SARS-CoV-2實驗室核酸檢測要點

刁艷君，楊 柳，蘇明權(quán)，郝曉柯，劉家云

（空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710032）

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）可引起新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19），目前已在全球范圍內(nèi)廣泛流行。疫情暴發(fā)初期，因發(fā)展迅速，對疑似患者進(jìn)行快速確診是防治COVID-19的關(guān)鍵，部分獲批的核酸檢測試劑研發(fā)時間短，存在性能確認(rèn)倉促、試劑優(yōu)化不充分以及批間差異大等問題；各臨床實驗室在開展核酸檢測過程的各個環(huán)節(jié)中存在的問題也可能影響核酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文將圍繞目前SARS-CoV-2核酸檢測中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及要點進(jìn)行評述，并對實驗室核酸檢測與臨床不符假陰性和復(fù)檢陽性的問題進(jìn)行分析。

1 SARS-CoV-2核酸檢測的原理

SARS-CoV-2是一種RNA病毒，基因組序列約29 kb，擁有10個基因，可有效編碼10個蛋白。病毒由RNA和蛋白構(gòu)成，最外層是由脂質(zhì)和糖蛋白組成的包膜外衣，里面蛋白衣殼將RNA包裹在其中，從而使容易降解的RNA得到保護(hù)（圖1）。病毒通過特定細(xì)胞表面受體入侵細(xì)胞造成感染，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制。病毒核酸檢測的原理就是通過細(xì)胞裂解液，讓病毒的RNA裸露出來，然后用實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）進(jìn)行檢測。檢測原理最關(guān)鍵的是利用引物和探針來實現(xiàn)核酸序列的“靶向匹配”，即尋找SARS-CoV-2約3萬個堿基中區(qū)別于其他病毒的核酸序列（與其他病毒核酸相似度“低”的區(qū)域），設(shè)計引物和探針。引物和探針與SARSCoV-2核酸特定區(qū)域高度匹配，即特異性很強(qiáng)，一但待檢樣本實時熒光RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性，則證明該樣本中存在SARS-CoV-2。見圖2。

圖1 SARS-CoV-2病毒結(jié)構(gòu)示意

圖2 SARS-CoV-2核酸測定（實時熒光RT-PCR）的步驟

2 核酸檢測對于SARS-CoV-2檢測的意義

依據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[1]要求，臨床疑似病例應(yīng)具備以下病原學(xué)或血清學(xué)證據(jù)之一：實時熒光RT-PCR檢測SARS-CoV-2核酸陽性；病毒基因測序與已知的SARS-CoV-2高度同源；血清SARS-CoV-2特異性IgM抗體和IgG抗體陽性；血清SARSCoV-2特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性，或恢復(fù)期較急性期升高4倍及以上。因此，SARSCoV-2核酸檢測（實時熒光RT-PCR）結(jié)果陽性是確診感染的重要證據(jù)之一；但如果檢測結(jié)果為“陰性”，不能作為判斷患者未被感染的標(biāo)準(zhǔn)。有研究結(jié)果顯示，1 100例COVID-19患者在入院時接受電子計算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）檢查時，有76.4%的患者呈現(xiàn)出肺炎表現(xiàn)，主要為毛玻璃樣陰影（50.0%）和雙肺斑片狀陰影（46.4%），絕大多數(shù)重癥患者都能以此確診[2]。而根據(jù)此前專家表述的“確診患者中，核酸檢測的陽性率僅為30%～50%”來看[3]，COVID-19患者核酸檢測假陰性的比例并不低。因此核酸檢測不能作為確診感染的唯一方法。

3 實驗室進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測的條件和要求

臨床實驗室需要符合國家衛(wèi)生健康委辦公廳頒布的《關(guān)于醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展新型冠狀病毒核酸檢測有關(guān)要求的通知》[4]的要求，達(dá)到二級以上實驗室生物安全防護(hù)及三級個人生物安全防護(hù)規(guī)范并經(jīng)衛(wèi)生行政相關(guān)部門批準(zhǔn)，方可開展SARS-CoV-2核酸檢測。核酸檢測實驗室為負(fù)壓環(huán)境最為理想，應(yīng)注意壓力監(jiān)測，保持空氣流動，排除氣溶膠。核酸檢測人員必須具備相應(yīng)資質(zhì)，接受聚合酶鏈反應(yīng)相關(guān)培訓(xùn)并考核合格。實驗室應(yīng)嚴(yán)格管理，分區(qū)到位，嚴(yán)格禁止無關(guān)人員進(jìn)入。清潔區(qū)應(yīng)保持通風(fēng)，消毒到位。相關(guān)物品分區(qū)放置，潔污分離，按時更換，洗消到位。常規(guī)消毒：較大面積以含氯消毒液為主，小面積可以用75%酒精。處理氣溶膠的良好方式是開窗通風(fēng)，也可通過紫外線、過濾、空氣消毒機(jī)等方式進(jìn)行空氣消毒。

4 SARS-CoV-2核酸測定（實時熒光RT-PCR）的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和參數(shù)

盡管實驗室一般會很關(guān)注核酸“檢測”環(huán)節(jié)，但實際上核酸“提取”也是檢測成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其與病毒樣本的采集和保存密切相關(guān)。在《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》[5]中，所提到的樣本類型包含呼吸道樣本、血液樣本、糞便樣本等。對于高風(fēng)險的樣本，在核酸提取和擴(kuò)增前需要對樣本先行病毒滅活，包括（60～65）℃孵育（20～30）min，或者用試劑盒自帶的采樣液滅活和保存病毒。目前應(yīng)用最廣泛的呼吸道樣本，如鼻咽拭子等均采用第2種方式，即以核酸提取裂解液為基礎(chǔ)配制的滅活（保存）液。這種病毒保存液一方面可讓病毒的蛋白變性，失去活性，不再有傳染性，提高運輸和檢測階段的安全性；另一方面又可直接裂解病毒釋放核酸，消除核酸分解酶，防止病毒的RNA降解。以核酸提取裂解液為基礎(chǔ)配制的病毒采樣液，主要成分為平衡鹽類、乙二胺四乙酸螯合劑、胍鹽（異硫氰酸胍、鹽酸胍等）、陰離子表面活性劑（十二烷基硫酸鈉）、陽離子表面活性劑（十四烷基三甲基草酸銨）、苯酚、8-羥基喹啉、二硫蘇糖醇、蛋白酶K等幾種或多種組分。目前，核酸提取的試劑盒種類繁多，采用的核酸提取純化試劑各不相同，即使是采用相同的核酸提取純化試劑，各試劑盒的提取程序也有所不同。

截至2020年3月6日，我國國家藥品監(jiān)督管理局共應(yīng)急批準(zhǔn)SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒11個，其中實時熒光RT-PCR方法10個[6]。目前批準(zhǔn)的產(chǎn)品均基于SARS-CoV-2基因組中ORF1ab、E和N基因進(jìn)行選擇。不同產(chǎn)品的檢測原理基本一致，但是其引物、探針設(shè)計不同，有單靶區(qū)段（ORF1ab）、雙靶區(qū)段（ORF1ab、N或E）、三靶區(qū)段（ORF1ab、N和E）的檢測和判讀差別，核酸提取和實時熒光RT-PCR反應(yīng)體系應(yīng)參考相關(guān)試劑盒說明書，并建議使用者嚴(yán)格按照試劑盒說明書規(guī)定的判讀方式進(jìn)行判讀。實時熒光RT-PCR擴(kuò)增的常見區(qū)域及引物和探針序列如圖3所示。

圖3 SARS-CoV-2擴(kuò)增子靶標(biāo)在基因組上的定位及引物和探針序列

5 SARS-CoV-2核酸測定（實時熒光RT-PCR）結(jié)果判讀

《新型冠狀病毒感染的肺炎防控方案（第二版）》[7]首次明確了單個基因擴(kuò)增結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)：無Ct或Ct≥40為陰性；Ct＜37為陽性；Ct值37～40為灰度區(qū)，建議重復(fù)實驗，若重做結(jié)果Ct＜40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。之后的第三版指南[8]、第四版指南[9]延續(xù)了上述標(biāo)準(zhǔn)，但是由于商品化試劑盒選用的靶標(biāo)有所不同，上述3版指南并未給出靶標(biāo)的組合判斷標(biāo)準(zhǔn)，強(qiáng)調(diào)以廠家提供的說明書為準(zhǔn)。從第五版指南[10]開始，明確了2個靶標(biāo)，尤其是比較難判斷的單靶標(biāo)陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，即實驗室要確認(rèn)某個病例為SARSCoV-2核酸檢測陽性，需滿足以下2個條件中的1個：（1）同一份樣本中SARS-CoV-2 2個靶標(biāo)（ORF1ab、N）實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果均為陽性，如果出現(xiàn)單個靶標(biāo)陽性的檢測結(jié)果則需要重新采樣并重新檢測，如果檢測結(jié)果仍然為單靶標(biāo)陽性，則判定為陽性；（2）2種樣本實時熒光RT-PCR同時出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性或同種類型樣本2次采樣檢測均出現(xiàn)單個靶標(biāo)陽性的檢測結(jié)果，可判定為陽性。但是，指南同時強(qiáng)調(diào)核酸檢測的陰性結(jié)果不能排除SARS-CoV-2感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素，包括樣本質(zhì)量差（口咽等部位的呼吸道樣本）、樣本收集過早或過晚、沒有正確保存、運輸和處理樣本、技術(shù)本身存在問題（病毒變異、PCR抑制）等。

6 SARS-CoV-2檢測出現(xiàn)假陰性的原因

目前被關(guān)注的核酸檢測“假陰性”概念，往往是指核酸檢測結(jié)果與臨床表現(xiàn)不符的“假陰性”，即臨床癥狀及影像學(xué)結(jié)果高度疑似COVID-19，但核酸檢測多次始終為“陰性”。國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心對SARS-CoV-2檢測“假陰性”進(jìn)行了解釋[11]。（1）被感染者的細(xì)胞中有一定量的病毒。現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示機(jī)體被病毒感染后，病毒通過鼻腔和口腔進(jìn)入到咽喉部，再到氣管和支氣管，進(jìn)而到達(dá)肺泡，感染者會經(jīng)歷潛伏期、輕度癥狀、再到嚴(yán)重癥狀的過程，不同病程階段以及機(jī)體不同部位存在的病毒量有所不同。從細(xì)胞種類的病毒載量看，肺泡上皮細(xì)胞（下呼吸道）＞氣道上皮細(xì)胞（上呼吸道）＞成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等；從樣本類型來看，肺泡灌洗液（最優(yōu)）＞深咳痰＞鼻咽拭子＞口咽拭子＞血液。此外，糞便中也能檢出病毒。但是考慮操作的方便性和患者的接受程度，目前臨床常用的樣本順序是口咽部拭子＞鼻咽部拭子＞支氣管灌洗液（操作復(fù)雜）和深痰（常為干咳，難得到）。因此某些患者口咽部或鼻咽部細(xì)胞中病毒量較少或極低，如果只取口咽部或鼻咽部樣本檢測，病毒核酸就檢測不到。（2）樣本采集時未采集到含有病毒的細(xì)胞，或未有效保存病毒核酸。①采集部位不當(dāng)，如采集口咽拭子時，采集深度不夠，采集鼻咽拭子沒有采到鼻腔深處等，可能采集到的細(xì)胞絕大部分都是不含病毒的細(xì)胞；②采樣拭子使用錯誤，如拭子頭的材料推薦使用PE纖維、聚酯纖維、聚丙烯纖維等合成纖維，實際操作中使用了棉花等天然纖維（對蛋白質(zhì)的吸附較強(qiáng)，不易洗脫）和尼龍類的纖維（吸水性不佳，導(dǎo)致采樣量不足）；③病毒保存管使用錯誤，如誤用了易吸附核酸（DNA/RNA）的聚丙烯或聚乙烯塑料保存管，導(dǎo)致保存液中核酸濃度下降。實際操作中推薦使用聚乙烯-丙烯聚合物塑膠與某些特殊處理的聚丙烯塑膠容器儲存病毒核酸。（3）體外診斷試劑性能不佳。部分品牌的試劑由于研發(fā)時間短，也沒有使用已知臨床樣本進(jìn)行必要的性能確認(rèn)，可能存在對試劑優(yōu)化不充分以及試劑批間差異大等問題。此外，國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心2020年3月16—24日開展的SARS-CoV-2核酸檢測室間質(zhì)量評價[12]發(fā)現(xiàn)，各“檢測”試劑均存在與多個核酸“提取”試劑搭配使用的情況，這也是導(dǎo)致假陰性結(jié)果的主要原因。即使采用同一核酸檢測試劑，由于核酸提取試劑的不同，分析敏感性也必然會存在差異。（4）臨床實驗室操作不規(guī)范。樣本運輸保存條件、臨床實驗室的規(guī)范操作、結(jié)果判讀和質(zhì)量控制等是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的關(guān)鍵因素。國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心2020年3月16—24日開展的室間質(zhì)量評價結(jié)果顯示，收到有效結(jié)果的844家實驗室中，701家（83.1%）合格，143家（16.9%）不合格，實驗室總體檢測情況良好[13]，但不同實驗室在人員操作能力、單靶標(biāo)陽性樣本解讀能力以及質(zhì)量控制方面仍存在差異。

7 如何降低SARS-CoV-2核酸檢測假陰性

降低核酸檢測假陰性應(yīng)相對應(yīng)地從產(chǎn)生假陰性的4個方面進(jìn)行優(yōu)化。（1）被感染者的細(xì)胞中有一定量的病毒。疑似感染者不同時期，在身體不同部位，病毒濃度會有差異，如咽部沒有，可能支氣管灌洗液或糞便中有，若能同時或在疾病進(jìn)展的不同階段采集多種類型樣本進(jìn)行檢測，會有助于避免假陰性的出現(xiàn)。（2）樣本采集時要采集到含有病毒的細(xì)胞。通過加強(qiáng)對樣本采集人員的培訓(xùn)，可以在很大程度上解決該問題。（3）可靠的體外診斷試劑。通過從國家層面開展試劑的檢測性能評價研究，探討存在的問題，可以進(jìn)一步改進(jìn)試劑檢測效能，提高分析敏感性。（4）臨床實驗室規(guī)范操作。通過加強(qiáng)對實驗室人員的培訓(xùn)，不斷完善實驗室質(zhì)量管理體系、保證合理的分區(qū)、提高人員檢測的能力，可以減少因?qū)嶒炇也僮鞑划?dāng)出現(xiàn)的假陰性。

8 康復(fù)出院患者SARS-CoV-2核酸檢測復(fù)檢陽性的原因

《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[1]中明確規(guī)定，COVID-19患者治愈出院的標(biāo)準(zhǔn)之一就是連續(xù)2次痰、鼻咽拭子等呼吸道標(biāo)本核酸檢測陰性（采樣時間至少間隔24 h），但有極少數(shù)出院患者再次出現(xiàn)SARSCoV-2核酸檢測陽性，其原因是多樣的。（1）SARS-CoV-2是一個新病毒，對其致病機(jī)制、引發(fā)的疾病全貌和病程特點還需要進(jìn)一步了解，所以一方面要加強(qiáng)對出院患者的管理，進(jìn)行14 d的醫(yī)學(xué)觀察，并進(jìn)行跟蹤隨訪、健康監(jiān)測和健康指導(dǎo)，以對疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的全過程加深認(rèn)識。（2）患者有再次感染病毒的可能。鐘南山院士說：由于治愈的患者體內(nèi)有抗體，因此SARS-CoV-2再次入侵時可被抗體消滅，再次感染的幾率不大，但“不大”并不代表“不會感染”，再次感染有多方面的原因，可能是康復(fù)患者自身的原因，也可能與病毒的變異有關(guān)，甚至可能是實驗室檢測的原因。如果是病毒自身的原因，SARS-CoV-2變異可能導(dǎo)致康復(fù)患者自身產(chǎn)生的抗體對變異病毒無效，若患者再次感染變異病毒，則核酸檢測可能再次陽性。（3）就實驗室檢測方法而言，每種檢測方法都有其局限性。SARSCoV-2核酸檢測因基因序列的選擇、試劑的組成、方法的敏感程度等原因，導(dǎo)致現(xiàn)有的試劑盒均有各自的檢測下限。當(dāng)患者經(jīng)過治療后，體內(nèi)病毒減少，待檢樣本中病毒載量低于檢測下限時即會出現(xiàn)“陰性”結(jié)果，但此結(jié)果并不意味著體內(nèi)病毒完全消失，病毒有可能在停止治療后“死灰復(fù)燃”，繼續(xù)復(fù)制。因此，建議出院2～4周內(nèi)，每周復(fù)查1次。（4）核酸為病毒的遺傳物質(zhì)，患者經(jīng)過抗病毒治療后病毒被殺滅，但殘留的病毒RNA片段仍然在人體內(nèi)存留，并沒有完全從體內(nèi)排出，有時在特定的環(huán)境下，可以存留較長的時間，而在這時進(jìn)行核酸檢測，會出現(xiàn)“一過性”陽性。隨著患者恢復(fù)時間的延長，在體內(nèi)殘留的RNA片段逐漸排盡后，核酸檢測結(jié)果可轉(zhuǎn)為陰性。（5）SARSCoV-2的核酸檢測結(jié)果只是證明病毒RNA的存在與否，不能證明病毒活性以及病毒是否具有傳播性。要證明核酸檢測再次陽性的患者是否會再次成為傳染源，要對其臨床樣本進(jìn)行病毒培養(yǎng)，培養(yǎng)出“活的”病毒才能證明其具有傳染性。

9 總結(jié)

綜上所述，SARS-CoV-2核酸檢測假陰性、復(fù)檢陽性等與臨床表現(xiàn)不符的情況無法完全避免，在實際篩查和檢測中，建議聯(lián)合臨床癥狀、影像學(xué)檢查（CT）及實驗室檢測（核酸檢測+病毒特異性抗體檢測）結(jié)果進(jìn)行綜合診斷，以防漏診、誤診。如發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果與臨床表現(xiàn)明顯不符，建議對整個檢測環(huán)節(jié)（樣本的采集、流轉(zhuǎn)及處理等環(huán)節(jié)）進(jìn)行綜合分析，以排除SARS-CoV-2病毒早期感染、復(fù)發(fā)感染或合并其他呼吸道病毒感染等可能。如條件允許，建議采集痰液或肺泡灌洗液等敏感性更高的樣本進(jìn)行復(fù)檢。