靶向捕獲高通量測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)早期乳腺癌胚系突變中的應(yīng)用價(jià)值

袁牧歌，吳文堅(jiān)，胡朝暉，陳嘉昌，于世輝，歐小華，毛琳琳，吳海艷

（1. 廣州市金圻睿生物科技有限責(zé)任公司，廣東 廣州 510000；2. 廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院，廣東 廣州 510000）

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的腫瘤之一，也是女性因癌癥死亡的主要原因[1]。每年全球有100多萬(wàn)人被確診患有乳腺癌，女性死亡例數(shù)超過(guò)40萬(wàn)，占癌癥死亡總數(shù)的14%[2]?；蛲蛔兪侨橄侔┑闹匾∫蛑?，目前美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（the National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南[3]收錄的21個(gè)基因是被普遍認(rèn)同的乳腺癌易感基因。易感基因的檢測(cè)在乳腺癌的預(yù)防和診治過(guò)程中具有重要意義，能夠指導(dǎo)個(gè)體化治療。相對(duì)于Sanger測(cè)序，靶向捕獲高通量測(cè)序技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)快速、精準(zhǔn)、低成本的基因檢測(cè)，同時(shí)也能對(duì)多個(gè)基因和未知序列進(jìn)行同步測(cè)序。本研究旨在檢測(cè)早期乳腺癌患者的胚系突變，分析突變與病理學(xué)特征的相關(guān)性，進(jìn)而指導(dǎo)乳腺癌的臨床診治過(guò)程。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理診斷確診的99例臨床進(jìn)行化療的早期乳腺癌女性患者，年齡31～66歲，收集所有患者手術(shù)前1～3 d的血漿標(biāo)本。本研究獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院和金域醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且受試者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 易感基因胚系突變檢測(cè) 采用QIAamp DNA提取試劑盒（德國(guó)凱杰公司）提取血漿標(biāo)本，采用NanoDrop 2000超微量分光光度儀（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）分析其純度和濃度，保留吸光度（A）260/280為1.8～2.0、濃度為50 ng/μL及以上的標(biāo)本。采用KAPA文庫(kù)制備試劑盒（瑞士羅氏公司）制備文庫(kù)，并用Qubit 3.0熒光定量?jī)x（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）測(cè)定其濃度。向文庫(kù)中加入xGen Universal Blockers—TS Mix和Human Cot-1 DNA封閉文庫(kù)（上海納昂達(dá)生物科技有限公司），將其至于真空抽濾系統(tǒng)干燥成干粉，按照xGen Lockdown Reagents（上海納昂達(dá)生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行雜交捕獲，采用金域醫(yī)學(xué)中心設(shè)計(jì)的21個(gè)乳腺癌基因探針進(jìn)行基因檢測(cè)，這21個(gè)基因是NCCN指南[3]收錄的乳腺癌易感基因，分別為：ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CHEK2、MSH2、MLH1、MSH6、PMS2、EPCAM、NBN、NF1、PALB2、PMS1、PTEN、RAD51C、RAD51D、STK11、TP53。用Qubit 3.0熒光定量?jī)x測(cè)定其捕獲后文庫(kù)濃度。采用Illumina Nextseq 550 system（美國(guó)Illumina公司）對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.2 突變位點(diǎn)篩選和分類策略 去除非編碼區(qū)突變和同義突變；對(duì)比dpSNP數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組、EXAC數(shù)據(jù)庫(kù)保留頻率＜0.2%的變體；去除低等位基因頻率變異（＜30%）。根據(jù)《遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》[4]對(duì)篩選后的胚系突變進(jìn)行分類，分為致病、疑似致病、意義不明、疑似無(wú)害、無(wú)害5類。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 早期乳腺癌患者血漿胚系突變結(jié)果

99例早期乳腺癌患者中，有48例患者檢測(cè)出18個(gè)基因的55個(gè)突變位點(diǎn)，其中包含45個(gè)錯(cuò)義突變、1個(gè)無(wú)義突變、8個(gè)插入缺失突變、1個(gè)剪切位點(diǎn)突變，其中BRCA1（p.R504C）和BRIP1（p.L340F）位點(diǎn)分別各有2個(gè)標(biāo)本突變。BRCA基因檢測(cè)出10個(gè)突變位點(diǎn)，包含5個(gè)錯(cuò)義突變、1個(gè)無(wú)義突變、4個(gè)缺失突變。見(jiàn)表1。BRCA1突變患者5例（5.0%）；BRCA2（6.1%）突變患者6例，其中4例是三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）。本研究新發(fā)現(xiàn)的15個(gè)突變位點(diǎn)在ExAC、ClinVar、dbSNP、HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中均未提及。見(jiàn)圖1和表2。

表2 15個(gè)新發(fā)現(xiàn)的胚系突變位點(diǎn)

55個(gè)突變中有9個(gè)（16.4%）為致病性突變（6個(gè)插入缺失突變、1個(gè)無(wú)義突變、1個(gè)剪切位點(diǎn)突變、1個(gè)錯(cuò)義突變）、4個(gè)（7.3%）無(wú)害突變、42個(gè)（76.3%）意義未明突變。9個(gè)致病性胚系突變位點(diǎn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 9個(gè)致病性胚系突變位點(diǎn)

2.2 胚系突變與臨床病理特征的相關(guān)性

99例乳腺癌患者中，3例無(wú)分子分型和人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor，HER-2）的記錄，1例無(wú)組織學(xué)分級(jí)和腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)（tumor infiltrating lymphayte，TIL）的記錄，1例無(wú)病理分期（TNM）的記錄。胚系突變?cè)谒胁煌R床病理特征中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），致病性突變?cè)诓煌挲g、不同增殖細(xì)胞核抗原（Ki67 antigen，Ki67）狀態(tài)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 99例乳腺癌患者中致病性突變與臨床病理特征的關(guān)系 例

3 討論

與傳統(tǒng)Sanger測(cè)序相比，靶向捕獲高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乳腺癌21個(gè)易感基因的全外顯子區(qū)域突變位點(diǎn)更加快捷、高效，可彌補(bǔ)其成本高、耗時(shí)長(zhǎng)等缺陷[5]。目前，乳腺癌易感基因檢測(cè)缺乏熱點(diǎn)區(qū)域，所檢測(cè)的基因片段較長(zhǎng)，因此高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)揮了巨大作用，該技術(shù)能夠在分子水平檢測(cè)到腫瘤易感基因、驅(qū)動(dòng)基因、耐藥基因及信號(hào)通路等，從而可以給予患者更加精準(zhǔn)的個(gè)體化治療。

BRCA1和BRCA2是2個(gè)主要的乳腺癌易感基因，其在DNA修復(fù)、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和泛素化中起重要作用[6]。通過(guò)BRCA1、BRCA2基因突變檢測(cè)，篩查出高風(fēng)險(xiǎn)人群，可以做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療[7]。BRCA1、BRCA2是胚系突變最多的基因，在本研究的99例患者中，11例患者（11.1%）發(fā)生了BRCA1、BRCA2突變，其中發(fā)生致病性BRCA突變的患者為4例。相關(guān)專家共識(shí)[8]建議，臨床優(yōu)先考慮使用多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（AOP-ribose） ploymerase，PARP]抑制劑，如奧拉帕尼，對(duì)發(fā)生致病性BRCA突變的患者進(jìn)行靶向治療。BHASKARAN等[9]關(guān)于3萬(wàn)多例中國(guó)乳腺癌和卵巢癌患者BRCA1、BRCA2胚系突變的研究結(jié)果與本研究高度相似。本研究中，有48例患者檢測(cè)出胚系突變，在非BRCA1、BRCA2基因中，BARD1的突變最為常見(jiàn)，其次是ATM和NF1；有8例（8.1%）患者至少有1個(gè)乳腺癌易感基因的有害突變，除BRCA外，分別是ATM、BARD1、NBN、PALB2。對(duì)于ATM和NBN致病性突變的患者，建議每年進(jìn)行1次乳房X線檢查，并考慮從40歲開(kāi)始進(jìn)行對(duì)比性乳腺磁共振成像[3]。PALB2致病性突變的患者對(duì)側(cè)乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加，建議對(duì)這些患者進(jìn)行乳腺磁共振成像篩查[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，21個(gè)乳腺癌易感基因發(fā)生非致病性胚系突變，在以40歲為界限的不同年齡組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示40歲之后可能發(fā)生致病性突變的概率顯著增高，建議40歲開(kāi)始將乳腺癌易感基因的篩查納入體檢中。非致病性胚系突變?cè)贙i67陽(yáng)性與否的比較中差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示致病性突變患者的Ki67陽(yáng)性概率更高。Ki67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，在細(xì)胞增殖中不可缺少，主要用來(lái)判斷腫瘤的惡性程度。Ki67的數(shù)值越高，說(shuō)明細(xì)胞增殖越活躍，腫瘤生長(zhǎng)越快，組織分化越差，對(duì)化療也越敏感，Ki67通常是一個(gè)預(yù)后不良的標(biāo)志物[11]。因此，有致病性突變的乳腺癌患者可能惡性程度更高，且預(yù)后較差，但對(duì)化療較為敏感。

本研究發(fā)現(xiàn)，有38例（38.4%）早期乳腺癌患者至少有1個(gè)意義未明突變。這些變體目前沒(méi)有明確的分類研究，其中大多數(shù)最終將被重新分類，可能是無(wú)害的，也有可能是致病性的，不應(yīng)當(dāng)使用意義未明突變來(lái)做出臨床決策，應(yīng)進(jìn)一步完善分類策略，做出更好的臨床決策。

本研究存在一定局限性。首先，所有血漿標(biāo)本均來(lái)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，僅反應(yīng)相應(yīng)地區(qū)乳腺癌人群突變的流行情況；其次，本研究樣本數(shù)有限，僅能初步確定這些基因突變的頻率與臨床病理特征之間的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)了15個(gè)新胚系突變，希望這些突變能夠成為未來(lái)預(yù)測(cè)乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的新切入點(diǎn)。易感基因胚系突變的檢測(cè)能夠幫助臨床預(yù)防及診斷乳腺癌，無(wú)創(chuàng)性胚系突變檢測(cè)結(jié)合病理檢測(cè)可進(jìn)行準(zhǔn)確的臨床診斷。精準(zhǔn)用藥和靶向治療是未來(lái)可以進(jìn)一步研究的方向。