改良小培養(yǎng)技術(shù)在黃柄曲霉形態(tài)學(xué)觀察中的應(yīng)用

馮長海

（上海皓信生物科技有限公司，上海 201109）

曲霉屬是臨床常見的一類條件致病性真菌，可根據(jù)其形態(tài)、生理和系統(tǒng)發(fā)育特征進行鑒定與分類，形態(tài)學(xué)由真菌的菌落特征及其鏡下結(jié)構(gòu)特征組成，其中分生孢子頭的形狀，小梗單層還是雙層，梗莖、頂囊、小梗及孢子的顏色、大小、形狀、質(zhì)地，是否存在殼細胞、閉囊殼、子囊和子囊孢子是曲霉的重要鏡下結(jié)構(gòu)特征，也是鑒定曲霉的重要依據(jù)。黃柄曲霉是少數(shù)可產(chǎn)粉孢子的曲霉[1-2]，可導(dǎo)致免疫功能不全兒童感染引發(fā)皮膚曲霉病，還可引起骨髓炎、耳真菌病、甲真菌病和椎間盤炎等[2-3]。本研究采用自制玻片進行黃柄曲霉的小培養(yǎng)試驗，探討改良小培養(yǎng)技術(shù)在黃柄曲霉微觀形態(tài)學(xué)觀察中的價值。

1 材料和方法

1.1 材料

乳酸酚棉蘭、PDA培養(yǎng)基（英國Oxoid公司），離心管（50 mL規(guī)格）、無菌水、小培養(yǎng)玻片和一次性無菌加樣槍頭（上海皓信生物科技有限公司），實驗用黃柄曲霉（上海市公共衛(wèi)生臨床中心贈送），黃柄曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株KP281443株序列相似度100%（北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序）。

1.2 方法

將實驗用黃柄曲霉菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，室溫培養(yǎng)，待菌株成熟后備用。將小培養(yǎng)玻片凹面朝上，放置于生物安全柜內(nèi)臺面上，紫外線照射30 min后備用。用加樣槍吸取已融化的PDA培養(yǎng)基25 μL注入在玻片中央凹槽，待瓊脂凝固后，在中央凹槽紅點處接種黃柄曲霉，蓋上蓋玻片，在蓋玻片藍點處用固封劑固定蓋玻片。將接種了菌株的玻片平放于內(nèi)含1滴蒸餾水的50 mL離心管中，25 ℃條件下培養(yǎng)。每日鏡檢觀察黃柄曲霉的形態(tài)生長變化，待菌株生長成熟（曲霉特征結(jié)構(gòu)大量出現(xiàn)）后，用乳酸酚棉蘭染液沿玻片與蓋玻片間縫隙緩慢加入，顯微鏡觀察、拍照。見圖1。

圖1 改良小培養(yǎng)技術(shù)操作示意圖

2 結(jié)果

黃柄曲霉25 ℃培養(yǎng)4 d后觀察可見：菌絲透明、有隔；分生孢子頭呈松散放射狀或放射狀；頂囊匙形或梨形，基部收縮；小梗單層或雙層，覆蓋頂囊1/2至1/3；分生孢子球形或近球形，壁光滑；分生孢子梗透明至淺棕色，梗壁光滑、無隔或偶見有隔；粉孢子球形或近球形、偶見橢圓形或倒棒狀，無柄或1～4個著生于孢子梗上；可見不完全產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。見圖2。

圖2 黃柄曲霉25 ℃培養(yǎng)4 d鏡下圖（ ×1000）

3 討論

小培養(yǎng)法是Emile Rivalier和S.Seydel于1932年報道的一種研究絲狀真菌生命活動的培養(yǎng)方法，可有效地觀察絲狀真菌的產(chǎn)孢過程。通過真菌孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及菌絲的形態(tài)特征，三者相互間的位置排列關(guān)系，結(jié)合絲狀真菌常規(guī)培養(yǎng)的特征，或結(jié)合真菌的生理生化特征，可進行絲狀真菌的形態(tài)學(xué)鑒定。傳統(tǒng)小培養(yǎng)方法或小培養(yǎng)改良方法多是將真菌培養(yǎng)基置于觀察載體平面（載玻片或類似物）上，接種真菌后覆蓋蓋玻片或類似物，送入孵箱進行培養(yǎng)[4-7]。采用此類方法時，如果直接鏡檢，因蓋玻片和載玻片間距離較大，就會出現(xiàn)菌體重疊，不易獲得較好的真菌圖片；如果揭離蓋玻片后制片鏡檢，因在揭片過程中真菌孢子的自然生長狀態(tài)遭到人為破壞，會導(dǎo)致菌體結(jié)構(gòu)不完整，背景雜亂，成像效果不佳。即使技術(shù)嫻熟的操作人員，要獲得清晰、典型、完整的真菌圖片，往往也需要大量制片。本法是在觀察載體平面（載玻片）內(nèi)部進行真菌培養(yǎng)，較易獲得清晰、典型、完整的真菌圖片。

《美國臨床微生物手冊（第11版）》[8]提供了16個臨床相關(guān)曲霉種的重要形態(tài)結(jié)構(gòu)特征圖解，可作為臨床相關(guān)曲霉種的形態(tài)學(xué)鑒定方法，該手冊將黃柄曲霉歸類為雙層小梗的曲霉，通過松散柱狀的分生孢子頭、白色至淺棕色的分生孢子和棕黃色至黃色至無色的分生孢子梗的表型特征，可快速鑒定黃柄曲霉。但黃柄曲霉并非只有雙層小梗，還有單層小梗，應(yīng)屬單層和雙層小梗均有的曲霉分類。當(dāng)黃柄曲霉單層和雙層小梗均出現(xiàn)時，采用該手冊提供的方法就會無法進行鑒定。黃柄曲霉是除土曲霉外少數(shù)具有粉孢子的曲霉[1-2]，利用此特性，結(jié)合其分生孢子梗顏色等其他鏡下或菌落特征，可進行黃柄曲霉的輔助鑒定。同樣，黃柄曲霉不完全產(chǎn)孢現(xiàn)象和單層小梗的發(fā)現(xiàn)，深化了黃柄曲霉的形態(tài)學(xué)認(rèn)識，表明改良小培養(yǎng)技術(shù)在黃柄曲霉形態(tài)學(xué)鑒定中具有較好的應(yīng)用價值。

綜上所述，黃柄曲霉的鏡下結(jié)構(gòu)特征是其形態(tài)學(xué)鑒定的重要依據(jù)，改良小培養(yǎng)方法可清晰地觀察到黃柄曲霉的結(jié)構(gòu)特征，是較好的一種真菌形態(tài)學(xué)研究技術(shù)。