脂肪、持水性和pH含量的影響（冬季）Table 1 Effects of keep alive time on protein, crude fat, water holding capacity and pH (winter)

新鮮的魚肉pH偏弱堿性，pH值急劇降低會影響魚肉的新鮮度[27]。如表1所示無水?；詈髉H會低于對照組（p＜0.05），表明此時機體內無氧代謝升高，導致乳酸含量增加，pH值分別下降0.33、0.42、0.79、0.83。Pottinger[28]等認為肌肉中磷酸肌酸的損耗，乳酸和糖原的積累，也會導致pH值下降。在放入清水中復蘇的過程中，魚體進行有氧呼吸，魚體內的乳酸被乳酸脫氫酶催化轉化，導致其pH升高，與未處理組無顯著性差異（p＞0.05）。?；顣r間一定時，pH 基本能恢復到原始水平，這與楊興等[29]人對鱘魚進行低溫無水?；畹募∪馄焚|的研究結果相似。

魚體的營養(yǎng)部位為肌肉，肌肉中主要成分是水分、蛋白質、脂肪等。目前，已有學者研究了?；钸^程中魚類肌肉中的基本營養(yǎng)成分，無水保活中魚肉內蛋白質、粗脂肪會有一定程度的消耗[30]。?；顣r間對鮰魚肌肉粗脂肪和蛋白含量、持水力的影響結果如表3所示。隨著無水?；顣r間的延長，蛋白質和粗脂肪呈逐漸下降趨勢，蛋白質分別降低了2.2%、2.6%、4.1%、6.3%，脂肪分別降低了0.86%、1.28%、1.27%、3.34%。在?；钸^程中，鮰魚不能攝食，為了維持魚體代謝，粗脂肪和蛋白質作為供能物質被消耗，導致?；钸^程中魚體肌肉蛋白質和脂肪含量的下降。清水中恢復24 h后，水溫升高，無氧呼吸變成有氧呼吸，新陳代謝加快，耗能增加，導致粗脂肪和蛋白質分解產生能量。?；顣r間為9 h，恢復24 h后脂肪和蛋白質下降最緩慢。持水力是指肌肉保持水的能力，主要與蛋白質三維網狀結構和變性程度相關[31]，由表1可知，?；钸^程中持水力無顯著性下降，表明低溫無水?；钸^程中，蛋白質并沒有變性。清水中復蘇24 h后，?；? h的基本恢復至對照組水平，但保活11 h的鮰魚與對照組相比差異顯著（p＜0.05），下降了7.21%。何菊登等[32]研究發(fā)現(xiàn)，與未受到應激的個體相比，大西洋鱈肌肉的含水量顯著降低，說明應激會導致肌肉含水量下降。與本試驗中低溫麻醉會導致魚體產生應激持水力下降的結果基本一致。

3 結論

3.1 本文探討出鮰魚的較佳?；顪囟?～8 ℃、CO2的濃度為500～550 mg/L以及麻醉液溫度6 ℃。在較佳條件下將鮰魚分別進行無水保活5、7、9、11和13 h后，再移入清水中恢復 24 h存活率分別為 100%、100%、95%、45%和20%，所以?；顣r間在9 h以內，存活率達95%以上。

3.2 在低溫無水環(huán)境中，保活一定時間后血液中谷草轉氨酶、乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶、肌酐和尿素氮活力與對照組相比明顯升高（p＜0.05），而肌糖原濃度明顯下降（p＜0.05），當季暫養(yǎng)水溫中恢復24 h后，?；? h的鮰魚血液活性指標基本都回到對照組狀態(tài)，但?；顣r間11 h的鮰魚復蘇后谷草轉氨酶、尿素氮、肌酐活性依然顯著高于對照組水平（p＜0.05），表明無水保活時間過長會對鮰魚肝臟、腎臟造成永久損傷，所以?；?1 h的魚體存活率很低。無水保活后，肌肉主要成分指標持水性、粗脂肪、蛋白質和pH值稍低于對照組，而?；?1 h的鮰魚，粗脂肪和pH值下降顯著（p＜0.05）。清水中恢復24 h后，代謝速率加快，無氧呼吸變成有氧呼吸，持水性和pH上升，粗脂肪、肌糖原等供能物質含量降低。綜上所述，二氧化碳無水?；铛t魚的過程中，保活時間會對血液生化指標和肌肉品質造成一定的影響。當?；顣r間過長時，會對魚體造成不可逆的損傷，從而影響存活率。本文的研究結果為二氧化碳麻醉無水?；钸\輸技術提供了理論支撐。