泄瀉中醫(yī)證候動物模型研究進展

王楷,侯雨君,宋瑋,陳穎,蔣慧靈,譚玉,周思遠*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院/第三附屬醫(yī)院,成都 610075;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,成都 610075)

泄瀉是排便頻率增加,大便稀溏或排出未消化食物,甚至瀉出水樣便為主癥的病證[1]。泄瀉的病機主要在于脾胃受損,運化失常,清濁不分,而成泄瀉。西醫(yī)病名如急慢性腸炎,腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea-predominant IBS,IBS-D),吸收不良綜合征等皆可按泄瀉辯證治療。

辨證論治是中醫(yī)治病的基本準(zhǔn)則,中醫(yī)證候動物模型的構(gòu)建對中醫(yī)研究的發(fā)展具有十分重要的意義。目前中醫(yī)泄瀉證候模型的制備尚無公認的標(biāo)準(zhǔn)。大多數(shù)研究從疾病的病因、病理方面切入進行造模。造模方法分為物理方法和化學(xué)方法,根據(jù)造模因素的數(shù)量又可分為單因素造模法和復(fù)合因素造模法[2]。根據(jù)現(xiàn)有的病理表現(xiàn)和診斷標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論,通過評估動物模型的癥狀表現(xiàn),腸道功能和病理變化以及方藥反證,判斷模型制備是否成功。本文通過歸納總結(jié)泄瀉動物模型的研究進展以及模型評價方法,以期為今后的模型研究提供參考。

1 模型建立

1.1 實證

1.1.1 腸道濕熱證泄瀉模型

腸道濕熱瀉是指感受濕熱疫毒或飲食不潔等原因,出現(xiàn)如腹痛瀉下,大便不爽,黏膩臭穢,肛門灼熱,口渴喜飲、小便黃,苔黃膩,脈滑數(shù)等。閻翔等[3]通過高糖高脂飲食以及高溫高濕環(huán)境分別模擬中醫(yī)“內(nèi)濕”、“外濕”形成過程造模。李文龍等[4]在前人基礎(chǔ)上,通過改進模型,第一階段以高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠,第二階段將大鼠置于高溫高濕造模箱,同時以白酒灌服;第三階段采用大腸桿菌灌胃;以大鼠毛發(fā)蓬松、蜷縮懶動以及食欲不振、飲水量和尿量減少,肛門紅腫充血或肛門擴張以及腹瀉指數(shù)升高、腸道病理判斷是否造模成功。該模型通過“外濕+內(nèi)濕+疫毒”模擬濕熱泄瀉證的病程,較前期單純“內(nèi)濕”“外濕”造模方法增加了產(chǎn)毒大腸桿菌,更加符合中醫(yī)濕熱泄瀉形成機理,因此在研究中應(yīng)用較廣[5-6]。王濤[7]將前述第三階段造模方法中的大腸桿菌替換為番瀉葉進行造模,并將兩種造模方式進行對比,發(fā)現(xiàn)兩種方法均能建立大鼠腸道濕熱證泄瀉模型,其中大腸桿菌所造的大鼠模型表現(xiàn)出嚴重的炎癥反應(yīng)和腸道粘膜損傷;而番瀉葉所造的模型則腹瀉癥狀更突出。

1.1.2 寒濕困脾證泄瀉模型

寒濕困脾瀉是指因外感風(fēng)寒或寒濕中阻,出現(xiàn)泄瀉清稀,或如水樣,腹痛,脘腹脹悶,舌苔白膩,脈浮等癥狀。薛曉倩等[8]采用改進的環(huán)境加疲勞法進行造模,在保持室溫在(28±2)℃條件下,將大鼠置于水深約25 cm、水溫(26±1)℃的水池中,游泳15 min后用取出立即吹干,并用冰水灌胃,然后將動物飼養(yǎng)在灌有4 mm水深的籠子中。持續(xù)6 d后將大鼠移到正常環(huán)境中飼養(yǎng)。李晟等[9]采用兩階段造寒濕困脾模型,第1～7天使用大黃灌胃、游泳、低溫高濕環(huán)境造模,第8～9天用大腸桿菌灌胃,使用加味厚樸溫中湯治療有效。

1.1.3 食滯胃腸證泄瀉模型

食滯胃腸證泄瀉是指攝入過多高蛋白、高熱量的食物而導(dǎo)致機體不能正常消化,出現(xiàn)瀉下臭穢如敗卵、或伴有不消化食物,不思飲食,噯腐吞酸,舌苔腐膩,脈滑。造模方法主要采用過食肥甘法造模法,常使用甘蘭、豬脂、牛乳、面粉等材料制作飼料。根據(jù)“飲食自倍,脾胃乃傷”中醫(yī)理論,孫理想等[10]、麥楚填等[11]自制高脂高蛋白飼料喂養(yǎng)大鼠,通過觀察造模后大鼠的精神狀態(tài)、進食量、體重、大便性狀驗證模型。唐小玲等[12]選用大劑量熟地制作模型,并用具有消食導(dǎo)滯作用的保和丸來作反證驗證模型。熟地造模后的大鼠出現(xiàn)食量減少,大便稀溏,抗疲勞和耐寒能力降低,經(jīng)保和丸治療后可以抑制產(chǎn)生稀大便。在動物研究中,因為高能量食物造模法較為簡便,比較契合中醫(yī)食滯胃腸病機的形成原理,因此普遍采用該法模擬臨床食積證的形成。

1.2 虛實夾雜證

肝郁脾虛證泄瀉的主要癥狀為情緒緊張或沮喪和激怒時,即出現(xiàn)腹痛泄瀉,瀉后痛減,脅肋脹痛,噯氣食少,舌淡,脈弦。該證是泄瀉中最常見的證型,其特點為瀉前或瀉時必有腹痛、瀉后痛減。對于該證型的動物模型研究較多,在模型建立時既要考慮肝郁的“因”,同時又要建立脾虛的“果”。該模型的建立主要分為單因素、復(fù)合因素刺激造模。單因素造模法包括單獨使用慢性束縛法[13]、夾尾刺激法、母嬰分離[14]等方法造模;復(fù)合因素造模法如番瀉葉聯(lián)合束縛法[15]、夾尾刺激聯(lián)合大黃灌胃[16-17]、CUMS聯(lián)合番瀉葉溶液灌胃[18]等;張慶業(yè)等[19]采用母嬰分離+束縛刺激+醋酸灌腸三種因素聯(lián)合造模,通過觀察體重變化、直腸高敏、糞便Bristol評分和含水量等指標(biāo)驗證模型是否成功。趙榮華等[20]采用慢性束縛+過度疲勞+飲食失節(jié)方法建立模型。王一程等[21]采用母嬰分離聯(lián)合冰水、束縛、夾尾四種方法造模。以多因素綜合刺激作為應(yīng)激原,符合慢性病程的形成過程。國內(nèi)外眾多學(xué)者從肝郁脾虛泄瀉臨床癥狀特點出發(fā)建立了多種模型,取得了一定的成果,但研究中還存在模型的建立與中醫(yī)發(fā)病機理不完全符合、評價指標(biāo)未能量化表示等問題。泄瀉肝氣乘脾證的發(fā)生大多是建立在慢性心理、生物和物理等綜合因素中刺激人體應(yīng)激性的基礎(chǔ)上演變而來的,故多因素復(fù)合造模方法往往可取得更接近臨床癥狀的形成過程。

1.3 虛證

1.3.1 脾氣虧虛證泄瀉模型

脾虛泄瀉是指因脾氣虧虛出現(xiàn)食少納呆、體倦乏力、大便稀溏等表現(xiàn)。脾虛泄瀉的動物模型主要造模方法可分為瀉下法、飲食失節(jié)法、飲食偏嗜法、綜合法。常用的瀉下藥物有番瀉葉溶液、大黃溶液等;飲食偏嗜法如采用食醋[22]、白酒[23]灌胃法?？甸萚24]采用特制的方形水槽中放置小平臺,平臺周邊水深約1.5 cm,大鼠在平臺上可自由活動,大鼠進入睡眠就會因為肌肉舒張、松弛而落入水中,同時予以高脂飲食建立脾虛泄瀉模型。趙榮華等[20]采用過度疲勞聯(lián)合飲食失節(jié)復(fù)制脾虛證泄瀉模型,觀察大鼠的糞便性狀、排便次數(shù)以及是否出現(xiàn)倦怠、毛發(fā)稀疏等一般情況判斷模型效應(yīng)。

1.3.2 脾腎陽虛證泄瀉模型

脾腎陽虛證泄瀉的主要由于久瀉不止,由脾及腎,或年老元陽虛衰,黎明前腹痛,腹瀉,瀉下清稀,甚至完谷不化,小腹及四肢冷痛,腰膝酸軟,舌淡苔白,脈沉細。脾腎陽虛泄瀉多采用復(fù)合因素造模法,如大黃[25-26]或番瀉葉溶液灌胃聯(lián)合肌注氫化可的松法[27],番瀉葉聯(lián)合腺嘌呤灌胃造模法[28],丙基硫氧嘧啶+游泳+飲食不節(jié)+番瀉葉灌胃法[29]。侯理偉[30]采用高濃度番瀉葉溶液(1 g/mL)以10 mL/kg劑量灌胃2周聯(lián)合避水應(yīng)激10 d建立脾腎陽虛IBS-D大鼠模型;劉敏等[31]在此基礎(chǔ)上,采用母子分離聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激、番瀉葉灌胃法制作模型,使用四神丸治療有效。朱佳杰[32]對比高、中、低3種濃度的番瀉葉溶液造模,發(fā)現(xiàn)高濃度番瀉葉(1.0 g/L,10 mL/kg)灌胃4周可復(fù)制脾腎陽虛型泄瀉大鼠模型;另外作者還對比了母嬰分離、避水應(yīng)激、直腸擴張三種方法分別聯(lián)合番瀉葉灌胃造模,以體重下降、D-木糖排泄率評判脾虛證,并且以機體自主活動能力以及肛溫作為腎陽虛評價方法,發(fā)現(xiàn)3種造模方式均能建立脾腎陽虛證泄瀉模型;其中母嬰分離或避水應(yīng)激聯(lián)合番瀉葉溶液能增加大鼠內(nèi)臟敏感性,而直腸擴張分別聯(lián)合番瀉葉溶液未能誘導(dǎo)大鼠內(nèi)臟高敏。

2 模型評價

泄瀉動物模型的評價方法主要可分為動物表征、行為學(xué)測試法、微觀指標(biāo)檢測法、方藥反證法等。

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2.1 腸道濕熱證

腸道濕熱證的動物模型表征為毛發(fā)蓬松、蜷縮懶動以及食欲不振、飲水量和尿量減少、體重下降,肛門紅腫充血或肛門擴張,腹瀉,糞便黃而惡臭,有部分出現(xiàn)黏液膿血便;并且肛溫升高[33]。在現(xiàn)有的研究中,腸道濕熱證泄瀉檢測指標(biāo)顯示腹瀉指數(shù)升高[4];5-羥色胺(5-HT)含量升高[34];病理顯示小腸絨毛脫落顯著,絨毛上皮細明顯腫脹,部分壞死或脫落,黏膜下層有輕微充血、嚴重水腫、輕度炎癥[35];腸組織肥大細胞數(shù)目增多等[34]。可用于反證腸道濕熱證的方藥主要有九香止瀉片[34,36]、葛根芩連湯[6]、秦香止瀉方[35]、郁金散[5]等。

2.2 寒濕困脾證

寒濕困脾證泄瀉的動物模型主要表現(xiàn)為倦怠、自主活動減少、便溏、肛周污穢,毛色枯黃、拱毛、脫毛、食量及飲水減少、體重下降或增長緩慢;指標(biāo)檢測顯示腸粘膜AQP4[8]、回腸粘膜ZO-1[37]、小腸P物質(zhì)及IL-2的表達均降低[9];可用于該證的方藥包括藿香正氣液[8,37]、加味厚樸溫中湯[9]等。

2.3 食滯胃腸證

食滯胃腸證泄瀉的動物模型的表征為大便次數(shù)增多,大便臭穢、溏薄、不成形,食量減少,體重增長緩慢;檢測腸道NF-kBp65蛋白表達表達下降[38];在方藥反證模型時,通常采用保和丸[12,39]。

2.4 肝郁脾虛證

肝郁脾虛證動物模型的一般表現(xiàn)為體重減輕、毛發(fā)枯黃、腹瀉、活動減弱、反應(yīng)遲鈍、情緒由開始的易怒煩躁轉(zhuǎn)為低落[40];鼠糞便Bristol分型積分、糞便含水量、腹瀉指數(shù)、直腸敏感性測試、稀便率均升高[19,41];腹壁撤退反射(AWR)[21]增高,行為學(xué)實驗包括曠場實驗、糖水偏嗜實驗、高架十字迷宮[42]相關(guān)數(shù)值下降均提示大鼠肝郁模型的建立。在微觀指標(biāo)檢測方面,肝郁脾虛證泄瀉表現(xiàn)為IL-2上升,IL-10[41]、白細胞計數(shù)、胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)[43]、皮質(zhì)和下丘腦中SE、RT的含量[15]則表現(xiàn)為下降。該證型可以使用經(jīng)典的中藥方劑痛瀉要方、柴胡四君子湯進行方藥反證。

2.5 脾氣虧虛證

脾氣虧虛證模型的表現(xiàn)為體重增長緩慢,體溫降低,食物攝取量和水的消耗量減少,毛變稀疏,缺乏光澤,倦怠,喜扎堆,反應(yīng)遲鈍,大便稀溏[44];游泳測試[45]和大鼠抓力[46]均下降;實驗室微觀檢測顯示:肝細胞磷/氧比值、呼吸控制率、肝糖原含量、血漿皮質(zhì)酮含量、紅細胞總數(shù)、血紅蛋白總數(shù),肝、脾重量[45]、血乳酸值、淀粉酶活性、D-木糖排泄率[47]均表現(xiàn)為下降,肝線粒體嵴大部分或全部消失[45]。此證型可通過經(jīng)典的四君子湯進行方藥佐證。

2.6 脾腎陽虛證

脾腎陽虛證模型建立的表現(xiàn)為體重下降、進食量和飲水量下降、嗜臥懶動、行動遲緩、爪甲色淡、尾巴變涼、弓背倦怠、喜扎堆、大便清稀,肛溫下降[32];握力試驗和負重游泳實驗[32]均下降;腹瀉指數(shù)[26]升高;胸腺臟器指數(shù)降低,脾、腎、睪丸的臟器指數(shù)升高[26];IL-β升高[27];D-木糖、血清ACTH、血清Cortisone[32]、尿-17羥、IL-1β/IL-4比值[27]均降低;此證型可以使用溫補脾腎的四神丸進行方藥反證。

3 小結(jié)

3.1 存在的問題

3.1.1 造模方法混亂

泄瀉中醫(yī)證型較多,各種證型的模型建立方法不統(tǒng)一。各種證型的模型建立主要存在造模時給藥劑量不精確,復(fù)合造模方法種類繁多、選擇隨機、重復(fù)性差,西藥副作用造成動物損傷較大、混雜因素不確定等問題。例如,在番瀉葉灌胃聯(lián)合CUMS建立肝郁脾虛證泄瀉模型的研究中,番瀉葉濃度從0.25～1 g/mL[17,32],以及CUMS的選擇范圍較廣,無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。飲食不節(jié)法既是食滯胃腸泄瀉的造模方法,又是脾虛泄瀉的造模方法之一,兩者無明確的模型鑒定標(biāo)準(zhǔn)。再如,慢性應(yīng)激聯(lián)合番瀉葉灌胃是肝郁脾虛泄瀉的常用造模方法,而有的研究者使用該法建立脾腎陽虛模型[31]。

3.1.2 復(fù)合因素選擇隨機

應(yīng)用復(fù)合因素造?？梢蕴岣吣Ｐ统晒β省⒃黾幽Ｐ头€(wěn)定性,更加符合疾病形成過程。然而各個研究所選擇的造模因素多變,缺乏各種造模因素之間的對比研究,導(dǎo)致后續(xù)的研究者難以明確造模因素的選擇。

3.1.3 模型評價主觀性太強

在建立的動物模型中,大多數(shù)研究在判斷模型是否成功時簡單以動物表現(xiàn)出來的癥狀為依據(jù),中醫(yī)舌脈辯證在動物模型中仍難以實現(xiàn)。例如,在脾虛證和脾腎陽虛證中,動物模型均表現(xiàn)出泄瀉、體重下降、嗜臥懶動的表現(xiàn);食滯胃腸證和脾虛證均出現(xiàn)倦怠、稀便,毛色枯黃、拱毛、脫毛,食量及飲水減少、體重下降或增長緩慢的表現(xiàn)。這樣導(dǎo)致建立的模型認可度不高,并且各個實驗間缺乏可比性,這將不利于中醫(yī)藥研究的發(fā)展。

3.2 泄瀉模型的改進建議

針對以上問題,一方面,應(yīng)開展更多的模型對比分析研究,確定最佳的造模方法,包括造模因素、藥物劑量、時間周期等的選擇,推薦使用病與證相結(jié)合的模型構(gòu)建方式,例如肝郁脾虛證泄瀉常對應(yīng)西醫(yī)的腸易激綜合征,可采用國際上最常用的母嬰分離法構(gòu)建模型,從母鼠產(chǎn)后第3天開始,總共分離12 d,每次持續(xù)3 h[48]。另一方面,應(yīng)明確各種中醫(yī)證型之間的區(qū)分鑒定方法,探索更客觀的模型評判指標(biāo),推廣方藥反證法的應(yīng)用。通過對前期模型的改進,以期建立更加標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一、簡便高效、科學(xué)穩(wěn)定的泄瀉中醫(yī)癥候模型,推動疾病的研究以及中醫(yī)藥的發(fā)展。